CC BY
46АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЙ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ СЫВОРОТОК в ELISA-TECTAX, ВЫПОЛНЕННЫЙ НА ТЕСТ-СИСТЕМЕ «ВГС-ИФА-АВИЦЕННА».
Введение: Гепатит С широко распространен в мире: число инфицированных составляет от 0.1 до 5% в разных странах. Так в США 3.9 млн лиц из благополучных семей инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), из них 2.7 млн имеют хроническую форму инфекции [Бюлл. «Мир вирусных гепатитов» № 7-8 (2002) с.З]. Диагностика ВГС, основанная на определении антивирусных антител в сыворотке или плазме крови, проводится, в основном, методом иммуноферментного анализа (ИФА). Возможные ложноположительные результаты создают определенные трудности в медицинской практике и при скрининге крови доноров [Yoshida H., Kim Y.S., et al., 1999]. Например, уровень ложноположительных результатов в анти ВГС-ИФА достигал 10% при анализе 1814 образцов сывороток; такое заключение основывалось на (i) отрицательных результатах в независимых подтверждающих тестах; (ii) негативных результатах в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и (iii) отсутствии клинических признаков и биохимических показателей, свойственных гепатиту С, у пациентов в течение 1 года [Sakugawa H., et al., 1995]. Целью данной работы было определение оптимального порогового значения оптической плотности (cut-off) ИФА на анти-ВГС тест-системе «ВГС-ИФА-АВИЦЕННА» с привлечением методов статистического анализа для снижения вероятности получения ложноположительных результатов.
Материалы и методы: Наборы сывороток, используемые в качестве отрицательных ВГС-данных, были получены из Иранской службы переливания крови (Тегеран, доноры). Наборы сывороток, используемые как положительные ВГС, получены из Инфекционной клинической больницы Санкт-Петербурга (ВГС-пациенты). Оба набора данных были проверены на наличие антител ВГС с помощью тестовой системы "ВГС-ИФА-АВИЦЕННА" и системы "Вектор" (Новосибирск). Обработка данных была выполнена в соответствии с инструкциями производителя реактивов.
На основании полученных результатов статистического анализа была проведена проверка данных, полученных из Инфекционной клинической больницы Санкт-Петербурга, которые были классифицированы ранее как неопределенные.
Для построения модели, которая по измерениям оптической плотности для данной сыворотки позволила бы получать оценки вероятности того, что сыворотка является положительной или отрицательной, был проведен статистический анализ измерений ОП для данных, которые были уже идентифицированы как положительные или отрицательные с помощью других методов.
Наша статистическая модель основана на предположении, что все физические изменения, а значит, и результаты измерений, соответствуют двум типам реакций:
• Специфичным реакциям, проходящим вследствие взаимодействия ВГС-антигена из реактива, содержащегося в тестовом наборе, с антителами исследуемой сыворотки;
• Неспецифичным реакциям, связанным со случайными ассоциациями антигена ВГС с различными макромолекулами, не связанными со специфичными антителами.
Целью статистического анализа результатов измерений является определение различия между этими двумя первопричинами, обуславливающими результаты измерения оптической плотности, полученные с помощью прибора ELISA-Reader (Multiscan EX).
Статистическая модель: Распределение значений оптической плотности для отрицательных и положительных данных. Для каждого набора данных, используемых в наших тестах, выполнялись измерения ОП реактивов, полученных из различных контрольных партий тестовой системы "ВГС-ИФА-АВИЦЕННА". Это дает возможность учитывать вариабельность значений ОП в зависимости как от различных параметров сыворотки, так и от параметров тестовой системы. Определим через уЦ измерение оптической плотности для г'-й сыворотки, измеренной для реактива, взятого из j-й. группы. Среднее значение
* о)
где N - число различных групп реактивов, используемых для измерений, является средним значением оптической плотности для г'-й сыворотки. В пределе большого числа измерений сумма
(1) сходится к значению, которое рассматривается как «истинное» значение оптической плотности для данной сыворотки. Однако, в клинических условиях число тестовых измерений ограниченно, и мы должны изучать данные, полученные при малых значениях N, и делать выводы на их основе. С биохимической точки зрения можно ожидать, что в случае специфичных реакций будет иметь место вариабельность результатов, связанная с малым числом различных экспериментальных условий, и эта вариабельность значений будет меньше, чем в случае неспецифичных реакций, обусловленных случайными ассоциациями с макромолекулами: последние являются редкими событиями, чувствительными к термодинамическим условиям.
Чтобы объяснить оба случая специфичных и неспецифичных реакций, мы независимо анализировали ОП достоверно отрицательных и положительных данных. Для отрицательных сывороток наблюдаемое значение ОП является результатом редких случайных событий. Поэтому можно использовать для описания распределение Пуассона для дискретного числа событий
ахе~х х\
или экспоненциальное распределение (со средним значением tri) с плотностью вероятности
рЛу) = ~е^ (3)
т
для непрерывной величины (0<у<°° ). Чтобы определить, какая из этих двух альтернатив лучше подходит к нашим данным, был использован критерий c2.
В случае гипотезы о распределении Пуассона ситуация более сложна, чем в случае экспоненциального распределения. Распределение Пуассона определяет вероятность последовательности дискретных событий. В нашем эксперименте оптическая плотность, измеряемая ELISA сканером, считается величиной непрерывной. Таким образом, для проверки выдвинутой гипотезы мы должны дополнительно предположить, что измеряемая оптическая плотность у линейно связана с реальным числом неспецифичных ассоциаций (c) неизвестной константой /I, зависящей только от измерительного оборудования: у=^. В этом случае вероятность измеренной оптической плотности у попасть в диапазон значений [zk-i,Zk\ описывается формулой
*«
_ <y<z]= "Гт* (4)
т
где а = х -реальное среднее число неспецифичных ассоциаций, являющееся неизвестной величиной.
Для положительных сывороток распределение оптической плотности локализовано около определенного значения (положительный контроль оптической плотности М), и мы можем описать полученные результаты распределением Гаусса
-■■ (5)
12ясг*
В так называемой «серой зоне», которая расположена между средними значениями отрицательной (т) и положительной (М) выборок, обе вероятности р+(у) и р.(у) сравнимы и требуется критерий Байеса [Schroter M. Et al.,1999], чтобы оценить отношение вероятностей для данных измерений быть отрицательными или положительными. Оценка параметров т, М, s для обоих распределений основана на статистическом анализе положительных и отрицательных данных.
Вместе с оценкой вероятности положительности или отрицательности измеряемых образцов очень важен качественный критерий, который можно было бы использовать для анализа данных в «серой зоне». Важно оценить зависимость величины дисперсии измерений от числа измерений. Для действительно положительных данных большое отклонение от среднего
значения может быть связано, в основном, с грубым нарушением технологии. Если технология соблюдена хорошо, вероятность получения больших отклонений мала, и дисперсия для положительных данных не будет высокой. В случае отрицательных данных, напротив, действительно случайные естественные неспецифичные ассоциации являются причиной больших значений дисперсии.
Все эти положения основаны на статистическом анализе выполненных нами контрольных тестов. В следующем разделе приводятся результаты проверок и выводы, которые могут быть использованы для проведения ИФА-тестов.
Диапазон значений оптической плотности положительных и отрицательных выборок.
Значения оптической плотности для отрицательных данных расположены в диапазоне от О до определенного порогового значения уа , которое зависит от вероятности того, что величина
а любой отрицательной сыворотки попадает в заданную область значений. Аналогично, оптические плотности положительных данных расположены от нижнего порогового значения уа до бесконечности. Если распределения вероятности для отрицательных р. (у) и для
положительных сывороток, расположенных ниже порога р+ (у), известны, то критическое значение может быть найдено путем решения пары интегральных уравнений
Промежуточная область (уа ,уа ) называется «серой зоной». Данные с оптической
плотностью, попавшей в серую зону могут быть как отрицательными, так и положительными -обе вероятности малы, но сравнимы друг с другом. Таким образом, для подробного анализа серой зоны требуются дополнительные экспериментальный и статистический анализы.
Могут существовать две различные причины, которые приводят к оптической плотности выше отрицательного контрольного значения, но при этом ниже положительного контрольного значения:
• Неспецифичные ассоциации;
• Повышение ОП вследствие очень редких специфичных реакций.
Различная биохимия этих двух процессов наводит на мысль, что малые вариации условий обработки будут приводить к различным эффектам в результатах измерений. Для случая неспецифичных ассоциаций малая вариация условий обработки данных может сильно изменить число установленных ассоциаций. Поэтому, выполняя ряд проверок на отрицательных сыворотках с высокой плотностью, мы можем ожидать высокую вариативность, т.е. большую дисперсию результатов. Напротив, в случае действительно положительной сыворотки, если условия обработки соблюдались хорошо, число специфичных реакций зависит в основном от концентрации антител в сыворотке, и значит, мы получим низкую вариабельность и, следовательно, малое среднеквадратичное отклонение ОП. На основании этого критерия можно провести некоторое число дополнительных тестов для неопределенных данных и посмотреть поведение новых результатов.
Результаты и выводы:
Проверка гипотез: Экспоненциальное распределение (3) зависит от одного параметра т -среднего значения. Зная среднее значение для отрицательных данных, т =0.02568, мы проверили гипотезы об экспоненциальном распределении и распределении Пуассона для оптической плотности отрицательных сывороток. Чтобы сравнить гипотезы с помощью критерия , средние значения оптической плотности (1) для всех п=200 сывороток гистограммировались в 1=9 бинов. Для экспоненциального распределения критическое значение хи-квадрата для 1-2=7 степеней свободы равно 8.39. Это соответствует уровню значимости а=0.3; т.е. гипотеза об экспоненциальном распределении принимается на уровне 30-процентных отклонений.
Для проверки гипотезы о распределении Пуассона для отрицательных данных значение критерия с2 вычислялось для тех же данных, гистограммированных в 9 бинов при различных значениях неизвестного параметра (а), см. (4). Наилучшее согласие получение для а=1.55 с
(6)
о
с2 =19.33. Такая гипотеза могла бы быть принята лишь на уровне значимости в 1 процент. В данном случае полученный результат не достаточно хорош для практического применения. Распределение средних значений ОП для отрицательных данных, сопровождаемое теоретическими распределениями частот в соответствии с экспоненциальным распределением и распределением Пуассона, показано на рисунке 1.
Рисунок 1. Распределение средних значений оптической плотности, вычисленных для п=200 отрицательных данных, полученных от доноров крови. Теоретические гистограммы, соответствующие экспоненциальному распределению (т=0.02568) и распределению Пуассона (а=1.55), показаны прерывистыми линиями.
Рисунок 2. Распределение средних значений ОП для n=200 отрицательных сыворток доноров крови. Результат автоматического наилучшего фитирования показан пунктиром.
На рисунке 2 представлен результат фитирования распределения средних значений ОП, полученный с помощью программы PAW.
Таким образом, можно говорить о принятии гипотезы об экспоненциальном распределении оптической плотности для группы отрицательных данных. Она может быть успешно применена для оценки отрицательного порогового значения и принятия решения, является ли анализируемый образец отрицательным.
Границы «серой зоны»: Для распределения ОП отрицательных сывороток решение уравнения (6) для распределения (3) дает отрицательное пороговое значение 1
(7)
I -а_
Эта оценка может быть эффективна, только если распределение ОП удовлетворяет условиям экспоненциального закона (3). Вариации значений ОП реальных отрицательных данных, возникающие вследствие вариабельности условий, должны быть учтены как вариация самого среднего значения т. Рассматривая нормальное распределение (со средне-квадратичным отклонением Sm ) для отклонений ОП от среднего значения
v i." о „, у
имеем доверительный интервал [0,уар] для оптической плотности отрицательных образцов, где J3 - значение вероятности отклонения т, обусловленное нарушениями в условиях обработки, измерительного оборудования и т.д.
Уар =[m + ^21,),Erf-i(/3)]ln—— (9)
Таким образом, мы имеем два уровня значимости для определения отрицательного порогового значения: a - вероятность, которая соответствует вариабельности биохимических параметров тестируемого материала, и b, которое зависит от качества оборудования и технологии измерения. Чтобы упростить вычисления последнего, можно зафиксировать на значении в 32 уровень (Erf (b)=3),который приблизительно соответствует значению b=0.99. Такое значение часто используется при решении практических задач. Для набора данных, используемых в работе, это означает, что область значимости [0,уо.995,0.99] (при a=0.196) содержит 99.5 процентов всех отрицательных данных, и метод позволяет получить уровень распознавания тестовых данных около 99 процентов.
Данные, соответствующие положительным реакциям в сыворотке (вызванным специфичными реакциями), не являются столь представительными как отрицательные. Анализировался набор из п=82 положительных сывороток, полученных в результате тестирования сывороток различными реактивами из N=6 различных партий. Оценка среднего значения составляету0 + =2.276 (со среднеквадратичным отклонением 0.0152). Дисперсия для
полученного нормального распределения составляет s0 = 0.408. Распределение средних значений оптической плотности для положительных данных представлено на рисунке 3.
Рисунок 3. Распределение средних значений ОП для п=82 сывороток ИСУ-инфицированных пациентов Инфекционной клинической больницы Санкт-Петербурга. Показан результат фитирования гауссовым распределением.
Как говорилось выше, «положительность» анализируемой сыворотки принимается только в случае подтверждения данного диагноза измерениями, выполненными с помощью других тестовых систем. В частности, если "Вектор" показал положительность реакции.
Сравнение положительной и отрицательной гипотез для выборок в серой зоне: Распределения (3) и (5) дают хорошую аппроксимацию для значений ОП отрицательных и положительных данных соответственно. Это позволяет сравнить возможные вероятности для произвольной сыворотки с измеренным значением ОП у быть положительной или отрицательной. Как следует из уравнения (3), вероятность для отрицательной сыворотки иметь значение ОП выше у равна
Р_00 = ехр(-у/т), (10)
и, как следует из уравнения (5), вероятность для положительной сыворотки иметь значение ОП ниже у равна
>.су>4
1 -Erf
(11)
Отношение двух вероятностей R(y) - Р+(у)/Р_*_(у) можно рассматривать как доверительную функцию, которая в случае Я(у) >1 показывает, что сыворотка с данным значением ОП у является скорее положительной, чем отрицательной. График функции Я(у) для серой зоны представлен на рисунке 4.
Рисунок 4. График функции доверия К(у) в серой зоне между отрицательными и положительными областями. Построен при следующих значениях параметров: т = 0.02568, у* = 2.276,0г* = 0.408 .
Как видно из рисунка 4, для тестируемых данных пороговое значение, которое позволяет определять положительность сыворотки, составляет около 0.35.
Вариабельность ОП для положительных и отрицательных данных.
На рисунке 5 приведено распределение оптической плотности в зависимости от относительного среднеквадратичного отклонения (г^^^/у) для набора из 200 отрицательных и 82
Рисунок 5. Диаграмма рассеяния (величина - относительная ошибка) для измеренных значений ОП. Построена в логарифмических координатах. На диаграмме отражены точки, соответствующие как положительным, так и отрицательным сывороткам.
л/Д?
Как видно из рисунка, относительная ошибка £ =
У
положительных данных (справа на графике) составляет меньше, чем 0.3, в то время как отрицательные данные (слева на рисунке) дают значительно большее значение £.. Данный критерий может быть использован для тестирования неопределенных значений ОП.
Двумерное распределение относительного среднеквадратичного отклонения в зависимости от оптической плотности (г^^^/у) для 3 неопределенных значений из серой зоны продемонстрировало, что в соответствии с предлагаемым подходом только первое значение является отрицательным. В заключение кратко суммируем результаты, полученные в работе:
• Показано, что измеренные значения оптической плотности отрицательных сывороток со средним значением 0.026, полученные с помощью тестовой системы "ВГС-ИФА-АВИЦЕННА", имеют значительную корреляцию с экспоненциальным распределением.
• Значения оптической плотности для положительных данных сконцентрированы около среднего значения 2.276. Эти значения могут быть описаны Гауссианом, имеющим значительный хвост степенного характера.
• Существует область значений оптической плотности, примерно 0.2-0.4, в которой тестируемые образцы с равно низкой вероятностью могут быть как положительными, так и отрицательными - «серая зона».
Результаты статистического анализа показывают, что в случае получения ОП со значением, попадающим в серую зону, необходимо провести несколько дополнительных тестов: если дисперсия новых измерений будет выше, образец можно считать отрицательным, при низкой вариабельности значений сыворотка скорее является положительной при среднем значении большем порогового.
Разработанные методы носят общий характер и могут быть применены в различных тестовых системах.
положительных значений.
Авторы благодарны докторам А.Духину и Д.Фоменко за полезные обсуждения, а также доктору Л.Панченко за ряд критических замечаний. М. В. Алтайский, А. X. Асади Мобархан, А. Ю. Бонюшкина, Е. В. Кузнецова, Т. П. Лисок, Объединенный интститут ядерных исследований, г. Дубна, Медицинский центр «Авиценна», Москва.
ДИАГНОСТИКА и КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА HGV-ИНФЕКЦИИ у БОЛЬНЫХ ПАРЕНТЕРАЛЬНЫМИ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ - HBV, HCV и HBV/HCV. Вирусные гепатиты традиционно являются одной из наиболее острых проблем здравоохранения. Данные ВОЗ свидетельствуют о том, что во всем мире вирусами гепатитов инфицированы сотни миллионов человек. Конец XX столетия ознаменовался возрастающим интересом к проблеме вирусных гепатитов, большим прогрессом в их изучении. Почти повсеместно, в том числе в России, большего внимания требуют недифференцируемые гепатиты. В клинической практике нередко встречаются гепатиты с неясной этиологией, называемые гепатитами ни А, ни Е. При попытке объяснить природу таких гепатитов в 1995 г. две независимые группы ученых сообщили о существовании нового вируса, ассоциированного с заболеваниями печени и названного вирусом гепатита G (HGV) (Linnen J., 1996).
В 1966 году 34-летний хирург (с инициалами GB) заболел острым гепатитом с умеренными показателями ферментативной активности, с трехнедельной продолжительностью желтушного периода. На третий день желтушного периода у пациента взяли кровь, которую использовали для экспериментального внутривенного заражения низших не человекообразных приматов (тамаринов). При проведении четырех серийных пассажей от обезьяны к обезьяне у всех был зарегистрирован гепатит. Полученные результаты позволили выдвинуть предположение, что причиной, вызвавшей данный гепатит, является еще не идентифицированный вирусный агент, обозначенный как GBV. Дальнейший прогресс в исследовании гепатита G стал возможен лишь после разработки в 1993 году новых молекулярно-биологических методов (Lisitsyn N., 1993), позволяющих целенаправленно идентифицировать новые вирусы. В лаборатории Abbott с помощью репрезентативного дифференцировочного анализа в сыворотке крови обезьян (Simons J.N., 1995) удалось определить два новых вирусных агента, обозначенных GBV-A и GBV-B. Дополнительные исследования позволили высказать гипотезу о не патогенности GBV-A и GBV-B для человека и предположить существование дополнительного вирусного агента (Muerhoff A.S., 1995). Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов РНК, полученных в ПЦР-анализе в сыворотках крови пациентов с клиническими проявлениями вирусного гепатита, продемонстрировал наличие нового вирусного агента, обозначенного GBV-C. В это же время независимая группа ученых сообщила об открытии нового вируса человека, ассоциированного с гепатитом. Вирус был назван вирусом гепатита G. Полное соответствие аминокислотных последовательностей позволило утверждать, что HGV и GBV-C - это различные изоляты одного вируса (Unnen J., 1996). В дальнейшем мы будем пользоваться аббревиатурой HGV - Hepatitis G virus.
Геном HGV представлен позитивной цепью РНК размером около 9400 и.о. Существенным отличием HGV от других представителей семейства флавивирусов является отсутствие на N -концевой части полипротеина, кодирующего нуклеокапсидный белок (Simons J.N., 1996). Существует предположение, что отсутствие нуклеокапсида может быть ответственно за низкую патогенность вируса гепатита G. Отличия в нуклеотидной последовательности генома между различными изолятами HGV составляют 10-15 % и варьируют в зависимости от участка генома. Scott Muerhoff предложил схему классификации изолятов HGV, основанную на обозначении типа генома вируса гепатита G цифрой, а субтипа - буквой, по аналогии с HCV. Согласно предложенной схеме, изоляты HGV, обнаруженные в Западной Африке, относятся к типу 1, который содержит два субтипа - 1а и 1b. Среди Европейских и Североамериканских изолятов, отнесенных к типу 2, также выделено два субтипа (2а и 2b). В Азии доминирует тип 3. Вирус гепатита G характеризуется значительно меньшим темпом мутирования по сравнению с таким вирусом, как HCV.
