CC BY
16УДК 577.121:616.992
АКТИВНОСТЬ
НЕКОТОРЫХ
МЕТАБОЛИТОВ
STACHYBOTRYS
SPP. В ОТНОШЕНИЕ
PARAMECIUM CAUDATUM
Доршакова Е.В. (н.с.) , Елинов Н.П. (проф. кафедры)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Доршакова Е.В., Елинов Н.П., 2012
Проблема продукции микотоксинов микроскопическими грибами по-прежнему остается актуальной и в настоящее время. Токсигенными свойствами обладают многие микромицеты-биодеструкторы, в частности Stachybotrys spp., способные вызвать заболевание - стахиботриотоксикоз. Микотоксины - продукты вторичного обмена микромицетов обладают различными химическим строением и путями воздействия на живые макроорганизмы.
Ключевые слова: микромицеты, микотоксины Stachybotrys spp., стахиботриотоксикоз
THE ACTIVITY OF SOME STACHYBOTRYS SPP METABOLITES TO PARAMECIUM CAUDATUM
Dorshakova E.V. (scientific collaborator), Yelinov N.P. (professor of the chair)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Dorshakova E.V., Yelinov N.P., 2012
The problem of mycotoxim production with microscopic fungi is always actual and today. Many micromycetes-biodestructors possess with toxigenic properties, for example Stachybotrys spp. able to stachybotryotoxicosis. Mycotoxins - products of secondary fungal metabolism possess variable chemical structure and ways of actions in living macroorganisms.
Key words: micromycetes, mycotoxines Stachybotrys spp., stachybotryotoxicosis
* Контактное лицо: Доршакова Евгения Владимировна Тел.: (812) 303-51-40
Продукты жизнедеятельности микромицетов нередко оказывают негативное воздействие на здоровье людей, долгое время пребывающих в помещениях, контаминированных микобиотой. 81аскуЬо1гун 8рр. продуцируют широкий спектр метаболитов, в частности, микотоксины трихотеценового ряда, оказывающие цитотоксический и нейротоксический эффекты на живые организмы [1-4]. Они же являются причиной развития стахиботриотоксикоза, характеризующегося поражением слизистых оболочек, кожи, желудочно-кишечного тракта. Изучение особенностей биосинтеза и воздействия метаболитов 51аскуЬо1гух ярр. на живые организмы по-прежнему актуальны.
Общие сведения о метаболитах микромицетов
Метаболиты микромицетов представлены различными группами химических соединений, синтезируемых в результате обменных процессов. Метаболиты могут быть первичными - продуктами матричного синтеза и вторичными - продуктами ферментативных реакций. Первичными метаболитами являются белки (преимущественно - ферменты), а вторичными - вещества иного химического строения, образующиеся, как правило, под каталитическим действием первичных метаболитов [5]. Спектр вторичных метаболитов крайне разнообразен, отличается у микромицетов различных таксонов (классов, порядков, родов, видов и штаммов). Качественный и количественный состав метаболитов изменяется в зависимости от условий окружающей среды: температуры, влажности, состава органических и минеральных веществ.
Метаболиты БЬаскуЪоЬгуз врр., их воздействие на организм человека
Среди первичных метаболитов 51аскуЬо1гух ярр. привлекают внимание гемолизины и протеиназы, обусловливающие появление геморрагий и кровоизлияний в легких у младенцев с последующим развитием гемосидероза [1,6]. Вторичными метаболитами 51аскуЬо1гух ярр. являются: трихотеценовые микотоксины (триходермин, триходермол, триховерри-ны), макроциклические трихотеценовые микотоксины (сатратоксины С и Н, роридины А и Е), спиро-циклические дриманы, доллабеллановые дитерпены и атраноны [1-3, 6]. 5. скаг1агит - наиболее распространенный вид рода 51аскуЬо1гух, подразделяемый по спектру метаболитов на хемотип Б и хемотип А. К первому относят микромицеты, продуцирующие макроциклические трихотецены, ингибирующие синтез белка и обладающие нейротоксическим и ци-тотоксическим действиями. К хемотипу А отнесены микромицеты, синтезирующие атраноны [7, 8].
Токсичное действие атранонов в настоящее время мало изучено, известно лишь их раздражающее действие на слизистую оболочку респираторного тракта [1]. Было установлено [9], что микромицеты 5. скаНагит хемотипа А составляют 60%, а хемоти-
па S - 40%. Микромицеты двух хемотипов имеют отличия в последовательности нуклеотидов в гене Tri 5, кодирующем триходиенсинтетазу, и в гене Chs 1, кодирующем хитинсинтетазу [7, 8]. Среди Stachybotrys spp., контаминирующих стены зданий, нередко встречается S. chlorochalonata, продуцирующий триходермин, триходермол, а также доллабел-лановые дитерпены и атраноны, как микромицеты S. chartarum хемотипа А [6].
Локализация метаболитов Stachybotrys spp. и пути их воздействия на организм человека
Известно, что трихотеценовые микотоксины синтезируются в конидиях, стеригмах, а также конидие-носцах Stachybotrys spp. Gregory L. С коллегами [10], используя иммуноцитохимические и иммуногисто-химические методы, определили места локализации сатратоксина G и стахилизина - на внутренней части оболочки спор, а также в мицелии микромицетов. Stachybotrys spp. оказывают токсичное действие на организм человека при соприкосновении с мицелием, вдыхании спор, а также при попадании в ЖКТ загрязненных им пищевых продуктов. Воздействию метаболитов Stachybotrys spp. чаще подвержены фермеры, работники предприятий по обработке волокон растительного происхождения, а также офисные работники и жители квартир, в которых имеются очаги биодеструкции [1, 6].
Stachybotrys spp. чаще обнаруживают в помещениях, на изделиях, содержащих целлюлозу, в частности - на гипсокартоне и обоях [3], также его можно обнаружить на штукатурке, материалах для изоляции труб, стекловолокне [11]. Выявить Stachybotrys spp. среди микобиоты, контаминирующей техногенные субстраты, не просто в связи с их низкой скоростью роста на питательных средах in vitro, по сравнению с другими микромицетами-биодеструкторами. Среди микромицетов, контаминирующих жилые и офисные помещения Санкт-Петербурга, S. chartarum был выявлен в 11 (8,47%) из 77 помещений, из них в 5 случаях - в очагах биоповреждений на штукатурке, в 4 - на обратной стороне обоев, в 2 - на гипсокартоне. Наибольшая концентрация S. chartarum в исследуемых образцах составляла 250000 КОЕ/г [12,13].
В связи с частой встречаемостью Stachybotrys spp. в природе, а также обнаружением в больших количествах в техногенных субстратах представляет интерес оценка воздействия его метаболитов в отношение живых организмов.
Активность некоторых метаболитов Stachybotrys spp. в отношение Paramecium caudatum
Нами оценено суммарное действие метаболитов Stachybotrys spp. на одноклеточный эукариотический организм - Р. caudatum. Были изучены метаболиты 12 штаммов S. chartarum и S. chlorochalonata (видовую идентификацию осуществляли культуральным и молекулярно-генетическим /ДНК-секвенирование/ методами), в зависимости от продолжительности их
роста и развития, в сравнимых условиях при стремлении выявить различия в степени воздействия на простейшие организмы метаболитов спор и культуральной жидкости микромицетов, выращенных на различных питательных средах, а также на техногенном субстрате (гипсокартон).
В качестве объектов исследования были взяты 11 штаммов 5. сЬаНагит и 1 штамм 5. сЫогосЬа1опа1а, выделенные из отделочных материалов в жилых и офисных помещениях Санкт-Петербурга. Материалы исследования: фильтраты культуральных жидкостей 81асМуЬо1гу5 8[>р., выращенных на картофельном отваре с добавлением 2% глюкозы; споры микромицетов, выращенных на солодовом и картофель-но-глюкозном агаре, взятые через 11, 21 и 56 суток, а также споры ’Я1аскуЬо1гу^ хрр., взятые с образцов гипсокартона.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На первоначальном этапе в лабораторных условиях проводили посев штаммов, выделенных из строительных материалов, на солодовый агар с последующим выдерживанием в термостате при 28 °С в течение 7 суток. Затем готовили суспензию спор, подсчитывали конидии в камере Горяева. Конидии (2,6-106±0,2-106 в 1 мл) объемом 500 мкл вносили в картофельный отвар с 2% глюкозой, на картофель-но-глюкозный агар, на солодовый агар и образцы гипсокартона, предварительно смоченные дистиллированной водой. Затем питательные среды с засеянными штаммами микромицетов помещали в термостат при 28 °С на сроки от 11 до 56 дней, а образцы гипсокартона были положены в эксикаторы, один из которых был также помещен в термостат для экспозиции при 28 °С, другой - в лабораторный шкаф для выращивания штаммов 81аскуЬо1гу5 хрр. при комнатной температуре (22-23 °С). Отбор культуральной жидкости, а также смывы спор с питательных сред и гипсокартона проводили в каждый из временных периодов (11, 21, 56) в трех повторностях. Культуральную жидкость фильтровали через бумажные фильтры (с1 = 2 мкм). Суспензии спор разводили дистиллированной водой до концентрации 2,4-106±0,2-106 в
1 мл. Фильтраты культуральной жидкости и суспензии спор вносили в равных количествах в пробирки с Р. саиёаШт. Фильтраты и Р. саиёаШт титровали методом серийных разведений 1:8. В ходе эксперимента фиксировали время внесения культуральной жидкости/суспензии спор, наблюдая за состоянием тест-объекта в световой микроскоп и отмечая время гибели всех особей (при продолжительности эксперимента до 4 часов).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Фильтраты культуральных жидкостей 11 штаммов 5. сЬаНагит (возрастом 11 и 21 день) во всех разведениях вызвали гибель тест-объекта. Наименьшее
время, за которое погибли P. caudatum, отмечали в пробах, взятых на 21 день роста микромицетов, и находилось в пределах 0,5-2 минут при равном соотношении фильтратов и среды с простейшими (1:1), а также в интервале 4-10 минут - при их соотношении 1:8. Время гибели всех особей тест-объекта, находящегося под воздействием образцов 11-дневных культур, составлял 0,5-2 минуты (1:1) и 7-69 минут (1:8). Штамм S. chlorochalonata на 11 день роста не оказал токсичного воздействия на парамеций, а на 21 день показал наименьшие токсичные свойства. Гибель парамеций при воздействии фильтратов культуральных жидкостей возрастом 56 дней, в отсутствии разведения, наступала в течение 3-9 минут, при разведении 1:8 активность метаболитов выявляли лишь у трех штаммов в течение 78, 86 и 90 минут.
Споры всех микромицетов Stachybotrys spp., выращенных на питательных средах, а также гипсо-картоне, вызвали гибель P. caudatum. Споры штаммов, выращенных на питательных средах в течение 11 и 21 дня, оказали токсичное действие на простейших быстрее (2-10 минут), чем споры штаммов, выращенных на гипсокартоне в течение 21 дня (4-
11 минут). Штаммы Stachybotrys spp., выращенные на гипсокартоне при комнатной температуре и при 28 °С, проявляли токсичное действие в отношение простейших в одном временном интервале. Воздействие спор микромицетов, выращенных на солодовом и картофельном агарах, в каждый из временных периодов, на парамеций также отличалось незначительно, за исключением одного из штаммов, рост и спороношение которого были слабее, чем у других штаммов. Обнаружили снижение токсичного действия конидий Stachybotrys spp. к 56 дню роста на обеих питательных средах, когда гибель P. caudatum наступала в интервале (4-84 и 4-79 минут). Обращает на себя внимание значительно более низкая активность метаболитов спор S. chlorochalonata, выращенного на питательных средах в течение 56 дней (84 и 79 минут), по сравнению с таковой штаммов S. chart arum.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Установлено, что наибольшей активностью в отношение Р. ссиикпит обладают фильтраты культуральной жидкости 81асМуЬо1гу5 хрр., взятые на 21 сутки роста микромицетов. К 56-м суткам наблюдали исчезновение токсичных свойств у большинства штаммов 5. сЬаНагит и 5. сЫогосЬа1опа1а. Возможным является синтез микромицетами веществ, способствующих распаду токсичных соединений, по достижении ими предельной концентрации. Штаммы, не утратившие токсичности к этому времени могут обладать более медленным метаболизмом и, следовательно, максимальные значения активности их метаболитов можно будет пронаблюдать и в более поздние сроки, чем у других микромицетов. Также следует учитывать, что спектр метаболитов, синтезируемых различными штаммами, может отличаться и, в связи с различием в структуре, их распада с течением времени в культуральной жидкости может не происходить (или происходить в разное время). Сохранение токсичных свойств культуральных жидкостей может быть связано с иной химической структурой вещества, более медленной скоростью его синтеза.
Активность спор в отношение тест-объекта была выражена слабее, чем культуральной жидкости. Действие метаболитов спор микромицетов, выращенных на питательных средах, было выражено сильнее, чем у микромицетов, выращенных на образцах техногенного субстрата.
ВЫВОДЫ
1. Наибольшее влияние суммарных метаболитов 81аскуЬо1гу5 хрр. в отношение Р. ссиикпит было выявлено при исследовании фильтратов культуральной жидкости микромицетов, выращенных в течение 21 дня.
2. Токсичный эффект взвеси спор и культуральной жидкости 5. сТшНагит выражен сильнее, чем 5. сЫогосЬа1опа1а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pestka JJ, Yike I., Dearborn D.G., et al. Stachybotrys chartarum, Trichothecene Mycotoxins and Damp Building -Relatedillness: New Insights into a Public Health Enigma // Toxicological sciences. - 2008. - Vol. 104. - P. 4-26.
2. Cameron D.G. Toxicity prifile of Stachybotrys chartarum IIA Thesis In Environmental toxicology/ Submitted to the Graduate Faculty of Texas Tech University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of science.-2009.
3. Доршакова, E.B. Морфолого-физиологические особенности токсинообразующих грибов - биодеструкторов из рода Stachybotrys II Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №3. - С. 13-21.
4. Беляков Н.А., Щербо А.П., Блинов Н.П., Васильева Н.В. и др. Вклад микробиоты в процессы старения больничных зданий и ее потенциальная опасность для здоровья больных // Проблемы медицинской микологии. - 2005. - Т. 7, №4. - С. 3-12.
5. Блинов Н.П. Токсигенные грибы в патологии человека // Проблемы медицинской микологии. - 2002. - Т. 4, №4. - С. 3-7.
6. Scott A.M. Stachybotrys chartarum (or S. atra or S. alternans): Review of Toxicological Literature. Integrated Laboratory Systems, Inc. Research Triangle Park, North Carolina. - 2004.
7. Andersen B., Nielsen К.Б. and Jarvis B.B. Characterization of Stachybotrys from water-damaged buildings based on morphology, growth, and metabolite production // Mycologia. - 2002. - Vol. 94. - P. 392-403.
8. Andersen B., Nielsen К.Б. and Thrane U. Molecular and phenotypic decriptions of Stachybotrys chlorohalonata sp. nov. and two chemotypes of Stachybotrys chartarum found in water-damaged buildings // Mycologia. -2003. - Vol. 95. - P. 1227-1238.
9. Jarvis В.В. Stachybotrys chartarum: A fungus for our time// Phytochemistry. - 2003. - Vol. 64. - P. 53-60.
10. Gregory L., Pestka J.J., Dearborn D.G. and Rand T.G. Localization of satratoxin-G in Stachybotrys chartarum spores and spore-impacted mouse lung using immunocytochemistry // Toxicol Pathol. - 2004. - Vol. 32. - P. 26-34.
11. Hossain M.A., Ahmed M.S. and Ghannoum M.A. Attributes of Stachybotrys chartarum and its association with human disease // J. Allergy Clin Immunol. - 2004. - Vol. 113. - P.200-208.
12. Павлова И.Э., Богомолова T.C., Чилина Б.А., Васильева Н.В., Маметьева А.А. Микобиота жилых и офисных помещений в Санкт-Петербурге и Ленинградской области// Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т.14, №2. - С.118.
13. Доршакова Е.В. Микромицеты в естественной среде обитания и в помещениях - их потенциальная опасность для здоровья людей// Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т.14, №3. - С.53-57.
Поступила в редакцию журнала 13.12.2012
Рецензент: ИЛ. Босак
