CC BY
14УДК 667.613.75:577.152.321
изучение роста
stachybotrys spp на различных образцах растительных
материалов
доршакова Е.В.* (н.с.), Елинов н.П. (проф. кафедры), мамошин А.н. (лаборант-исследователь)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2014
Контаминация зданий микромицетами происходит, несмотря на развитие технологий строительства и производства используемых в нем материалов [1]. Умеренный климат и повышенная влажность в Санкт-Петербурге благоприятствуют росту биомассы микромицетов в почве и на растительных субстратах. В целях уменьшения распространения микромицетов-биодеструкторов в стенах зданий важно изучить особенности их роста на природных субстратах, выявить наиболее предпочтительные из них.
Ключевые слова: микромицеты-биодеструкторы, природные субстраты, целлюлазы
study of stachybotrys spp. growth on
different samples of plant materials
Dorshakova E.v. (scientific collaborator), Elinov N.P. (professor of the chair), Mamoshin A.N. (laboratory assistant)
North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Chair of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2014
Buildings contamination by fungi happens despite of construction technologies development and its materials production. Temperate climate and high humidity in St. Petersburg are beneficial for fungies growth in soil and plant materials. It is important to study fungies growth particularities in natural substrates to decline its spreading in
Key words: cellulase, fungi-biodestructors, natural materials
Контактное лицо: Доршакова Евгения Владимировна, тел.: (812) 303-51-40
Особенности Stachybotrys spp. как деревораз-рушающих грибов.
Stachybotrys зрр. - одни из наиболее опасных микромицетов-биодеструкторов, широко распространенных в природе и антропогенной среде. В естественной среде обитания они чаще встречаются на гниющих растительных остатках, в помещениях -на деревянных конструкциях [1-4]. Рост Stachybotrys зрр. на материалах, содержащих целлюлозу, обусловлен их высокой целлюлозолитической активностью.
Древесина - старейший по времени использования строительный материал. Наиболее часто его применяют при внутренних отделочных работах жилых и производственных помещений, опорных кольев и свай, заглубленных (забитых или в форме лежней-плотов) в грунт. Известно, что деревянные колья, сваи являются основаниями Московского кремля, кремлевских стен Новгорода и Пскова, Исаакиевско-го Собора в Санкт-Петербурге, а также культовых и общественных зданий древних городов Германии и Франции вдоль реки Рейн, причальных стен Лондона. Разрушение деревянных опорных конструкций сопровождается разрушением самого сооружения [Улицкий В.М. Биопоражения деревянных строительных конструкций и способы их усиления. - СПб., 1999]. По мнению ученых, во избежание разрушения микромицетами на протяжении сотен (тысяч) лет, древесина должна находиться ниже верхнего уровня грунтовых вод, в холодной среде, при низком содержании кислорода (анаэробиоз) и отсутствии питательных веществ для микроорганизмов [5].
Дереворазрушающие грибы вызывают разложение (декомпозицию) древесины, называемое гнилью. Эту деятельность грибов определяют особенности их физиологии: способность гиф прорастать внутрь древесины и, благодаря наличию целлюлозолитиче-ских ферментов, расщеплять основной её материал - целлюлозу. По данным В. Рипачек [8], Stachybotrys зрр. вызывают умеренную (мягкую) гниль, наряду с другими представителями сумчатых и несовершенных грибов: Chaetomium globosum, C. elatum, C. funi-colum, Trichoderma lignorum. Умеренная (плесневая, мягкая) гниль - деструктивный распад древесины, при котором разлагается только полисахаридная часть древесины. Характерной особенностью микромицетов, вызывающих «мягкую гниль», является способность развиваться в условиях постоянно высокой влажности древесины, при которой не могут расти другие дереворазрушающие грибы. Плесневой гнилью заражена древесина в градирнях и конструкциях, находящихся постоянно в воде (части плотин, деревянных судов), во влажной почве (телеграфные столбы, шпалы, парники).
Кора растений менее подвержена разрушению микромицетами благодаря наличию суберинизи-рованных клеточных оболочек, препятствующих проникновению грибов и их энзимов внутрь клеток. Химическое строение и анатомический состав древесной коры и древесины имеют много обще-
■
го. Соотношение компонентов целлюлоза : лигнин : гемицеллюлоза в коре и древесине отличается. По сравнению с другими составляющими, кора характеризуется наибольшим содержанием лигнина - 1:2:1. В древесине это соотношение составляет 2:1:1. Нередко целлюлозоразрушающие и лигнин-разруша-ющие грибы изменяют окраску древесины, съедая целлюлозу и лигнин, придавая ей более светлую или красноватую окраску. Посветление древесины связано с действием окислительных энзимов, выделяемых микромицетами при разложении лигнина; потемнение древесины - с присутствием веществ гумусового характера, образуемых бурой гнилью при разрушении целлюлозы [Рипачек В. Биология дереворазру-шающих грибов. - М., 1967]. У некоторых грибов ученые отмечают изменение окраски гиф при разложении древесины (Ванин С.А. Андреев И.Е., 1936).
Целлюлоза как питательный субстрат микро-мицетов и энзимы микромицетов, катализирующие реакцию гидролиза целлюлозы.
Целлюлаза - сложный ферментный комплекс, необходимый для разложения целлюлозы микроорганизмами [6], она же структурный компонент растительных клеток, линейный полимер из глюкозных остатков, соединенных 1,4-р-связями.
Рис.1. Структурная формула фрагмента целлюлозы
Индивидуальные цепочки полимера могут соединяться друг с другом водородными связями, образуя кристаллическую структуру. Участки целлюлозы, имеющие кристаллическое строение, чередуются с аморфными. Ферментная система грибов для разложения целлюлозы включает 1,4-р-эндоглюканазы, неупорядоченно разрывающие 1,4-р-связи внутри макромолекулы, 1,4-р-экзоглюканазы, отщепляющие с нередуцирующих концов дисахарид целлобиозу, и 1,4-р-глюкозидазы, гидролизующие целлобиозу с образованием глюкозы. Известно, что клетки грибов выделяют в субстрат экзоэнзимы, которые работают преимущественно внутри клеток микромицетов, обеспечивая их внутренние метаболические процессы. В субстрат эндоэнзимы поступают, как правило, после отмирания живых клеток гриба [5].
Активность ферментов целлюлазного комплекса обеспечивает рост микромицетов на питательных средах, единственным источником углерода в которых является целлюлоза. Робертом Томасом была выявлена прямая зависимость роста массы мицелия и возрастания продукции внеклеточной целлю-лазы. При изучении роста микромицетов на среде, единственным источником углерода в которой была глюкоза, выявили наличие фермента р-нитрофенил р-глюкозидазы и отсутствие целлюлазы.
Важное значение имеет изучение роста микро-
мицетов на природных субстратах в условиях, приближенных к естественным. Методом визуальной оценки роста микромицетов на растительном субстрате можно комплексно оценить работу ферментов целлюлазной и лигнин-литической активностей в условиях, приближенных к естественным, выявить наиболее предпочтительный вид растительного субстрата для Stachybotrys spp. Особенности роста отдельных штаммов Stachybotrys spp. мы оценивали на четырех различных видах древесных растений.
Методы исследования:
- культуральный: посев микромицетов в пробирки, содержащие 0,9% раствор натрия хлорида и образцы (простерилизованные в течение 30 мин. при 1 атмосфере) растительных субстратов с корой, а также без коры;
- световая микроскопия.
Материалы исследования:
- культуры 15 штаммов Stachybotrys spp., выращенные на питательной среде Сусло-агар;
- фрагменты побегов следующих древесных растений: березы (Betula), липы (Tilia), шиповника (Rosa), ели (Picea).
Смывы спор с культур 14 штаммов S. chartarum и 1 штамма S. chlorochalonata были взяты в количестве 2,6-106 ± 0,2-106 на мл (подсчет конидий в суспензии проводили в камере Горяева). Суспензии спор каждого штамма Stachybotrys spp. вносили в пробирки с 5 мл раствора натрия хлорида по 100 мкл. В каждую пробирку помещали фрагмент побега длиной 5-10 см одного из растений. Рост микромицетов оценивали визуально на 7, 14, 23 сутки экспозиции. Для описания характера роста микромицетов в физиологическом растворе с образцами фрагментов растений, а также роста на границе физиологического раствора с воздухом, использовали следующие критерии: 0 - отсутствие признаков роста микромицетов; 1 -появление тонкой пленки мицелия на поверхности физиологического раствора или помутнение раствора; 2 - пленка мицелия хорошо развита (её толщина от 0,5 мм) или появление хлопьев в растворе; 3 - слабое спороношение; 4 - обильное спороноше-ние; ▲ - рост мицелия наблюдали на растительном материале (Рис.1); * - слабое окрашивание раствора в оранжевый цвет, ** - умеренное окрашивание раствора в оранжевый цвет, *** - интенсивное окрашивание раствора в оранжевый цвет; сокращения: S. ch. - S. chartarum, S. chl. - S. chlorochalonata (табл).
Рис.1. Рост мицелия на растительном материале (▲)
Таблица
рост микромицетов на образцах растительных субстратов
экспозиции,
Вид растения
Липа
Ель
Шиповник
Наличие коры на растительном образце, +/-
су 1- + - + - + - + -
1 5. сИ. 7 1 0 0 1 3 2 0 1
14 1 ▲ 1 0 1 3 2 0 1
23 1 ▲ 1 ▲ 0А 3А*** 3 ▲* 2А 1 ▲ 1
2 5. сИ. 7 1 0 1 1 2 2 1 0
14 1 ▲ 1 1 1 2 2 1 0
23 1 ▲ 1 ▲ 1 ▲ 1 2А 2 1 ▲ * 1 ▲
3 5. сИ. 7 1 0 1 0 3 1 1 0
14 1 ▲ 0 1 0 3 1 1 0
23 1 ▲ 0 1 ▲ 1 3 ▲** 1 ▲ 2 ▲** 1 ▲
4 5. сИ. 7 1 0 1 0 3 3 0 1
14 1 ▲ 0 2 3 4 4 1 1
23 1 ▲ 1 ▲ 3 ▲ 3 ▲** 4** 4А** 3 ▲* 3А*
5 5. сИ. 7 1 1 3 1 3 2 1 0
14 1 ▲ 1 ▲ 3 1 3 2 2 0
23 1 ▲ 1 ▲ 3 ▲ 1 ▲* 2 3А* 1*
6 5. сИ. 7 1 0 1 0 4 2 3 1
14 1 ▲ 0 1 0 4 2 3 1
23 1 ▲ 0 1м 1 ▲ 4А» 3 3А** 1 ▲*
7 5. сИ. 7 1 0 1 0 4 3 1 2
14 1 ▲ 1 0 4 3 1 2
23 1 ▲ 2 ▲ 3 ▲ 1 ▲ 4^*** 3А 1 ▲* 4^***
8 5. сИ. 7 1 0 1 2 3 3 1 2
14 1 0 1 3 3 3 1 2
23 1 ▲ 0 1м 3А** 3А*** 3А 1 ▲ 2А**
9 5. сИ. 7 1 0 1 1 3 2 0 0
14 1 ▲ 0 1 1 3 2 2 0
23 1 ▲ 1 ▲ 3 ▲ 1 ▲ 3 ▲*** 4А** 3** 1 ▲*
105.сИ1. 7 0 1 0 1 2 0 0
14 1 0 1 0 1 2 1 0
23 1 ▲ 0 1 ▲ 0 2* 2 1 ▲ 1
11 5.сИ. 7 1 0 3 3 3 2 1 2
14 1 1 3 3 3 2 1 2
23 3А 1 ▲ 3А 4А** 3 ▲** 4 2А* 2*
12 5.сИ. 7 1 0 1 1 3 2 2 2
14 1 0 1 1 3 2 2 2
23 1 ▲ 0 3 ▲ 1 ▲ 3 ▲** 2 2 ▲* 2 ▲
13 5.сИ. 7 1 0 0 3 3 2 1 0
14 1 ▲ 2 ▲ 1 3 3 3 1 0
23 1 ▲ 3 ▲ 3 ▲ 4** 3А 3 3 ▲ 1 ▲
14 5.сИ. 7 1 0 3 1 3 1 1 2
14 1 ▲ 0 3 2 3 3 1 2
23 1 ▲ 1 ▲ 3 ▲ 4А» 3 ▲** 3 1 ▲ 2*
15 5.сИ. 7 1 0 2 1 3 2 1 2
14 1 ▲ 1 2 1 3 3 1 2
23 3 ▲ 1 ▲ 3 ▲ 3А 4 1 2АА***
результаты исследования
Все штаммы Stachybotrys зрр. росли в пробирках с образцами ели и шиповника. Четыре штамма & chartarum (№№ 3, 6, 8, 12) и штамм & chlorochalonata №10 не выросли при экспозиции с образцами побегов березы, лишенных коры. Штамм & chlorochalonata также не рос в пробирке с липой без коры. У штамма №1 не обнаружили роста в пробирке с липой (с корой).
Наиболее интенсивный рост микромицетов отмечали в пробирках с образцами неочищенной от коры ели (Рис.2). У 13 штаммов & chartarum присутствовало спороношение уже на 7 день культивирования, из них у пяти (№№ 4, 5, 6, 7, 15) - обильное (4 балла). У X chartarum №2 и & chlorochalonata пленка мицелия на поверхности жидкой фазы была хорошо развита (2 балла). У всех штаммов, за исключением №№ 2 и
13, наблюдали окрашивание физиологического раствора в оранжевый цвет, наиболее интенсивную пигментацию выявили у штаммов №№ 15, 9, 8, 7, 5 (***). В пробирках с образцами очищенной ели спороношение установили у девяти штаммов (№№ 4, 8, 9, 1, 1, 5), из них у четырех (№№ 4, 9, 11, 15) - обильное. Появление спороношения обнаружили на 7 день у трех штаммов - №№ 4, 7, 8, на 14 и 23 день - у трех (№№ 13,
14, 15) и (№№ 6, 9, 11). Хорошо развитая пленка мицелия (2 балла) была у четырех штаммов & chartarum (№№ 1, 2, 5, 12) и & chlorochalonata. У & chartarum №3 рост мицелия был в виде тонкой пленки мицелия на поверхности физиологического раствора (1 балл). Окрашивание раствора наблюдали у штаммов, отличившихся наиболее интенсивным ростом и спороно-шением (№№ 4, 9) (**).
баллы
3,5
г 2
га
с £
£ 1,5
___фЗ.г
2,93 3
2,13
..■Г . * ^#'.36
1,33 ...#1,27
0,93 1
7 сутки 14 сутки 23 сутки
Сутки культиаировэния микромицетов • Береза -««"Липа Ель '-«"Шиповник
Рис. 2. Интенсивность роста микромицетов в пробирках с образцами растительных с корой
Рост Stachybotrys зрр. на шиповнике отличается разнообразием стадий на конечных сутках культивирования (табл.). Рост микромицетов в пробирках с образцами побегов шиповника был преимущественно в виде хлопьев в растворе с оранжевой окраской. У пяти штаммов X chartarum (№№ 4, 5, 6, 9, 13) в про-
бирках с неочищенными побегами выявили спороношение, у шести (№№ 1, 2, 7, 8, 14, 15) и у 5. еЫотоек-а1опаЬа отмечали лишь помутнение раствора. У трех штаммов (№№ 3,11,12) рост мицелия проявлялся в форме хлопьев в растворе. На побегах шиповника, лишенных коры, у семи 5. екатЬатит (№№ 1, 2, 3, 5, 6, 9, 13) и у 5. ек1отоека1опаЬа рост микромицетов ограничивался помутнением раствора. У пяти штаммов (№№ 8, 11, 12, 14, 15) на поверхности жидкой фазы обнаружили появление хлопьев в растворе. Споро-ношение имело место у двух штаммов 5ЬаекуЬоЬтуз зрр.: №4 - начало спороношения и №7 - обильное спороношение (Рис.3).
баллы
3 г
7 сутки 14 сутки 23 сутки
Сутки культивированип микромицетов
-•-Береза ..е.-Липа —». Ель •■•■ ■ Шиповник
Рис. 3. Интенсивность роста микромицетов в пробирках с образцами растительных материалов без коры
Наименее интенсивным рост микромицетов был на березе (табл., Рис.2). У 13 штаммов 5ЬаекуЬоЬтуз ярр. рост в пробирках с образцами неочищенных побегов был выявлен в виде тонкой пленки мицелия на поверхности физиологического раствора на всех сутках культивирования, у двух (№11,15) наблюдали спороношение на 23 сутки культивирования.
Рост большинства микромицетов в пробирках с физиологическим раствором и побегами березы, лишенными коры, также представлял собой тонкую пленку мицелия, однако появлялась она позднее - на 14 сутки экспозиции. Лишь у одного штамма (№5) установили рост на 7 сутки. У четырех штаммов Б. екатЬатит (№№ 3, 6, 8, 12) и 5. ек1отоека1опаЬа роста в пробирках с образцами растений не было. Обращают на себя внимание два штамма: №7, рост которого был выявлен в виде хорошо развитой пленки мицелия (23 сутки); № 13, характеризующийся хорошо развитой пленкой мицелия и появлением единичного спороношения (14, 23 сутки).
Рост микромицетов в пробирках, содержащих физ.раствор с побегами липы, отмечали у 14 штаммов на поверхности физ.раствора и побегах растения и у одного штамма - лишь на поверхности растения. У девяти штаммов 5ЬаекуЬоЬтуз spp. обнаружили спороношение: у штаммов № 4, 7, 9, 13 - на 23 сутки, у штаммов №5, 11, 12, 14, 15 - на 7-е; №№ 7, 9 - на 23-и. Роста штамма №1 на поверхности раствора не было,
на 23 сутки наблюдали его рост на растительном субстрате. Рост штаммов №№ 2, 3, 6, 10 проявлялся в виде тонкой пленки на поверхности жидкой фазы (7-14 сутки), а к 23 суткам - в виде слабого налета на субстрате.
Рост 5ЬаекуЬоЬтуз spp. в пробирках с физ. раствором и очищенными от коры побегами липы отмечали у 14 штаммов 5. екатЬатит, штамм 5. ек1отоека1о-паЬа не вырос ни на поверхности среды, ни на растительном субстрате. У семи штаммов 5. екатЬатит выявили спороношение, из них на 7 сутки культивирования - у штаммов №№ 11, 13, на 14-е - у №№ 4, 8, на 23 - у №№ 1, 14, 15. Обильное спороношение установили у штаммов №№ 11, 13, 14. Во всех случаях стадия спороношения микромицетов на 23 день сопровождалась окрашиванием раствора в насыщенный оранжевый цвет, у штамма №1 окрашивание раствора было наиболее интенсивным. Рост штаммов №№ 3, 6, 7 был более медленным, по сравнению с таковым других штаммов, и проявлялся лишь к 23 суткам роста. Рост микромицетов в пробирках с физиологическим раствором и образцами липы без коры отличался наибольшим разнообразием тенденций к росту, проявляющимися в виде замедления роста у одних штаммов и, напротив, ускоренного и более интенсивного роста у других (табл.). Также отличительной особенностью роста микромицетов в пробирках с образцами очищенной липой является образование пигмента при интенсивном спорообразовании. При использовании очищенной липы в качестве субстрата спороношение обнаружили у девяти штаммов, среди которых обильное - у пяти. Замедленное развитие наблюдали у штамма №3 - тонкую пленку мицелия. Таким образом, неочищенная липа является наиболее благоприятным субстратом для роста микромицетов, чем липа, лишенная коры.
выводы
1. Ель является наиболее подходящим для роста 5ЬаекуЬоЬтуз spp. субстратом, береза - наименее.
2. Наиболее интенсивный рост микромицетов наблюдали на побегах, имеющих кору, по сравнению с таковыми, лишенными коры.
3. Лигнин - наиболее подходящий для роста 5ЬаекуЪоЬту?, spp. субстрат, содержащий углерод. Интенсивному росту микромицетов на коре способствовало, вероятно, разрушение суберинизиро-ванных слоев клеточных оболочек пробковой ткани коры при автоклавировании.
4. В пробирках с побегами березы, ели, липы рост 5ЬаекуЪоЬту?, spp. обнаружили на границе физиологического раствора с воздухом, в пробирках с побегами шиповника - в планктонной форме в виде хлопьев.
5. Выявили появление пигмента при ярко выраженном росте микромицетов в пробирках с образцами побегов липы, лишенных коры, ели и шиповника как с корой, так и без.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Доршакова Е.В., Елинов Н.П., Павлова И.Э. и др. Микромицеты в естественной среде обитания и в помещениях -их потенциальная опасность для здоровья людей// Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т. 14, №3. - С. 53-57.
2. Pestka J.J., Yike I., Dearborn D.G., et al. Stachybotrys chartarum, trichothecene mycotoxins and damp building - relatedill-ness: new insights into a public health enigma // Toxicological sciences. - 2008. - Vol. 104. - P. 4-26.
3. Cameron D.G. Toxicity profile of Stachybotrys chartarum //A thesis in environmental toxicology/ submitted to the graduate faculty of Texas tech university in partial fulfillment of the requirements for the degree of master of science. - 2009.
4. Доршакова Е.В. Морфолого-физиологические особенности токсинообразующих грибов - биодеструкторов из рода Stachybotrys // Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №3. - С. 13-21.
5. Васильева Н.В., Елинов Н.П. Микроорганизмы - контаминанты и патогены - индукторы процессов старения больничных зданий и помещений медицинского назначения, а также возбудители некоторых заболеваний людей (учебное пособие) /Под ред. Н. П. Елинова. - СПб.: КОСТА, 2009. - 224 с.
6. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. вузов / Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Изд. центр «Академия», 2005. - 608 с.
Поступила в редакцию журнала 16.12.2014
Рецензент: А.А. Степанова
