CC BY
24
ПИСЬМА В РЕДАКЦИЮ
УДК 616.36-008.52
ВОЗРАСТНОЙ АСПЕКТ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С
A.A. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, *Э.Ю. Сариди, *Е.Ю. Варламова
Лаборатория по диагностике ВИЧ-инфекции КВКД № 1 ДЗ Москвы, *Гематологический научный центр РАМН, Москва
Ключевые слова: антитела к вирусу гепатита С, распространение, пожилые пациенты, ложноположительные реакции Key words: hepatitis C virus antibodies, prevalence, elderly patients, false-positive reactions
В последние годы вирус гепатита С (ВГС) рассматривается как причина второй по величине и значимости эпидемии вирусной этиологии после ВИЧ-инфекции и как наиболее частая причина острых вирусных гепатитов у пожилых людей [10]. Распространенность данного заболевания отражает частота, с которой антитела к ВГС (анти-ВГС) встречаются среди населения региона. В частности, среди населения Москвы, обратившегося в лечебно-профилактические учреждения в 2002 г., антитела к ВГС встречались в 5,86% образцов [2]. Определение антител в сыворотке крови проводится с помощью высокочувствительного и специфичного метода иммуноферментного анализа, который является основой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Однако среди исследуемых образцов неизбежно встречаются такие, для которых в пределах этого метода невозможно определиться с окончательным — положительным или отрицательным — ответом о присутствии анти-ВГС в сыворотке крови. При некоторых патологических состояниях (аутоиммунные болезни, ревматоидный артрит, гиперглобулинемия и парап-ротеинемия) увеличивается частота, с которой встречаются «проблемные» сыворотки [3,4]. Известно, что при обследовании лиц пожилого возраста, как правило, имеющих различные за-
болевания, часто возникают проблемы лабораторной диагностики [7]. Учитывая распространенность и тяжесть последствий (в том числе и социальных) вирусного гепатита С, адекватную лабораторную диагностику данной инфекции у людей пожилого возраста можно отнести к первоочередным задачам, от решения которых зависит улучшение их медицинского обслуживания. В представленной работе проанализировано распространение антител к ВГС среди пожилых людей в Москве и представлен опыт исследования «проблемных» сывороток, полученных от лиц пожилого возраста.
Клинико-иммунологическая лаборатория по диагностике ВИЧ-инфекции кожно-венероло-гического клинического диспансера № 1 КЗ Москвы обслуживает 285 разнообразных лечебно-профилактических учреждений. Для выявления инфицирования крови ВГС, согласно приказам КЗ Москвы и МЗ РФ [8,9] использованы тест-системы, основанные на методе твердофазного иммуноферментного анализа. Для первичного определения антител к ВГС были использованы скрининговые тест-системы ИФА-anti-HCV (НПО Диагностические системы, Н.-Новгород) и Гепаскрин С (БТК Биосервис). Дополнительными скрининговыми системами были Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2
(BIO-RAD, Франция) и Мюрекс anti-HCV (Abbott, США). Обязательное подтверждение положительных результатов проводили с помощью тест-систем с раздельной сорбцией core и NS антигенов РекомбиБест анти-ВГС-под-тверждающий тест (ЗАО Вектор-Бест, Новосибирская обл., пос. Кольцово) и ВГС-ДСМ-под-тверждающий тест (НПО Медико-биологический союз, г. Новосибирск). Для исследования некоторых сывороток крови использовали также 2 тест-системы типа линейного иммуноблота (тест-полоски): INNO-LIA HCV Ab III update (Innogenetics, Бельгия) и Decisan (BIO-RAD, Франция).
Раскапывание сыворотки и внесение реагентов проводилось вручную с помощью пипеток фирмы Biolit. Промывка планшетов проводилась с помощью промывателя фирмы Sanofi (Франция). Определяли оптическую плотность (ОП) образцов в ходе иммуноферментного анализа с помощью ридера PR 2100 (Sanofi, Франция). Рассчитывался коэффициент позитивности (КП) как отношение оптической плотности образца (ОП обр.) к ОП критической (ОП кр.).
Количественное определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле агарозы с использованием моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека (ИмБио, Россия).
Определение фракций белка в сыворотке крови проводили методом электрофореза в геле ага-розы на системе Beckman-Paragon (США) c использованием наборов Gel Protein100 (Cormay, Польша), согласно инструкциям фирм-изготовителей. Концентрацию белка в различных фракциях определяли методом денситометрии на аппарате Appraise Densitometer System (Beckman, США).
Циркулирующие иммунные комплексы выявляли осаждением в растворе полиэтиленгли-коля по методу В. Гашковой [12].
Статистическая обработка материала выполнена с помощью компьютерных программ MS Excel и др. [1]. Средние значения показателей приведены с величиной среднеквадратичного отклонения (X ± а).
Массовый скрининг крови на наличие анти-ВГС, согласно приказам Департамента здравоохранения и Центра госсанэпиднадзора Москвы [8,9] проводится как в контингентах с высоким риском заражения парентеральными вирусными гепатитами, так и среди остального населения, обратившегося в ЛПУ Москвы. В табл. 1 представлены результаты скрининга за 1 неделю в мае (2004 г.) — срок, в который практически все прикрепленные к лаборатории ЛПУ доставляют материал на исследование. Согласно данным, представленным в табл.1, сыворотка крови пациентов старше 60 лет составляет примерно 18,5% всех образцов, направляемых на исследование в скрининговую лабораторию. Обнаружено, что в данной возрастной группе антитела к ВГС распространены в 2,58 раза меньше, чем в группе лиц моложе 60 лет (соответственно 2,72 и 7,03%, p < 0,001).
Кроме того, при анализе результатов, полученных на 2-х этапах исследования — в первичном скрининге и при подтверждении первично-положительных результатов в конфирматорной тест-системе Рекомби-Бест анти-ВГС-под-тверждающий тест был ниже в группе лиц старше 60 лет, чем в более молодой группе (соответственно 74,29 и 95,79%, р < 0,005). Иными словами, в старшей возрастной группе не подтвердилось большее количество результатов, положительных в первичном скрининге.
Таблица 1
Распространение антител к ВГС среди людей старше и моложе 60 лет
Этапы исследования Пациенты
все моложе 60 лет старше 60 лет
Первичный скрининг, п, % Положительные сыворотки в первичном скрининге, п, % Подтвержденные положительные сыворотки, п, % Всего подтверждения, % 5167 (100) 344 (6,66) 322 (6,23) 93,6 4211 (81,49) 309 (7,34) 296 (7,03) 95,79 956 (18,51) 35 (3,66) 26 (2,72*, р < 0,001) 74,29* (р < 0,005)
Примечание. * — Отличие от результатов в группе лиц моложе 60 лет, п — количество сывороток.
При использовании другой конфирматор-ной системы (ДСМ-подтверждающий тест комплект 1) проявилась та же закономерность. А именно, из 1662 сывороток, положительных в первичном скрининге в мае 2003 г., 1457 принадлежали людям моложе 60 лет, и из них не подтвердились как положительные в конфирма-торной тест-системе ДСМ подтверждающий тест 175 сывороток (12,01%). Из 205 сывороток людей старше 60 лет, положительных в скри-нинговой тест- системе, не подтвердились как положительные в конфирматорной тест-системе 67 (32,68%). Таким образом, количество не подтвержденных в данной конфирматорной тест-системе первично-позитивных результатов в группе людей старше 60 лет также было выше, чем в группе людей моложе 60 лет (р < 0,001).
В группах пациентов старше и моложе 60 лет было определено количество низкопозитивных сывороток. К ним были отнесены сыворотки, которые и в скрининговой, и в конфир-маторной тест-системе проходили с низкой оптической плотностью, не более чем в 3 раза превышающей величину плотности критическую, т. е. с коэффициентом позитивности <3. Из 1420 проб, положительных в первичной скрининговой тест-системе ИФА-апИ-ИСУ (НПО Диагностические системы, Н.-Новгород) и в подтверждающей тест-системе ВГС-ДСМ-подтверждающий тест (НПО МБС, г. Новосибирск) в мае 2003 г., 1282 сыворотки принадлежали людям моложе 60 лет, и из них низкопозитивными были 111 (8,66%). Из 138 сывороток крови людей старше 60 лет, положительных в этих друх тест-системах, низкопозитивной была 21 проба (15,21%). Таким образом, в группе лиц старше 60 лет количество образцов сыворотки крови с низкой оптической плотностью было больше, чем в группе пациентов моложе 60 лет (р < 0,05).
Известно, что при исследовании сывороток с низкой оптической плотностью повышен риск выдачи ложноположительного ответа, поэтому рекомендуется дополнительно исследовать такие сыворотки [15]. Несмотря на то, что по величине плотности между группами низкопозитивных сывороток пожилых и более молодых людей не было различий, при анализе этих сывороток с помощью тест-систем были получены различные результаты. А именно, при исследовании низкопозитивных сывороток в дополни-
тельных тест-системах Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2 (BIO-RAD, Франция) и Мюрекс anti-HCV (Abbott, США) в группе людей старше 60 лет положительных результатов (23,5%) было меньше, чем в группе людей моложе 60 лет (50%, р < 0,05).
Для снижения вероятности выдачи ложного результата исследователи предлагают учитывать значение коэффициентв плотности [15]. При исследовании 117 «проблемных» сывороток с помощью 3-й тест-системы Monolisa anti-HCV PLUS. Version 2 78 сывороток прошли как отрицательные, 39 — как положительные. В подгруппе сывороток, отрицательных в тест-системе Monolisa anti-HCV, обнаружилась тенденция слабой положительной связи между возрастом и велициной коэффициента плотности анти-NSg 4 5 (коэффициент линейной корреляции Пирсона равен 0,21). Сыворотки пожилых пациентов с противоречивыми результатами в иммунофер-
ментном анализе по анти-NS^ , к или с низким
3 , 4 , 5
коэффициентом плотности по анти-^з 4 5 были проверены в подтверждающих тест-системах типа линейного иммуноблота. Четыре сыворотки пожилых пациентов были протестированы с помощью тест-полосок INNO-LIA, 3 из них признаны отрицательными, одна — неопределенной; три сыворотки были протестированы с помощью тест-полосок Deciscan, все признаны отрицательными.
Дополнительные исследования были проведены для выявления различий по содержанию некоторых компонентов, которые способны влиять на результаты иммуноферментного анализа, между отрицательными, неопределенными (с противоречивыми результатами исследования) и положительными на анти-ВГС пробами пожилых пациентов.
Было обнаружено, что количество циркулирующих иммунных комплексов в отрицательных, неопределенных (с противоречивыми результатами исследования) и положительных на анти-ВГС сыворотках крови не превышало нормы, установленной для людей среднего возраста (140 ед.). В то же время в группе положительных на анти-ВГС сывороток пожилых людей количество циркулирующих иммунных комплексов было повышено (6 человек, 80,83 ± 44,37 ед, p < 0,05) по сравнению с отрицательными (11 человек, 44,1 ± 12,3 ед) и неопределенны-
ми сыворотками (8 человек, 48,4 ± 17,3 ед) пожилых пациентов.
При определении фракций белка обнаружено (табл. 2), что в группе с противоречивыми результатами при тестировании на анти-ВГС содержание а1-фракции (4,61 ± 0,67%) в сыворотке крови было повышено по сравнению с группой положительных на анти-ВГС сывороток (3,81 ± 0,3%, р < 0,05) и превышало норму (1,3—3,9%). По содержанию альбумина, а2-, р- и у-глобулинов различий между группами не было. Ни в одном из образцов на электрофорег-рамме не было выявлено моноклональной гам-маглобулинопатии.
Изучение клинико-эпидемиологических особенностей гепатита С в старшей возрастной группе населения в настоящее время является одним из важных направлений исследований [3]. Сопоставление распространения антител к ВГС среди пожилых и более молодых людей в разных странах привело к различным выводам. Так, в ряде стран распространенность антител к ВГС среди пожилых людей оказывается такой же, как среди остального населения, как, например, в Канаде, где она составляет 1,4% [13]. Увеличение распространенности анти-ВГС с возрастом обнаружено среди доноров крови в Италии: от 0,6% в возрастной группе 18—28 лет до 2,5% у людей старше 60 лет [14]. Среди населения г.Токио самая высокая распространенность анти-ВГС наблюдалась в группе людей старше 60 лет (3,1%) по сравнению с показателем в общей группе 1,3% [16]. В США в 2002 г. анти-ВГС были распространены среди 1,8% всего населения, при этом в группе людей 41—59 лет распространенность данного маркера ВГС-инфекции было выше, чем среди людей старше 60 лет [3]. В России среди доноров кро-
ви (исследованы 374 человека в Московской области) в возрастной группе старше 50 лет не было обнаружено ни одного человека с антителами к ВГС, у 2 человек (3,1%) выявлен HBsAg [6]. По результатам нашего исследования, распространенность антител к ВГС среди лиц старше 60 лет в Москве (2,72%) в 2 раза ниже, чем среди людей моложе 60 лет. По данным литературы, главным фактором риска заражения гепатитом С у пожилых людей являются проведенные ранее (до 1992 г.) гемотрансфузии [10].
Дополнительные фактора риска были описаны для такого специфического возрастного контингента, как ветераны вьетнамской войны в США (частота анти-ВГС 17,7%): потребление в прошлом наркотических препаратов, татуировки, принадлежность к военному медперсоналу, пребывание в заключении более 48 ч, более 15 половых партнеров за жизнь и сексуальные отношения с проститутками, причем последний из перечисленных рисков недостоверен [11] . Возможно, эти факторы риска могут иметь определенное значение в заражении в прошлом ВГС-инфекцией и других лиц пожилого возраста.
Анализ на наличие антител к ВГС осложнен тем, что даже при использовании высокоспецифичных тест-систем при исследовании некоторых сывороток возникает риск ложноположи-тельного ответа. По данным литературы, известны группы пациентов, в которых наиболее часто возникают трудности при определении антител к ВГС [3,4].
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что к группе риска ложноположитель-ного ответа при анализе сыворотки на наличие антител к ВГС относятся и пожилые люди. Во-первых, сыворотка лиц этого контингента чаще не подтверждается как положительная в
Таблица 2
Фракции белка, % (М ± ст), в сыворотке крови пожилых пациентов с положительными, отрицательными и неопределенными результатами исследования на антитела к ВГС
Фракция белка Сыворотки по наличию анти-ВГС Интервал нормы
отрицательные п = 11 неопределенные п = 7 положительные п = 7
Альбумин ^-Глобулины а2-Глобулины в-Глобулины у-Глобулины 58,14 ± 3,78 4,08 ± 0,6 10,41 ± 2,03 12,84 ± 1,7 14,53 ± 2,16 56,76 ± 4,63 *4,61 ± 0,67 (р < 0,05) 9,63 ± 1,81 11,6 ± 1,47 17,4 ± 2,84 56,34 ± 3,56 3,81 ± 0,3 9,24 ± 1,29 12,13 ± 1,25 18,47 ± 2,46 52,4—69,4 1.3—3,9 5.4—11,6 9,0—17,4 9,3—20,3
Примечание. * — отличие от группы сывороток, содержащих анти-ВГС.
необходимом по приказу повторном исследовании в утвержденных конфирматорных тест-системах. Во-вторых, у этих лиц сыворотка чаще имеет низкую оптическую плотность, для которой характерно расхождение результатов при исследовании в нескольких тест-системах, и для определения ответа по которой введено интегральное понятие — диагностический консенсус [15]. При исследовании таких сывороток в дополнительных тест-системах в группе людей старше 60 лет в нашей работе положительных результатов было в 2 раза меньше, чем в группе людей моложе 60 лет.
При исследовании различий по другим компонентам сыворотки в образцах позитивных, «неопределенных» и негативных на наличие ан-ти-ВГС количество циркулирующих иммунных комплексов не превышало норму. В «неопределенных» сыворотках, в отличие от позитивных на анти-ВГС и негативных сывороток, было повышено содержание aj-глобулинов, к которым относятся белки острой фазы воспаления с ан-типротеазной активнстью. Известно, что повышенное содержание aj-глобулинов характерно не только для хронического гепатита, но и для ревматоидного артрита, системной красной волчанки, болезни Крона, метастазов опухолей [5], т. е. для заболеваний, при которых наблюдаются ложноположительные реакции на антитела к ВГС.
Таким образом, тестирование на анти-ВГС должно включать не только скрининговое и при наличии положительного результата — подтверждающее исследование, но при низкой оптической плотности сыворотки и принадлежности к группе риска — исследование в более специфических тест-системах, в первую очередь иммуноблот, для минимизации психологической травмы и социальных последствий для людей с ложноположительными результатами тестирования.
В проведенных исследованиях установлено, что антитела к ВГС обнаруживаются в 2,72% сывороток крови пожилых людей, направляемых на исследование в скрининговую лабораторию Москвы, т. е. в 2,58 раза реже, чем в сыворотках пациентов моложе 60 лет. Лица старше 60 лет являются группой риска ложноположи-тельного результата при исследовании сыворотки крови методом иммуноферментного анализа на антитела к ВГС, особенно в случае низкопо-
зитивного результата только в отношении ан-ти-NSg 5. Тест-системы типа иммуноблот являются полезным дополнительным методом при исследовании образцов с противоречивыми результатами при массовом скрининге сыворотки крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бенсман В.М. Облегченные способы статистического анализа в клинической медицине. Краснодар; 2002. 32.
2. Богуш П.Г., Редченко Е.Б., Потапова А.А. и др. Распространение антител к вирусу гепатита С среди различных групп риска в Москве. Клин. дерматол. и ве-нерол. 2004; 1: 19-21.
3. Гепатит С: консенсус 2002. Национальный институт здоровья США, 10-12 июня 2002 г. Мир вирусных гепатитов. 2002; 7-8: 2-15.
4. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов. Метод. Рекомендации. М.: Изд-во Воен.-мед. академии; 2002. 47.
5. Долгов В.В., Шевченко О.П. Лабораторная диагностика нарушений обмена белков. Пособие для врачей. М.; 1997. 68.
6. Каира А.Н., Фролова Г.С. Контроль инфицирован-ности вирусами гепатитов В и С доноров крови в Московской области. Эпидемиол. и инфекц. бол. 2002; 3: 31-33.
7. Лапин А. Лабораторная диагностика в геронтологии. Лабораторная медицина 2003; 6: 14-20.
8. О применении в практике здравоохранения иммуно-ферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека. Приказ КЗ г.Москвы МЗ РФ № 384 от 30.10.2000 г.
9. О применении в практике здравоохранения иммуно-ферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека. Приказ МЗ РФ № 322 от 21.10.2002.
10. Подымова С.Д., Азов А.Г. Вирусные гепатиты у пожилых пациентов. Особенности эпидемиологии, клинической картины, профилактики и лечения. Вирусные гепатиты 2001; 1(11): 3-12.
11. Briggs M.E., Baker C., Hall R et al. Prevalence and risk factor for hepatitis C virus infection at an urban veterans administration medical center. Hepatology. 2001; 34(6): 1200-1205.
12. Rina I., Haskova V., Kaslik J. et al. The use of polyeth-ylenglycol for immune complex detection in human sera. Mol. Immunol. 1979; 16(7): 489-493.
13. Simor A.E., Gordon M., Bishai F.R. Prevalence of hepatitis B surface antigen. Hepatitis C antibody, and HIV-1 antibody among residents of a long-term care facility. J. Amer. Geriatr. Soc. 1992; 40 (3): 218-220.
14. Sirchia G., Almini D., Bellubuono A. et al. Prevalence of hepatitis C virus antibodies in Italian blood donors. Vox Sang. 1990; 59(1): 86-88.
15. Suslov A.P., Kuzin S.N., Golosova T.V. et al. Limits of diagnostic accuracy of anti-hepatitis C virus antibodies detection by ELISA and immunoblot assay. Russian J. of Immunol. 2002; 7(2): 176-184.
16. Watanabe J., Minegishi K., Mitsumori T. et al. Prevalence of anti-HCV antibody in blood donors in the Tokyo area. Vox Sang. 1990; 59(2): 86-88.
Поступила 25.11.2004
