CC BY
3210. Михайлов М.И., Мамедов М.К. Значение парентеральных вирусных гепатитов в онкологической клинике. - В кн.: Избранные лекции и доклады 4-го съезда онкологов и радиологов СНГ. Баку, 2006, с. 42-47.
11. Becherer P.R. Viral hepatitis: What have we learned about risk factors and transmission. -Postgrad Med 2003; 1:65-74.
12. Агаев Б. А. Хирургические болезни. Баку: Тебиб, 2007, 807 с.
13. Алиева Н.А., Рахмани С.А., Ахундова Д.М., Мамедов М.К. Серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов В и С и гипер-аминотрансфераземия у больных в многопрофильном хирургическом стационаре. Хирургия (Баку) 2006; 2:63-65.
14. Gerlich W. Hepatitis B and C: risk of transmission from infected health care workers to patients. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz 2004; 47:369-378
15. Recommendations for follow-up of health-саге workers af- ter occupational exposure to hepatitis С virus. Morbid Mortal Weecly Rep US Centers for Disease Control and Prevention 1997; 46:603-606.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ «ПРОБЛЕМНЫХ» ОБРАЗЦОВ при МАССОВОМ СКРИНИНГЕ СЫВОРОТОК КРОВИ на АНТИТЕЛА к ВИРУСУ ГЕПАТИТА С
A.А Потапова, Е.Б. Редченко,
B.А. Науменко
Кожно-венерологический клинический диспансер №1, Департамента здравоохранения г.Москвы
При проведении массовых исследований сыворотки крови пациентов различных лечебно-профилактических
учреждений (ЛПУ) г. Москвы на наличие антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) методом иммуноферментного анализа (ИФА) примерно 5% образцов содержат анти-ВГС [1]. Позитивными, т.е. содержащими анти-ВГС, образцами в соответствии с приказом МЗ РФ [2] признаются
образцы, оптическая плотность (ОП) которых на первичном и на подтверждающем этапе исследования превышает критическую ОП (ОП кр.), рассчитанную в соответствии с инструкциями к тест-системам (ТС). При выявлении анти-ВГС существенное значение для диагностической точности имеет величина соотношения ОП/ОПкр. -коэффициент позитивности (КП) образца. Расширенные исследования образцов с низким КП часто приводят к противоречивым результатам [3-5,6] как в планшетных ИФТС разных производителей, так в иммуноблотах [5] и в линейном иммуноферментном анализе (ЛИА). Для первичного скринингового исследования были определены границы низкой позитивности, при которой необходимо проводить дополнительные исследования для получения достоверного результата. Так, в США все образцы с величиной ОП/ОПкр. в скрининге менее 2,3 исследуются в иммуноблоте «RIBA HCV 3.0 SIA» (Chiron Corporation) [7]. Российскими исследователями было установлено, что наибольшее количество расхождений результатов наблюдается при соотношении ОП/ОПкр. менее 3, а для исследования так называемых проблемных сывороток был предложен интегральный подход - диагностический консенсус, согласно которому заключение о наличии анти-ВГС делается по совокупности результатов, полученных в 4-5 ИФТС [6]. Каждый из этих подходов имеет определенные ограничения при проведении массового скрининга на наличие анти-ВГС: исследование в иммуноблоте - в основном по экономическим причинам, метод достижения диагностического консенсуса -вследствие трудоемкости определения окончательного результата.
Целью данной работы была разработка эффективного алгоритма массового скрининга сывороток крови на наличие анти-ВГС, в том числе при исследовании низкопозитивных и образцов с противоречивыми результатами исследования.
Основной задачей явилось определение критериев отбора низкопозитивных в подтверждающем тесте образцов, которые необходимо дополнительно исследовать для получения достоверного результата.
Материалы и методы. Материалом для исследования были образцы сывороток крови, направленные на
исследование в лабораторию, осуществляющую массовый скрининг сыворотки крови (в день на наличие анти-ВГС исследуется более 2000 образцов).
Были использованы три скрининговые ИФТС: «РекомбиБест анти-ВГС тест» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), «Гепаскрин» (««Биосервис», г. Москва) и «Monolisa anti-HCV plus» («BioRad», Франция), три подтверждающие ИФТС с раздельным определением в двух лунках планшета антител к структурным и неструктурным АГ ВГС (соответственно анти-Core и анти-NS ВГС): «ВГС-ДСМ-подтверждающий тест» (ЗАО «Медико-биологический союз», г.Новосибирск), «РекомбиБест анти-ВГС подтверждающий тест» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) и «ИФА-анти-Н№спектр-аМ» (НПО
«Диагностические системы», г. Н.Новгород) и три ИФТС этих же производителей с раздельным определением 4 видов антител: анти-Core, анти- NS3, анти-NS, анти-NSS ВГС. Референсные подтверждающие исследования были проведены с использованием тест-систем для ЛИА: «INNO-LIA HCV Ab Ш update» («Innogenetics», Бельгия) и «ЛИА ВГС» («Ниармедик плюс», г. Москва).
Расчеты по определению ОП кр. производились в автоматическом режиме во время измерения ОП образцов. Значение КП вычислялось как отношение величины ОП образца к величине ОП критической.
Для обработки полученных результатов были использованы статистические программы Microsoft Exсel и Statistica. Сравнение выборочных средних проводили с помощью t-критерия, сравнение дисперсий вариационных рядов - с помощью F-критерия. Для проверки гипотезы о законе распределения использовали критерий согласия х2.
Полученные результаты и их обсуждение.
Для повышения достоверности данных об обнаружении анти-ВГС были разработаны критерии отбора низкопозитивных образцов сыворотки крови в дополнительном подтверждающем исследовании с раздельным определением анти-Core ВГС и анти-NS ВГС. При использовании интегрального подхода к исследованию проблемных сывороток, так называемого диагностического консенсуса, группа из 117 низкопозитивных образцов после определения в 5 ИФТС была разделена на
интегрально-положительные (инт(+), п=39) и интегрально-отрицательные (инт(-), п=78) образцы. Далее определялось различие групп инт(+)- и инт(-)-образцов в первичной скрининговой ИФТС и в первой подтверждающей ИФТС при наличии анти-Соге ВГС и анти-КБ ВГС. В первичной скрининговой ИФТС между группами инт(-)- и инт(+)-образцов не было различий ни по величине выборочных средних КП, ни по величине дисперсий выборок. При определении различия статистических параметров выборок инт(-)- и инт(+)-образцов в первой подтверждающей ИФТС с раздельной сорбцией структурных и неструктурных АГ («ВГС-ДСМ-подтверждающий тест»)
обнаружено, что группы различались по средним величинам КП анти-Соге (1,66 и 2,28 соответственно, р<0,05) и по дисперсиям соответствующих выборок (р<0,05), а также по средним величинам КП анти-КБ (2,26 и 4,16 соответственно, р<0,05) и по дисперсиям соответствующих выборок (р<0,01).
Таким образом, при использовании статистических критериев было показано различие выборок инт(-)- и инт(+)-образцов сывороток крови по показателям в подтверждающей ИФТС.
Согласно критерию х2, значения КП инт(-)- и инт(+)-групп в первичном скрининговом и в подтверждающем исследовании подчиняются разным законам распределения. Была определена вероятность принадлежности сыворотки с определенным значением КП к соответствующей группе. А именно, 95% данных инт(-) выборки в первичном скрининге с вероятностью 75% имеют величину КП анти-ВГС ниже 3,36; в подтверждающей ИФТС с вероятностью 90% -КП анти-Соге ВГС ниже 2,03 и с вероятностью 85% - КП анти-КБ ВГС ниже 5,4.
Соответствующие величины КП (величина КП анти-Соге ВГС ниже 2,03 и величина КП анти-КБ ВГС ниже 5,4) могли быть обоснованно приняты за пограничные значения для проведения второго подтверждающего исследования образцов сывороток, которые в ИФТС «ВГС-ДСМ-подтверждающий тест» были низкопозитивными.
На следующем этапе выбранные сыворотки были протестированы в подтверждающей ИФТС другого
производителя. Необходимость использования в дополнительном подтверждающем исследовании ТС другого производителя обоснована данными, полученными при сравнении результатов исследования низкопозитивных сывороток в нескольких ИФТС, твердофазных ИФТС и в иммуноблоте. В 30% образцов, низкопозитивных в скрининговой и в подтверждающей ИФТС производства ЗАО «Вектор-Бест», в двух дополнительных подтверждающих ТС «ВГС-ДСМ-подтверждающий тест», (НПО «Медико-биологический союз», г. Новосибирск) и «ИФА-анти-НСУ-спектр-ОМ» (НПО «Диагностические системы», ННовгород) антитела к ВГС не обнаруживались. При использовании ЛИА как референсного способа оценки противоречивых данных в первом полугодии 2007 г. получены следующие результаты. Всего было исследовано 264587 образцов сывороток, С помощью ЛИА проанализирован 181 (0,06%) образец из них: 141 образец предварительно был исследован в подтверждающих ИФТС различных производителей: «РекомбиБест анти-ВГС тест» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) - ВБ и «ИФА-анти-НСУ-спектр-ОМ» (НПО «Диагностические системы», Н.Новгород) -ДС. Для 31 (22,96%) из 141 образцов были характерны противоречивые результаты исследования. При исследовании этих проб в ЛИА были получены результаты, представленные в таблице 1.
Таблица 1.
Сравнение трактовки результатов исследования наличия анти-ВГС при помощи теста «ЛИА ВГС» в образцах сывороток крови, в которых зарегистрирован «противоречивый» результат в подтверждающих тест-системах для иммуноферментного анализа (ИФТС производства фирм «Вектор Бест» -ВБ и «Диагностические системы» - ДС).
Таким образом, неопределенные результаты в ЛИА были характерны для 10 (32%) из 31 образца, анти-ВГС в ЛИА были обнаружены в 9 (29%) образцах и не обнаружены в 12 (39%) образцах. Без учета неопределенных результатов сумма положительных и отрицательных вариантов, одинаково определенных с ЛИА, для ВБ составила 9, а для ДС - 12. Неопределенные результаты ЛИА в 4 раза чаще соответствовали положительным результатам ВБ, чем положительным результатам ДС.
Эти данные практически совпадают с результатами, полученными нами ранее при исследовании 60 «проблемных» образцов: в «INNO-LIA HCV Ab III update» положительные результаты наблюдались в 28%, отрицательные - в 32% и неопределенные - в 40% случаев.
В настоящее время в России производятся ИФТС с расширенным спектром определения анти-ВГС на планшете (анти-Core, анти-№3, анти-№4, анти-№5), инструкции к которым содержат критерии неопределенного ответа, а именно ИФТС типа «спектр» с раздельной сорбцией 4 АГ ВГС: Core, NS3, NS4, NS5.
Ниже приведены данные, полученные в лаборатории КВКД №1 ДЗ г. Москвы в мае 2006 г. при использовании данных ТС. Первичный скрининг проводился в ТС «РекомбиБест-анти-ВГС»; из 39105 исследованных образцов сыворотки первично-положительными были признаны 2748 (7,03%) образцов, из них: 283 низкопозитивных образца (10,3% от первично-положительных сывороток) были исследованы в трех и более ТС. Среднее значение КП в первичной скрининговой ИФТС было равно 2,167±0,911, т.е. совпадало с рекомендациями о дополнительном исследовании сыворотки с КП менее 3 для предупреждения выдачи ложноположи-тельного - результата [7]. Из 283 низкопозитивных образцов результаты исследования 133 (47%) были положительными, 69 (24%) - отрицательными, а результат тестирования 81 (29%) образцов сывороток был неопределенным в соответствии с инструкциями к использованным ТС типа «спектр». Кроме того, отдельные образцы сывороток, в основном с противоречивыми результатами в ИФТС разных производителей
ЛИА Неопределенный результат n=10 Отрицательный результат n=12 Положительный результат n=9
ИФТС ВБ + ДС - ВБ -ДС + ВБ + ДС - ВБ -ДС + ВБ + ДС - ВБ -ДС +
Количество образцов, n 8 2 5 7 2 7
были протестированы в ЛИА. По данным за II квартал 2006 г., всего было выдано 200 «неопределенных» ответов (0,18% из 111508 исследованных образцов сывороток крови пациентов ЛПУ), что составило 2,48% от количества первично (условно)-положительных образцов (8047).
Анализ полученных данных привел к разработке алгоритма массового исследования сыворотлк крови на наличие анти-ВГС, представленного на схеме 1. Серым фоном выделены результаты, которые с уверенностью можно сообщать после положенного по приказу МЗ РФ [2] двухэтапного исследования. Критическая оценка прочих результатов способствовала разработке следующей последовательности действий:
1. образцы сывороток с низкопозитивными результаты в первой подтверждающей ИФТС дополнительно исследовались в ИФТС другого производителя. При получении во второй подтверждающей ИФТС высокопозитивных результатов сообщалось об обнаружении анти-ВГС в данных образцах;
2. образцы сывороток, которые в двух ИФТС прошли с одинаковым низкопозитивным результатом, дополнительно исследовались в ИФТС с раздельным определением антител к 4 АГ ВГС (Core, NS3, NS4, NS5). При сообщении ответа указывалось, какие именно антитела и с каким коэффициентом позитивности были обнаружены;
3. при соответствии полученных результатов критериям неопределенного ответа, указанным в инструкции ИФТС, ответ сообщался как неопределенный с указанием, какие именно антитела и с каким коэффициентом позитивности были обнаружены;
4. при противоречивых результатах в двух подтверждающих ИФТС для исследования образца использовался ЛИА или иммуноблот, ответ сообщался с указанием название и серии использованной референсной ТС.
Данный алгоритм позволяет получать адекватный результат, в том числе и в отношении образцов, которые с помощью современных ТС не могут быть определены однозначно как содержащие или не содержащие анти-ВГС. Введение
формулировки «неопределенный результат
исследований на наличие анти-ВГС» повышает достоверность сообщаемого результата исследований, но несколько снижает диагностическую значимость теста определения анти-ВГС в сложных случаях. В целом это отражает место данного вида лабораторных исследований как части комплекса мероприятий при диагностике вирусного гепатита С.
Литература.
1. Богуш П. Г., Редченко Е. Б., Потапова А.А. и др. Распространение антител к вирусу гепатита С среди различных групп риска в Москве. клин. дерматол. и венерол. 2004; 1:19-21.
2. Приказ МЗ РФ №322 от 21.10.2002 г. «О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HEsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека».
3. Кузина Л.Е., Ястребова О.Н., Садикова Н.В. и др. Сравнительная оценка результатов определения антител к вирусу гепатита С при использовании различных иммуноферментных тест-систем и подтверждающих тестов. Вопр. Вирусол. 2004; 6:41-44.
4. Потапова А.А., Богуш П.Г., Редченко Е.Б., Гусев А.С. Опыт исследования проб-лемных сывороток крови на наличие антител к вирусу гепатита С в скрининговой лаборатории г. Москвы. Успехи соврем естествознания 2004; 6; Приложение 1:173-174.
5. Courouce AM, Noel L, Barin E, et al. A comparative evaluation of the sensitivity of five anti-hepatitis C virus immunoblot assay. Vox Sang 1998; 74(4):217-224.
6. Suslov AP, Kuzin SN, Golosova TV, et al. Limits of diagnostic accuracy of antihepatitis Cvirus antibodies detection by ELISA and immunoblot assay. Russ J Immunol 2002; 7(2):176-184.
7. Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus. MMWR Recomm Rep 2003; 52(RR-3):1-13.
Примечание к схеме 1.
Величины КП анти-Соге и КП анти-КБ ВГС, рассматриваемые как пограничные для проведения повторного подтвер-ждающего исследования, рассчитываются для конкретных ИФТС.
Схема 1. Алгоритм исследования сывороток крови на наличие анти-ВГС в скрининговой лаборатории.
Не обнаружены анти-ВГС негативный ответ
Обнаружены анти-ВГС
2 этап (обязательный по приказу МЗ РФ №384 от 30.10.2000 г.) - использование
подтверждающих ТС с раздельным тестированием АТ к Core- и NS-белкам
1.Не обнаружено АТ к Core- и NS-белкам: негативный ответ
2. Обнаружены только
АТ^ге-ЗГС
3. Обнаружены
только
АТ-Ш-ВГС
4. Обнаружены
АТ-Core- ВГС и АТ-Ш-ВГС
3
Л
а
и
н
и
н
и
р
к
с
С 'S
ы н
и в
3 Л и
т
и
w
п о
С п
« те
и в
р т
С о
о
1-4
м
Si о U
-
Н
* 1
1 § * §
аза то
кы ун
о S о £
ну « &
оа
£ I
о О и ^
Обнаружены АТ^ге-ЗГС ответ позитивный,
возможно с уточнением «Обнаружены только
АТ-Core ВГС»
3 этап
исследования (дополнительный)
использование подтверждающей ТС другого производителя
----Ч—
Не обнаружены АТ-NS-ВГС. Требуются дополнительные исследования в иммуноблоте
4 этап исследования (дополнительный): с
использованием подтверждающей ТС «спектр»
ответ по инструкции к ТС «спектр» с указанием вида обнаруженных АТ-Ж
С в
Г я
В- и н
S- а
-NS в о
-Т д е
А есл
и с и
С е
Г В- ы н
reo ь ьел
C те
- -Т и н
А л
ы н о п о е те
е д о
же я
у с
р т о
а н ю н >
б о бу
е ч и
е Не еТр
С
Г В-
S-
-N -Т
А
и
С Г
В er o C
-Т
А
ыи
нз
ежн поз
у
рт ае
нв
бт О от
