Антифунгальная активность субстанции "бензилбензоат медицинский" in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.5-002.828:628.355.2

антифунгальная

активность субстанции «бензилбензоат

медицинский» in vitro

'Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой), 'Выборнова И.В. (н.с.), 2Богданова Т.В. (ассистент кафедры), 'Богомолова Т.С. (зав. лаб.)*, 2Рауш Е.Р. (ассистент кафедры), 'Мамошин А.Н. (лаборант-исследователь), 'Чилина Г.А. (зав. лаб.), 3Гуранда Д.ф. (начальник лаб.), 3Гуранда Л.Д. (эксперт i категории), 3Пихтарь А.В. (инженер по качеству) Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1 НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; 2 кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург; 3 ООО «Фарм ИннТех», Московская область, Одинцово, Россия

© Коллектив авторов, 2015

Методом серийных разведений в жидкой среде Сабуро определена активность субстанции «бензилбензоат медицинский» в отношении возбудителей микозов кожи и ее придатков. Установлена высокая фунгистатическая и фунгицидная активности бензилбен-зоата в отношении дерматомицетов Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, Microsporum canis. Бензилбензоат проявил также анти-фунгальную активность в отношении Malassezia spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis.

Ключевые слова: дерматомицеты, минимальная подавляющая концентрация, минимальная фунгицидная концентрация, серийные разведения

in vitro antifungal activity of

benzilbenzoate medical

'Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the chair), 'Vybornova i.V. (scientific collaborator), 2Bogdanova T.V. (assistant of the chair), 'Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 2Raush E.R. (assistant of the chair), 'Mamoshin A.N. (laboratory assistant), 'Chilina G.A. (head of the laboratory), 3Guranda D.T. (head of the laboratory), 3Guranda L.D. (expert category i), 3Pikhtar A.V. (quality engineer)

North-Western State Medical University named after I.I. Metchnikov: 1Kashkin Research Institute of Medical Mycology; 2Department of Medical Microbiology, St. Petersburg; 3«Pharm InnTech» Ltd., Moscow region, Odincovo, Russia

© Collective of authors, 2015

Benzilbenzoate medical activity against etiologkal agents of skin, hair and nails mycoses was determined by serial dilutions method in Sabouraud broth. High fungistatic and fungicidal activities of benzyl benzoate against dermatomycetes Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, Microsporum canis was established. Benzil benzoate showed antifungal activity also against Malassezia spp., Fusarium spp., Scopulariopsis brevicaulis.

Key words: dermatomycetes, minimal inhibitory concentration, minimal fungicidal concentration, serial dilutions

Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, Тел.: (812) 303-51-40

ВВЕДЕНИЕ

Бензилбензоат (фенилметиловый эфир бензойной кислоты, С14Н12О2) - вещество с доказанными антипаразитарными свойствами. Практически нерастворим в воде. Лекарственные формы (крем и эмульсия бензил-бензоата 20%) применяют для лечения чесотки и педикулеза. Возможность использования бензилбензоата в терапии микозов кожи и ее придатков не изучена, сведения об активности этого соединения в отношении патогенных и условно-патогенных микроскопических грибов отсутствуют.

Микозы кожи, волос и ногтей - очень распространенные заболевания. По данным Всемирного фонда по борьбе с грибковыми инфекциями (GAFFI, Global Action Fund for Fungal Infections), 14,3% населения Земли страдает от микозов кожи и ее придатков. Так, микозами волосистой части головы болеют около 200 млн. детей [1]. Несмотря на имеющиеся противогрибковые средства, нередко терапия микозов кожи недостаточно эффективна и сопровождается рецидивами. В связи с этим поиск новых антимикотических препаратов для лечения микозов кожи, волос и ногтей представляется актуальным.

Цель исследования - определить in vitro активность субстанции «бензилбензоат медицинский» в отношении ряда микромицетов - возбудителей микозов кожи и ее придатков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемое вещество. Изучали субстанцию бензилбензоата медицинского концентрацией 99,8% (серия 50212, производства ДП «Завод Химических Реактивов» НТК «Институт Монокристаллов», Украина). Субстанция предоставлена ООО «Фарм ИннТех».

Штаммы грибов. В качестве тест-культур использовали следующие штаммы микромицетов из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ):

T. mentagrophytes - 5 штаммов (F 1394, F 1404, F 1425, F 1426, F 1457);

T. rubrum - 5 штаммов (F 1157, F 1209, F 1220, F 1231, F 1301);

M. canis - 5 штаммов (F 1156, F 1302, F 1392/1028, F 1395/329, F 1403);

Fusarium oxysporum - 2 штамма (F 1390/671, F 1504/70590);

F. proliferatum - 1 штамм (F 1503/58436);

Fusarium sp. - 2 штамма (F 1436/459, F 1449);

S. brevicaulis - 5 штаммов (F 165/ВКМ-406, F 166/ ВКМ-407, F 1167, F 1297/450, F 1412).

Использовали также 10 штаммов Malassezia sp., выделенных с кожи дерматологических пациентов (№№ 115/12, 05/13, 133/12, 135/12, 14/13, 16/13, 20/13, 146/12, 21/13, 22/13).

Питательные среды. Агаризованную среду Сабу-ро применяли для выращивания культур дерматоми-цетов и плесневых грибов. Состав среды: вода дистиллированная - 1 л, пептон - 10 г, глюкоза - 40 г, агар-агар микробиологический - 18 г, рН - 6,8.

Жидкую среду Сабуро использовали для определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) бензилбензоата для дерматомицетов и плесневых грибов. Состав среды: вода дистиллированная -1 л, пептон - 10 г, глюкоза - 40 г, рН - 6,8.

Для выращивания культур Malassezia sp. применя-

■

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, 2015, Т.17, №3

ли модифицированную агаризованную среду Лимин-га-Нотман; для определения активности бензилбензо-ата в отношении этих липофильных дрожжей - модифицированную жидкую среду Лиминга-Нотман [2].

Состав среды «модифицированный агар Лиминга-Нотман»: пептон - 10 г, глюкоза - 10 г, дрожжевой экстракт - 2 г, сухая бычья желчь - 8 г, глицерин - 10 мл, глицерина моностеарат - 0,5 г, Твин 60 - 5 мл, оливковое масло - 20 мл, агар-агар микробиологический -15 г, вода дистиллированная - до 1 литра, рН - 6,0.

Состав жидкой среды Лиминга-Нотман: пептон -10 г, глюкоза - 10 г, дрожжевой экстракт - 2 г, сухая бычья желчь - 8 г, глицерин - 10 мл, глицерина моно-стеарат - 0,5 г, Твин 60 - 5 мл, оливковое масло - 20 мл, вода дистиллированная - до 1 литра, рН - 6,0.

Определение фунгистатической активности бензилбензоата в отношении нитчатых грибов (дерматомицетов и плесневых грибов) выполняли методом серийных разведений в жидкой среде Сабуро [3, 4]. Готовили 20% раствор субстанции бензилбензоата в жидкой среде Сабуро, содержащий 5% диметил-сульфоксида. Выполняли последовательные двукратные разведения субстанции бензилбензоата, начиная с максимальной концентрации в среде 20% и до минимальной концентрации 0,00007%.

Для приготовления взвесей тест-культуры грибов выращивали в течение 2 недель при 28 °С на агаре Сабуро в пробирках, затем клеточную массу снимали с поверхности агара, постепенно добавляя 0,85% стерильный раствор натрия хлорида до густоты рабочих взвесей 1 ЕД по МакФарланду. Количество вносимой рабочей взвеси в каждую пробирку ряда составляло 0,1 мл.

В каждом исследовании ставили 3 контроля: 1) культуры (1 мл питательной среды + 0,1 мл рабочей взвеси тест-культуры); 2) питательной среды (1 мл питательной среды без культуры и без исследуемого Объекта №1); 3) контроль исследуемого вещества (0,5 мл питательной среды + 0,5 мл исходного раствора субстанции бензилбензоата).

Все ряды подготовленных разведений с тест-культурами грибов и контрольные пробирки выдерживали при 28 °С в течение 7-10 суток до появления роста гриба в первом контроле. МПК бензилбензоата считали концентрацию в последней пробирке ряда (максимальное разведение), в которой отсутствовал визуально определяемый рост микромицета.

Определение фунгицидного действия бензилбензоата в отношении нитчатых грибов (дермато-мицетов и плесневых грибов) проводили на основании высевов из каждой пробирки ряда разведений, в которой визуально отсутствовал рост тест-культуры. Высев выполняли микробиологической петлей, нанося штрихи на секторы агаризованной среды Сабуро в чашках Петри. Одновременно делали высев из пробирки с контролем культуры. Чашки с высевами инкубировали при 28 °С до появления роста колоний в контрольном секторе, после чего отмечали наличие или отсутствие роста гриба во всех засеянных секторах. Минимальной фунгицидной концентрацией (МФК) считали минимальную концентрацию (максимальное разведение) бензилбензоата в пробирке, высев из которой на плотную питательную среду был негативным (не давал роста грибов).

Определение фунгистатической активности бензилбензоата в отношении Malassezia 8рр. осуществляли методом серийных микроразведений. Использовали 96-ти луночные пластиковые планшеты с и-образными лунками. В каждую лунку планшета помещали 50 мкл рабочих концентраций бензилбензоата и 50 мкл взвеси клеток культуры в жидкой среде Ли-минга-Нотман [2].

Для приготовления взвесей тест-культуры Ма1а$$вг1а зрр. выращивали в течение 5 суток при оптимальной температуре 32 °С на агаре Лиминга-Нот-ман в пробирках, затем клеточную массу снимали с поверхности агара, постепенно добавляя стерильную дистиллированную воду, содержащую 0,04% Твин 80 до густоты исходных взвесей 1 ЕД по МакФарланду. Готовую взвесь клеток разводили жидкой средой Ли-минга-Нотман до концентрации 1,0-5,0-104 КОЕ/мл. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.

При каждом титровании ставили четыре контроля: 1) культуры (50 мкл питательной среды + 50 мкл взвеси тест-культуры); 2) питательной среды (100 мкл); 3) контроль исследуемого вещества (50 мкл питательной среды + 50 мкл исходного раствора бензилбензоата); 4) контроль роста культуры из рабочей взвеси на агари-зованной среде Лиминга-Нотман.

Все ряды подготовленных разведений с тест-культурами Ма1а$$вг1а зр. и контроли в планшетах выдерживали при 32 °С в течение 3-9 суток до появления роста гриба в контроле на агаризованной среде.

После окончания основного периода инкубации в каждую лунку планшета добавляли 50 мкл 0,01% рабочего раствора резазурина и возвращали планшет в термостат. Результаты учитывали визуально через 4 часа по изменению цвета индикатора. При появлении роста культуры цвет индикатора - резазурина визуально изменялся с голубого на розовый.

МПК исследуемого вещества определяли по минимальной концентрации (максимальному разведению) в последней лунке ряда, где визуально не изменялся цвет индикатора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные о полученных значениях МПК и МФК субстанции «бензилбензоат медицинский» в отношении испытанных культур дерматомицетов и плесневых грибов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Антифунгальная активность субстанции «бензилбензоат

медицинский» in vitro в отношении нитчатых грибов из РКПГ

№ п/п Вид и штамм микромицета МПК, % МФК, %

1 Trichophyton mentagrophytes F 1394 0,02 0,05

2 Trichophyton mentagrophytes F 1404 0,05 0,05

3 Trichophyton mentagrophytes F 1425 0,1 0,2

4 Trichophyton mentagrophytes F 1426 0,2 0,2

5 Trichophyton mentagrophytes F 1457 0,2 0,2

6 Trichophyton rubrum F 1157 0,0003 0,0003

7 Trichophyton rubrum F 1209 0,03 0,03

8 Trichophyton rubrum F 1220 0,3 0,65

9 Trichophyton rubrum F 1231 0,3 0,65

10 Trichophyton rubrum F 1301 0,15 0,65

11 Microsporum canis F 1156 0,004 0,01

12 Microsporum canis F 1302 0,004 0,004

13 Microsporum canis F 1392/1028 0,004 0,004

14 Microsporum canis F 1395/329 0,002 0,002

15 Microsporum canis F 1403 0,004 0,004

16 Fusarium oxysporum F 1390/671 2,5 5

17 Fusarium sp. F 1436/459 5 5

18 Fusarium sp. F 1449 5 10

19 Fusarium proliferatum F 1503/58436 5 10

20 Fusarium oxysporum F 1504/70590 5 5

21 Scopulariopsis brevicaulis F 165/ВКМ-406 5 >20

22 Scopulariopsis brevicaulis F 166/ВКМ-407 2,5 >20

23 Scopulariopsis brevicaulis F 1167 2,5 >20

24 Scopulariopsis brevicaulis F 1297/450 5 >20

25 Scopulariopsis brevicaulis F 1412 2,5 20

Бензилбензоат проявил высокие фунгистатическую и фунгицидную активности in vitro в отношении всех изученных культур дерматомицетов. МПК находились в пределах от 0,002% до 0,004% - для штаммов M. canis; от 0,02% до 0,2% - для T. mentagrophytes; от 0,0003% до 0,3% - для T. rubrum. МФК составили 0,004%-0,01%; 0,05%-0,2% и 0,0003%-0,65% соответственно.

Выраженное антифунгальное действие бензилбензо-ата обнаружили также в отношении Fusarium spp., хотя значения МПК и МФК были более высокими, чем для дерматомицетов: 2,5%- 5% и 5%-10% соответственно.

В отношении другого плесневого гриба - частого возбудителя онихомикоза S. brevicaulis действие бен-зилбензоата было только фунгистатическим, МПК составили 2,5%-5%.

Результаты исследования активности бензилбензо-ата в отношении Malassezia spp. in vitro представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Фунгистатическая активность субстанции «бензилбензоат

медицинский» в отношении Malassezia spp. in vitro

№ п/п Тест-культуры (№ штамма/год выделения) МПК, %

1 Malassezia sp. 115/12 0,4

2 Malassezia sp. 05/13 0,2

3 Malassezia sp. 133/12 0,2

4 Malassezia sp.135/12 0,1

5 Malassezia sp. 14/13 0,1

6 Malassezia sp. 16/13 0,2

7 Malassezia sp. 20/13 >20

8 Malassezia sp. 146/12 0,1

9 Malassezia sp. 21/13 2,5

10 Malassezia sp. 22/13 1,25

Бензилбензоат проявил выраженную фунгистатическую активность в отношении 9 из 10 изученных штаммов Malassezia spp. МПК составили от 0,1% до 2,5%. Оценку фунгицидности бензилбензоата в отношении Malassezia spp. не выполняли, так как стандартные методы исследования для этих липофильных грибов в мире еще не разработаны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами впервые проведено исследование активности субстанции «бензилбензоат медицинский» in vitro в отношении микромицетов - возбудителей микозов кожи и ее придатков. Установлены высокие фунги-статическая и фунгицидная активности препарата в отношении наиболее частых возбудителей - дермато-мицетов M. canis, T. rubrum, T. mentagrophytes. В связи с этим представляется целесообразным продолжить изучение антифунгального действия бензилбензоата in vivo на экспериментальной модели дерматомикоза у лабораторных животных [5].

Выявлена выраженная фунгистатическая активность бензилбензоата в отношении большинства штаммов Malassezia spp., что может быть показателем перспективности использования этого медицинского препарата для лечения отрубевидного лишая и других кожных Malassezia-ассоциированных заболеваний.

В более высоких концентрациях (2,5%-10%) бен-зилбензоат оказывал антифунгальное действие на плесневые грибы Fusarium spp. и S. brevicaulis, которые могут вызывать поражения кожи и ногтей, трудно поддающиеся лечению обычными антимикотиками.

выводы

Субстанция «бензилбензоат медицинский» (99,8%) обладает высокой фунгицидной активностью in vitro в отношении дерматомицетов M. canis, T. rubrum, T. mentagrophytes.

Субстанция «бензилбензоат медицинский» (99,8%) обладает выраженной антифунгальной активностью in vitro в отношении Malassezia spp., Fusarium spp. и S. brevicaulis.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. www.GAFFI.org

2. Sugita T., Tajima M., Takashima M.,et al. A new yeast, Malassezia yamatoensis, isolated from a patient with seborrheic dermatitis, and its distribution in patients and healthy subjects// Microbiol. Immunol. - 2004. - Vol. 48, №8. - P. 579-83.

3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М: Гриф и К, 2012. - 944 с.

4. Богданова Т.В., Богомолова Т.С., Васильева Н.В. и др. Микологическое обследование объектов окружающей среды и определение противогрибковой активности различных веществ. Методические рекомендации №2. - СПб: СПб МАПО, 2008. - 16 с.

5. Васильева Н.В., Аравийский Р.А., Выборнова И.В. и др. Экспериментальное моделирование трихофитии на морских свинках в зависимости от вирулентности патогена-возбудителя// Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15, №1. - С. 34-39.

Поступила в редакцию журнала 16.09.2015

Рецензенты: Н.П. Елинов