CC BY
2
2024 Т. 54 № 3 / Техника и технология пищевых производств / Food Processing: Techniques and Technology
ISSN2074-9414 (Print) ISSN 2313-1748 (Online)
https://doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2523 Оригинальная статья
https://elibrary.ru/SHQHRU https://fptt.ru
Анализ отношений стабильных изотопов легких элементов в отдельных компонентах мёда
(!)
Л. А. Оганесянц1 , А. Л. Панасюк1 , Д. А. Свиридов1 , М. Ю. Ганин1* , А. А. Шилкин1 , О. В. Серебрякова2
1 Всероссийский научно-исследовательский инститит пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности^^, Москва, Россия
2 Научный центр пчеловодства, Рыбное, Россия
Поступила в редакцию: 10.04.2024 *М. Ю Ганин: [email protected],
Принята после рецензирования: 13.05.2024 https://orcid.org/0000-0003-0518-1181
Принята к публикации: 04.06.2024 Л. А. Оганесянц: https://orcid.org/0000-0001-8195-4292
А. Л. Панасюк: https://orcid.org/0000-0002-5502-7951 Д. А. Свиридов: https://orcid.org/0000-0002-5595-0455 А. А. Шилкин: https://orcid.org/0000-0003-1223-0703 О. В. Серебрякова: https://orcid.org/0000-0002-8337-2322
© Л. А. Оганесянц, А. Л. Панасюк, Д. А. Свиридов, М. Ю Ганин, А. А. Шилкин, О. В. Серебрякова, 2024
Аннотация.
Мёд, благодаря своим органолептическим качествам и питательным свойствам, является ценным ингредиентом в пищевой промышленности. Однако мёд стал одним из самых фальсифицируемых продуктов. Нарушение технологии при производстве мёда является одной из главных проблем, угрожающих стабильному развитию и деятельности пчеловодческой отрасли. Разработка способов определения подлинности мёда и продуктов на его основе является востребованным направлением исследований. С целью идентификации мёда авторами проведен анализ отношений стабильных изотопов легких элементов в его отдельных компонентах.
В ходе исследования изучили 36 образцов мёда различного географического и ботанического происхождения, а также 5 образцов сахарных сиропов из различного сырья. Для установления числовых значений показателей изотопных характеристик легких элементов применяли изотопный масс-спектрометр Delta Advantage V (США - Германия), с дополнительными модулями Flash IRMS и Conflo IV.
В исследуемых образцах измерили значения показателей отношений стабильных изотопов углерода: в мёде (брутто) ¿13С и азота ¿15N в его белковой фракции, а также показатели ¿13C, ¿18О и ё2Н этанола, выделенного из ферментированного мёда. Анализ значений показателей ¿13С брутто и ё13С белковой части меда позволяет рассчитать количество внесенных сахаров, полученных из кукурузы и тростника. В двух образцах были обнаружены экзогенные сахара в количестве 6,5 и 18 % в пересчёте на тростниковый сахар.
Проведенные исследования показали, что использование метода изотопной масс-спектрометрии позволяет выявить образцы мёда, содержащие экзогенные сахара. На основании методики AOAC 998.12., в 2 образцах мёда из 36 было выявлено присутствие экзогенных сахаров из С4-типа растений. Однако данный метод не позволяет выявить присутствие внесенных сахаросодержащих веществ из С3-типа растений. Были проведены исследования значений показателей ¿13C, ¿18О и ё2Н этанола, выделенного из ферментированного мёда. Установлено, что показатель ¿18O может выступать в качестве идентификационного критерия при установлении присутствия сахаров из С3-типа растений в меде. Изучение отношений изотопов азота в белковой части мёда может быть полезным инструментом для определения его подлинности и дополнительным критерием идентификации пчеловодческой продукции. В ходе работы был получен патент (RU2809285C1) по определению экзогенных сахаросодержащих веществ в пчелином мёде.
Ключевые слова. Мёд, продукты пчеловодства, идентификация, фальсификация, изотопная масс-спектрометрия легких элементов
Для цитирования: Анализ отношений стабильных изотопов легких элементов в отдельных компонентах меда / Л. А. Оганесянц [и др.] // Техника и технология пищевых производств. 2024. Т. 54. № 3. С. 522-531. https://doi.org/ 10.21603/2074-9414-2024-3-2523
https://doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2523 Original article
https://elibrary.ru/SHQHRU Available online at https://fptt.ru/en
Light Stable Isotopes and Their Ratios in Honey Components
<8>
Lev A. Oganesyants1 , Alexander L. Panasyuk1 ,
Dmitriy A. Sviridov1 , Mikhail Yu. Ganin1* , Alexey A. Shilkin1 , Oksana V. Serebryakova2
1 All-Russian Research Institute of Brewing Non-Alcoholic and Wine Industry"Pi*, Moscow, Russia 2 Scientific Center of Beekeeping, Rybnoye, Russia
Received: 10.04.2024 *Mikhail Yu. Ganin: [email protected],
Revised: 13.05.2024 https://orcid.org/0000-0003-0518-1181
Accepted: 04.06.2024 Lev A. Oganesyants: https://orcid.org/0000-0001-8195-4292
Alexander L. Panasyuk: https://orcid.org/0000-0002-5502-7951 Dmitriy A. Sviridov: https://orcid.org/0000-0002-5595-0455 Alexey A. Shilkin: https://orcid.org/0000-0003-1223-0703 Oksana V. Serebryakova: https://orcid.org/0000-0002-8337-2322
© M.Yu. Ganin, L.A. Oganesyants, A.L. Panasyuk, D.A. Sviridov, A.A. Shilkin, O.V. Serebryakova, 2024
Abstract.
Honey possesses excellent sensory and nutritional properties, which makes it a valuable food ingredient. However, the same qualities make it one of the most often adulterated products in the world. Constant violations of processing technology threaten the beekeeping industry. In this regard, new authenticity criteria are a popular area of honey studies. The article introduces a method for establishing ratios of light stable isotopes in honey.
The study featured 36 samples of honey of various geographical origins and botanical profiles, as well as five samples of sugar syrups from various raw materials. The quantitative profiles were obtained using a Delta Advantage V isotope mass spectrometer (USA - Germany) with additional Flash IRMS and Conflo IV modules.
The experiment involved the ratios of stable carbon isotopes in honey ¿13C (gross) and nitrogen ¿15N in its protein fraction, as well as the values of ¿13C, ¿18O, and S2H of ethanol isolated from fermented honey. The values of ¿13C (gross) and ¿13C of honey proteins made it possible to calculate the amount of added sugar of corn and cane origin. Exogenous sugars in the amounts of 6.5% and 18% cane sugar were detected in two samples.
Isotope mass spectrometry was able to identify honey samples with exogenous sugars of C4-plant origin. However, the method failed to detect sugar-containing substances from C3-type plants. The ¿18O index demonstrated some prospects as an identification criterion for sugars from C3-plants in honey. Nitrogen isotope ratios in honey proteins proved to be an efficient tool for determining honey authenticity and an additional criterion for identifying bee products. The research resulted in a patent (RU2809285C1) for a new method of determining exogenous sugar-containing substances in honey.
Keywords. Honey, bee products, identification, falsification, isotope mass spectrometry
For citation: Oganesyants LA, Panasyuk AL, Sviridov DA, Ganin MYu, Shilkin AA, Serebryakova OV. Light Stable Isotopes and Their Ratios in Honey Components. Food Processing: Techniques and Technology. 2024;54(3):522-531. (In Russ.). https:// doi.org/10.21603/2074-9414-2024-3-2523
Введение
Мёд - природный продукт, обладающий высокой физиологической ценностью. Физико-химический состав мёда представлен углеводной составляющей (в первую очередь, глюкоза и фруктоза), водой, небольшим количеством белков, минералов, витаминов, ферментов, органических кислот и аминокислот. Следует отметить, что пчелиный мёд ценен в силу его антиоксидантных и противомикробных свойств [1]. Однако мёд стал одним из самых фальсифицируемых
продуктов в мире. Недавнее исследование, проведенное Объединенным исследовательским центром в Европейском Союзе, показало, что из 320 проб мёда, взятых на границах Европейского союза, 46 % образцов, вызвали серьезные сомнения в их подлинности [2]. Из-за мирового спроса и высокой цены на мёд, добавление более дешевых инвертных сиропов, производимых из тростникового сахара, кукурузы и риса, а также неправильная маркировка географического происхождения являются одними из распространенных мошеннических
практик на международных и отечественных рынках [3]. Фальсификация и неправильное указание ботанического и географического происхождения мёда будут иметь и негативные экономические последствия для производителей натурального мёда, желающих работать в честной конкуренции. Производство мёда, не отвечающего установленным требованиям, угрожает эффективной деятельности и даже выживанию пчеловодческой отрасли [4].
Необходимо отметить, что мёд используется не только в свежем виде, но также является ингредиентом при производстве выпечки, десертов, а также напитков, таких как медовуха, сбитни, медовая комбуча и др. Поэтому проведение исследований, направленных на определение критериев, подтверждающих подлинность мёда и продуктов на его основе, является ключевым для обеспечения населения качественной пищей и защиты интересов честных производителей пчеловодства.
Решение вопросов обеспечения качества и безопасности пищевой продукции является приоритетной задачей, стоящей перед контролирующими органами исполнительной власти. Из-за сложности химической структуры и большого разнообразия сортов мёда, трудно определить, является ли мёд натуральным или поддельным. С другой стороны, с увеличением количества подделок возникает необходимость внедрения новых современных методов по обнаружению различного рода фальсификаций.
Можно выделить следующие, наиболее распространенные способы подделки (фальсификации) мёда:
- фальсификация путем добавления воды в мёд с целью увеличения его количества;
- фальсификация путем добавления различных саха-росодержащих веществ в мёд с целью увеличения его количества;
- фальсификация при производстве мёда путем кормления пчел сахарными сиропами;
- фальсификация путем нагревания мёда, искусственно создавая более привлекательный вид;
- фальсификация путем производства искусственного мёда (подделки) под видом натурального;
- ассортиментная фальсификация (неверное указание ботанического и географического происхождения).
Среди указанных видов фальсификации наиболее широкое распространение получили подделки, произведенные путем внесения сахаросодержащих веществ непосредственно в продукт. Показатели физико-химического состава фальсифицированных образцов, в том числе соотношение глюкозы и фруктозы соответствует аналогичным показателям натурального мёда, что значительно усложняет процесс идентификации. Часто практикуется кормление пчёл во время основного сбора нектара с целью увеличения урожайности мёда в ульях. Сахароза расщепляется до глюкозы и фруктозы при помощи инвертазы, содержащейся в натуральном мёде. Такие сахарные вещества счи-
таются наиболее подходящим для пчел, так как легко перерабатывается насекомыми и позволяют добиться увеличения объема выделяемого мёда пчёлами. В таком случае обнаружить данный факт подкормки становится сложнее. В России подобная практика, при которой конечный продукт не соответствует юридическому определению мёда, установленному новыми поправками в Федеральном законе N° 490-ФЗ «О пчеловодстве в Российской Федерации» не редкость. Для указанных методов фальсификации обычно применяются недорогие виды сахара или промышленные сиропы. Наиболее популярные сахарные добавки это различного рода сиропы, среди которых стоит выделить такие как, кукурузный сироп CS, сироп глюкозы GS, сироп сахарозы, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы HFC, инвертный сироп IS с высоким содержанием фруктозы HFIS, получаемый из сахарного тростника или сахарной свёклы [5]. Добавление данных сиропов к мёду с целью удешевления его производства приводят к изменению некоторых физико-химических и биохимических контролируемых показателей, таких как активность нативных ферментов, снижение содержания аминокислоты пролина, золы. Однако при анализе этих показателей необходимо учитывать естественную изменчивость. Некоторые химические показатели, такие как содержание оксиметилфурфуроля, ранее использовавшиеся для определения наличия инвертных сиропов в мёде, могут давать неоднозначные результаты. Дело в том, что оксиметилфурфурол и ферментативная активность могут различаться в разных типах мёда и могут изменяться в образцах при нагревании или неправильном хранении в теплой среде [6].
На сегодняшний день, при выявлении фальсификатов мёда, наибольшее распространение получили следующие методы:
- физико-химический анализ и меллисопалинологи-ческий анализ пыльцы;
- методы разделения, например, определение профиля углеводов с помощью жидкостной хроматографии или газовой хроматографии;
- спектрометрические методы, в том числе жидкостной хроматографии с последующей масс-спектрометрией высокого разрешения и газовая хромато-масс-спектро-метрия для определения профиля аромата;
- спектроскопические методы, включая инфракрасное преобразование Фурье;
- спектроскопия в ближней инфракрасной области и ядерно-магнитного резонанса;
- профилирование микроэлементов с помощью масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой.
Стоит отметить, что указанные методы не позволяют дать однозначный ответ о подлинности мёда.
Одним из передовых и наиболее эффективных методов по определению как добавления экзогенных сахаросодержащих веществ, так и географического/ ботанического происхождения является метод изотопной масс-спектрометрии.
Метод изотопной масс-спектрометрии имеет ключевое значение при выявлении фальсификатов и подтверждении географического происхождения продуктов питания. Числовые значения отношений стабильных изотопов компонентов мёда (углерода, кислорода, азота и водорода) могут быть использованы для проверки указанной на этикетке маркировки (страны происхождения) и подлинности продуктов, связанной с правилами производства, например, с использованием экзогенных сахаросодержащих сиропов. Ряд стран приняли метод измерения соотношения стабильных изотопов углерода АОАС для обнаружения намеренно добавленных «растительных сахаров С 4 в мёд» [7]. Принцип метода основан на различиях в значениях изотопных характеристиках углерода (¿>13С) меда брутто (полученного из нектара растений С3) и фальсифицированного мёда (смешанного с сахаром, полученным из растений С4, например, тростниковая сахароза или инвертированный кукурузный сахарный сироп). В таких случаях разница в значениях ¿13С между совокупностью всех соединений мёда (брутто исследование) и его белковой части являются важным инструментом для качественного и количественного определения фальсификации мёда [8-10]. Авторы в статье утверждают, что вышеупомянутый метод не применим для обнаружения сахаросодержащих добавок, произведенных из растений типа С3 [11].
Значения показателей изотопных отношений углерода, азота, водорода и кислорода в перспективе могут быть полезны для аутентификации географического и ботанического происхождения, поскольку на значения изотопных характеристик легких элементов структурных компонентов мёда влияют условия окружающей среды и способы ведения сельского хозяйства [12].
В настоящей работе описаны результаты исследования образцов мёда разного географического и ботанического происхождения с использованием метода изотопной масс-спектрометрии. Рассмотрена возможность использования дополнительных критериев для определения подлинности мёда, таких как соотношение изотопов азота в белковой части мёда, а также изотопные характеристики углерода, кислорода и водорода в этиловом спирте, полученном путем ферментации исследуемых образцов различного происхождения. Данный метод получил широкое применение и доказал свою эффективность в идентификации винодельческой продукции и других алкогольных напитков, а также при выявлении фальсификации органической продукции [13-19]. Данная работа является продолжением исследования по идентификации пчеловодческой продукции, но с большей выборкой образцов, а также более широким географическим охватом [19].
Объекты и методы исследования
Были изучены и проанализированы 36 образцов мёда из различных регионов (РФ, США и Австралии), а также 5 различных сиропов, произведенных из кукурузы, риса, свекловичного и тростникового сахара, а
также из мелассы. По ботаническому происхождению образцы мёда были заявлены как липовый, акациевый, гречишный, падевый, женьшень, манука, кориандровый, донниковый и разнотравье.
Для выделения белковой фракции мёда использовался европейский протокол AOAC 998.12. [11, 20, 21]. В случае, когда белок не выделялся в процессе пробо-подготовки, то уже можно было говорить о признаке фальсификации [22]. Белки и свободные аминокислоты не играют значительной роли в повышении пищевой ценности мёда, так как они не являются основными компонентами этого продукта. Однако они необходимы для образования ароматических веществ, которые характерны только для мёда, так как ферменты, содержащие белки, формируют и поддерживают состав мёда. В натуральном мёде обычно содержится белковая составляющая, за исключением некоторых редких видов цитрусовых медов.
В целях установления значений соотношения изотопов углерода и азота использовался изотопный масс-спектрометр Delta Advantage V (США - Германия), с дополнительными вспомогательными модулями Flash IRMS и Conflo IV. Пробы вводились в элементный аналилизатор с помощью твердотельного автодозатора. Время анализа одной пробы занимало порядка 10 мин. В качестве эталонов использовали стандарты МАГАТЭ и геологической службы США (USGS), таких как кофеин IAEA 600, масла NBS22, вьетнамского мёда USGS82 и канадского мёда USGS83.
Для определения значений изотопных характеристик углерода, кислорода и водорода в этиловом спирте, пробы подготавливались следующим образом. Мёд или сахарные сиропы растворяли в соотношении 20 г на 100 мл воды. Для отгонки этилового спирта из полученного продукта использовались чистые и высушенные винные дрожжи. В круглодонную колбу объемом 50 см3 добавляли 25 см3 исследуемой пробы и производили экстракцию этилового спирта. Когда происходило достижение стабильной температуры паров, обычной для азеотропной смеси этанола и воды 78,2-78,5 °C, начинали сбор дистиллята, который прекращали при повышении температуры. Сбор дистиллята продолжали до полного выделения азеотропной смеси этанола и воды.
В целях установления значений изотопного состава элементов этилового спирта использовался изотопный масс-спектрометр Delta Advantage V c дополнительными модулями, описанными выше только с автосамплером для жидких проб AI-AS 1300. В качестве эталонов сравнения использовали стандарты воды МАГАТЭ-USGS и спирта: SLAP2, USGS47, VSMOW2, BCR656.
Результаты и обсуждение
В ареале обитания пчёл, как правило, произрастают растения-медоносы С3-типа фотосинтеза. Именно тип фотосинтеза растения, в первую очередь, определяет значения показателя с>13С структурных составляющих продуктов, вырабатываемых из растительного сырья.
Поэтому натуральный мёд имеет диапазон значений показателя с>13С (брутто) от -29 до -24 %о. Если мёд разбавлен сиропом, который содержит кукурузный или сахарный тростниковый сироп со средними значениями показателей с>13С от -13 до -11 %о, или если пчёлы были подкормлены сахаром, полученным из растений типа С4, то изотопный состав углерода в общих углеводах мёда будет находиться в промежутке между -29 и -11 %. Учитывая вышеизложенное, наиболее популярные и традиционные сорта мёда, такие как акациевый, липовый, гречишный и другие, должны иметь значения показателя ¿13С (брутто), характерные для высших растений типа С3. Например, в некоторых научных работах отмечается, что если значения изотопных характеристик углерода в мёде (брутто) превышают -23,5 %о, то образец становится сомнительным и требует проведения дополнительных исследований [23, 24]. Зная об этом критерии, некоторые нечестные производители мёда начали добавлять различные компоненты (содержащие сахар, искусственные подсластители, ароматизаторы, глицерин и т. д.) к мёду, чтобы значение изотопного показателя углерода в мёде (брутто) было ниже -23,5 %о. Когда сахаросодержа-щие компоненты добавляются в мёд, изотопные характеристики углерода в мёде (брутто) изменяются, но изотопные характеристики углерода в белковой части (фракции) мёда остаются неизменными. Это объясняется тем, что белок является естественным (нативным) компонентом, образующимся в процессе производства мёда, и добавление внешних сахаров не влияет на значения изотопного показателя углерода в белковой составляющей.
Согласно методике, мёд считается с добавками экзогенных сахаров, если процент содержания сахаров-сиропов, произведенных из растений С4-типа в образце, больше 7 % [23]. Для расчета содержания сахаров-сиропов в %, используется формула 1:
С4 сахара =
s°c6 -¿13см
513C6 -(-9,7)
: 100
(1)
где, ¿13См -значение ¿13С для мёда (брутто); ¿13Сб -значение ¿13С для белковой части мёда; (-9,7) - среднее значение с>13С для кукурузного сиропа.
Формула, разработанная Международной ассоциацией аналитической химии, была утверждена как основная методика. В качестве эталона для расчета был выбран кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы. Данная формула разработана для определения содержания добавок сахара мёда в странах, где есть высокое потребление сахаросодержащих веществ, произведенных из кукурузы.
В нашей стране сиропы, полученные из кукурузы, не так популярны, поскольку сахар обычно производят из сахарной свёклы и в малой степени из тростникового сахара-сырца. В предыдущей работе было предложено заменить значечрч показателей отношений изотопов углерода для кукуруз него си-опана зн ачение для тростникового сахара (сиропов) в формуле [19] (1):
(
С4 сахара =
¿13сб -¿13сь, ¿13сб -(-12)
: 100
(2)
где ¿13См - значение <513С для мёда (брутто); ¿13С6 - значение ¿13С для белковой части мёда; (-12) - среднее значение с>13С для сиропа из тростникового сахара.
На основании результатов нашей статьи можно сделать вывод, что внесение всего лишь 6 % инвертного тростникового сиропа в мёд приводит к разнице в значениях с>13С между мёдом (в целом) и его белковой фракцией в диапазоне 0,9-1 %о [19].
В ходе исследования было отобрано 36 образцов мёда разных сортов и географического происхождения. Были изучены показатели изотопных отношений углерода ¿13С в мёде (брутто) и показатели с>13С и с>15М в белковой части (фракции) мёда.
Для анализа степени добавки инвертного тростникового сиропа в образцах мёда использовалась формула (2). Итоговые значения показателей ¿13С и с>15М представлены в таблице 1.
Данные таблицы свидетельствуют о том, что значения показателя отношений изотопов углерода мёда в целом (брутто) лежат в диапазонах от -29,17 до -24,0 %, а значения с>13С белковой части от -29,17 до -24,22 %о.
Таблица1. Значения показателей <13С и <15N образцов мёда Table 1. Values of <513C and nitrogen <15N in honey samples
№ Наименование образов мёда Год сбора Место происхождения <15N-, Air' %0, белок %о, мед (брутто) ^VP^ %0, белок Степень добавки (содержание добавки тростникового инв. сиропа, %). Если менее 6 %, то «без добавления»
1 Мёд 2020 Алтайский край, пос. Березовка Усть-Коксинский район 8,72 -27,17 -27,25 без добавления
2 Мёд, Манука 2021 Австралия 4,89 -26,04 -26,16 без добавления
3 Мёд, весенний 2020 Дальний восток, Уссурийский район 5,69 -26,09 -26,05 без добавления
Продолжение таблицы 1.
№ Наименование образов мёда Год сбора Место происхождения ¿15КД., Д]г' %о, белок ¿13С %о, мед (брутто) ¿13С %0, белок Степень добавки (содержание добавки тростникового инв. сиропа, %). Если менее 6 %, то «без добавления»
4 Мёд 2020 Рязанская область, Захаровский район 5,41 -27,35 -27,28 без добавления
5 Мёд 2019 Башкирия, Уфимский район, село Николаевка 7,73 -29,17 -29,17 без добавления
6 Мёд 2019 США, штат Невада 1,46 -27,30 -27,21 без добавления
7 Мёд 2020 США, штат Аризона 5,01 -26,75 -26,67 без добавления
8 Мёд 2020 Дальний восток, Хабаровск 3,78 -26,68 -26,56 без добавления
9 Мёд, липовый 2018 Дальний Восток, Уссурийский район 5,85 -25,58 -25,52 без добавления
10 Мёд, разнотравье 2019 Дальний Восток, пос. Житково 5,37 -28,08 -28,04 без добавления
11 Падевый мёд 2018 Якутия 1,94 -26,52 -26,51 без добавления
12 Мёд, диморфант 2019 Приморский край, пос. Санаторная -0,71 -25,32 -25,60 без добавления
13 Мёд, женьшень 2020 Дальний Восток 1,54 -25,74 -25,76 без добавления
14 Мёд 2019 Дальний Восток, Леспедеция, Уссурийский район 0,69 -26,20 -26,17 без добавления
15 Мёд, падевый 2018 Якутия, г. Мирный 1,97 -27,03 -27,06 без добавления
16 Мёд, разнотравье 2019 Воронеж, пос. Алое Поле 1,85 -28,81 -28,30 без добавления
17 Мёд, лесное разнотравье 2020 Дальний Восток, Уссурийск -0,46 -26,79 -26,70 без добавления
18 Мёд, подсолнечниковый 2018 Рязанская обл. 3,10 -25,46 -25,65 без добавления
19 Мёд, кориандровый (58 % - пыльц.зерен кориандра) 2020 Краснодарский край 1,95 -25,03 -25,16 без добавления
20 Мёд, разнотравье с кориандром (23 % -пыльц.зерен кориандра) 2019 Краснодарский край 3,20 -26,60 -26,59 без добавления
21 Мёд, акациевый 2022 Краснодарский край, Александровский хутор 9,29 -24,13 -24,22 без добавления
22 Мёд, липовый 2021 Краснодарский край 6,99 -25,65 -25,68 без добавления
23 Мёд 2021 Россия 2,39 -25,86 -26,07 без добавления
24 Мёд 2021 Россия 0,37 -26,53 -26,63 без добавления
25 Мёд 2019 Чеченская республика 2,49 -24,91 -25,31 без добавления
26 Мёд 2021 Дагестан -0,61 -27,57 -27,71 без добавления
27 Мёд, разнотравье + падевый, 2019 Якутия -2,78 -26,53 -26,58 без добавления
28 Мёд, акациевый 2020 Краснодарский край, г. Сочи -2,72 -24,73 -25,02 без добавления
29 Мёд, разнотравье 2019 Смоленская область, дер. Агеевщина 3,57 -26,84 -26,76 без добавления
30 Мёд 2018 Приморский край, Уссурийская область 1,96 -26,34 -26,47 без добавления
31 Мёд, разнотравье - Киргизия, Джумгал 2,18 -26,04 -25,98 без добавления
32 Мёд, гречишный 2020 Рязань, г. Касимов 6,21 -27,39 -27,23 без добавления
33 Мёд, липа + подсолнечник 2017 Республика Адыгея -1,66 -25,60 -25,64 без добавления
34 Мёд, донниковый, 2020 Рязанская область, Скопинский район 4,24 -27,61 -27,21 без добавления
35 Мёд 2021 Россия 5,09 -24,01 -26,57 18
36 Мёд 2021 Россия 4,46 -27,06 -28,10 6,5
Значения показателя отношений изотопов азота белковой части (фракции) находится в диапазоне от -2,72 до 9,29 %„.
Согласно уравнению (2), 34 образца укладываются в нормы, поэтому можно сказать, что изученные образцы не были разбавлены сиропом, полученным из С3-типа растений. А образцы под номером 35 и 36, согласно полученным результатам, содержат 18 и 6,5 % экзогенных сахаров в пересчёте на тростниковый.
Значения показателя в ряде образцов (№ 1, 5, 21, 22, 32 имеют высокие значения, превышающие + 6 %о. Значения показателя С15^ в образцах 12, 17, 26, 27, 28, 33 находятся в области отрицательных чисел. Информации о применении данного идентификационного показателя в научных статьях крайне мало. Из публикаций [25, 26] можно получить некоторые ответы на данный вопрос. Авторы считают, что лесные массивы и количество годовых осадков существенно влияют на значение изотопных характеристик отношений изотопов азота. Изотопные отношения азота и углерода отражают воздействие землепользования и изменений климата на популяцию пчёл. Ученые утверждают, что данные отношения могут служить показателями состояния окружающей среды в местах обитания пчёл. Ученые из Германии по значениям показателя в выделенном белке из мёда сделали вывод о возможности использования метода изотопной масс-спектрометрии для выявления фальсификации маточного молочка [27]. Мёд с маточным молочком, используется и в качестве лакомства, и как лекарственное средство. Однако этот продукт имеет высокую цену, его часто подделывают или заменяют другими схожими по цвету и консистенции продуктами.
Для оценки алкогольных напитков широко применяется метод измерения соотношения стабильных изотопов углерода, водорода и кислорода в этиловом спирте исследуемого образца [13-17]. В силу того, что методы анализа изотопных соотношений углерода (брутто), углерода и азота белковой составляющей меда не всегда дают полную информацию о добавлении растительных сахаров С3-типа, было решено использовать анализ изотопных соотношений углерода, кислорода и водорода этанола, предварительно выделенных из сброженных образцов мёда и сахаросодержащих веществ. За основу данного метода был взят патент ^Ш809285С1) по определению экзогенных сахаро-содержащих веществ в пчелином мёде на основе анализа изотопных характеристик углерода, водорода и кислорода в этиловом спирте ферментированных образцов. Данные результаты представлены в таблице 2.
Полученные данные 41 образцов выявили, что значения показателя отношений изотопов углерода в этиловом спирте ферментированных 36 образцов мёда лежат в диапазоне от -28,36 до -22,13 %о, а пяти образцов сахаросодержащих веществ в диапазоне от -28,33 до -11,29 %о. Значения С13С выделенного этанола после ферментации сахаросодержащих до-
бавок из кукурузы и тростника лежат в диапазоне от -11,95 до -11,29 %о. Внесение таких добавок в мёд приведет к существенному изменению значений в сторону большего содержания «тяжёлого» изотопа 13С, значение показателя С13С будет смешаться к числовым характеристикам тростникового или кукурузного сиропа, среднее значение которого составляет -11 %. В случае с добавлением в мёд свекловичного сахара, свекловичной мелассы или рисового сиропа, установить присутствие таких добавок с использованием значений С13С не представляется возможным, так как диапазон значения С13С совпадает со значениями соответствующего показателя натурального мёда (брутто).
Значения показателя отношений изотопов кислорода в этиловом спирте, выделенного из исследуемых образцов мёда, лежат в диапазоне от 3,48 до 15,33 %. В тоже время, значения показателя отношений изотопов кислорода этилового спирта, выделенного из ферментированных образцов мёда (за исключением образцов № 16, 27 и 29) укладываются в диапазон от 7 до 15,5 %о. Значения показателя С18О этанола, выделенного из ферментированных сахаросодержащих веществ (сахар свекловичный, меласса свекловичная, рисовый сироп), не попадают в указанный диапазон. Сахара свекловичного происхождения характеризуются высоким содержанием «лёгкого» изотопа 160, а в случае рисового сиропа, значения смешаются в сторону уменьшения «лёгкого» изотопа 16О. Соответственно, показатель С180 может выступать в качестве идентификационного критерия при установлении присутствия свекловичных сахаров или рисовых сиропов в мёде.
Значения показателя отношений изотопов водорода в этиловом спирте, выделенного из исследуемых образцов мёда, лежат в диапазоне от -308,1 до -259,98 %о. Значения показателя С2Н этилового спирта, выделенного из продуктов брожения свекловичного сахара, мелассы, рисового сиропа, кукурузного сиропа и сиропа из тростникового сахара (№ 37-41), лежат в диапазоне от -283,64 до -220,31 %о. Стоит отметить, что большая часть исследуемых образцов мёда намного «легче» по изотопным характеристикам водорода по сравнению с кукурузным и тростниковым сиропом, диапазон значений которых составляет от -226,7 до -220,31 %о. Внесение таких добавок в мёд приведет к изменению значений С2Н в сторону более «тяжёлых» значений, что может позволить выявить присутствие экзогенных сахаров такого типа в продукте.
Следует отметить, что анализ этилового спирта в ферментированных образцах мёда и сахаросодержащих веществ, согласно разработанному нами патенту, может быть более точным и быстрым методом, чем анализ образцов мёда с твердофазным автосамплером, с последующей инкапсуляцией. Перенастройка оборудования для анализа твердых образцов требует значительного времени, поэтому данный способ полезен и применим, когда оборудование настроено для анализа жидких проб. В рамках данного патента начата раз-
Таблица 2. Значения показателя ¿13C, ¿18O и S2H в этиловом спирте ферментированных проб меда
и сахаросодержащих веществ
Table 2. Values of (513C, (518О, and S2H in ethyl of fermented samples of honey and sugar syrups
№ Наименование образца с последующей ферментацией Год сбора Место происхождения
1 Мёд 2020 Алтайский край, пос. Березовка Усть-Коксинский район -26,89 7,83 -278,06
2 Мёд, Манука 2021 Австралия -26,34 14,57 -269,21
3 Мёд, весенний 2020 Дальний восток, Уссурийский район -25,18 11,83 -278,08
4 Мёд 2020 Рязанская область, Захаровский р-н -27,88 9,69 -287,86
5 Мёд 2019 Башкирия, Уфимский район, село Николаевка -28,36 7,28 -297,88
6 Мёд 2019 США, штат Невада -26,69 8,07 -263,73
7 Мёд 2020 США, штат Аризона -25,74 15,33 -261,2
8 Мёд 2020 Дальний восток, Хабаровск -26,03 11,7 -278,98
9 Мёд, липовый 2018 Дальний Восток, Уссурийский район -24,85 14,37 -276,76
10 Мёд, разнотравье 2019 Дальний Восток, пос. Житково -26,94 13,05 -290,59
11 Падевый мёд 2018 Якутия -26,01 13,63 -308,1
12 Мёд, деморфант 2019 Приморский край, пос. Санаторная -24,52 10,24 -268,37
13 Мёд, женьшень 2020 Дальний Восток -24,99 14,56 -275,82
14 Мёд 2019 Дальний Восток, Леспедеция, Уссурийский район -25,46 9,33 -280,3
15 Мёд, падевый 2018 Якутия, г. Мирный -26,23 7,89 -281,73
16 Мёд, разнотравье 2019 Воронеж, пос. Алое Поле -28,17 3,48 -272,98
17 Мёд, лесное разнотравье 2020 Дальний Восток, Уссурийск -26,53 12,57 -288,33
18 Мёд, подсолнечниковый 2018 Рязанская обл. -24,66 12 -292,7
19 Мёд, кориандровый (58 % - пыльц.зерен кориандра) 2020 Краснодарский край -22,05 9,81 -283,01
20 Мёд, разнотравье с кориандром (23 % - пыльц.зерен кориандра) 2019 Краснодарский край -24,97 11,18 -298,72
21 Мёд, акациевый 2022 Краснодарский край, Александровский хутор -22,59 10,26 -261,68
22 Мёд, липовый 2021 Краснодарский край -24,22 13,3 -278,35
23 Мёд 2021 Россия -24,18 10,55 -272,92
24 Мёд 2021 Россия -23,63 13,55 -264,08
25 Мёд 2019 Чеченская республика, Грозный -22,4 8,02 -270,91
26 Мёд 2021 Дагестан -25,78 8,13 -283,07
27 Мёд, разнотравье + падевый, 2019 Якутия -24,29 4,96 -289,52
28 Мёд, акациевый 2020 Краснодарский край, г. Сочи -22,13 11,35 -259,98
29 Мёд, разнотравье 2019 Смоленская область, дер. Агеевщина -25,9 6,25 -286,17
30 Мёд 2018 Приморский край, Уссурийская обл. -25,92 9,86 -277,71
31 Мёд, разнотравье - Киргизия, Джумгал -25,83 11,07 -279,98
32 Мёд, гречишный 2020 Рязань, г. Касимов -26,63 9,59 -281,96
33 Мёд, липа + подсолнечник 2017 Республика Адыгея -25,27 13,18 -274,32
34 Мёд, донниковый 2020 Рязанская область, Скопинский район -26,87 12,5 -287,98
35 Мёд 2021 Россия -23,87 10,03 -287,62
36 Мёд 2021 Россия -25,32 10,47 -286,73
37 Сахар свекловичный (кат. ТС2) 2020 Россия -26,47 6,23 -270,8
38 Меласса свекловичная 2015 Россия -26,46 3,76 -283,64
39 Рисовый сироп 2021 Европа -28,33 15,8 -262,01
40 Кукурузный сироп 2017 Европа -11,29 12,55 -226,7
41 Сироп из тростникового сахара 2021 Европа -11,95 8,65 -220,31
работка методики измерений, отсутствующая на территории Российской Федерации. Внедрение данной методики с применением масс-спектрометрии позволит выявлять более сложные фальсификаты, изготовленные из сиропов имитирующих профиль сахаров мёда.
Поскольку некоторые сорта мёда из экологически чистых районов страны с защищенным географическим наименованием считаются более ценными, в будущем планируется использовать метод изотопной масс-спектрометрии для определения места происхождения мёда. Наиболее перспективными показателями являются изотопные характеристики кислорода и водорода мёда (брутто), а также качественный и количественный состав микро- и макроэлементов [28, 29].
Выводы
Проведенные исследования показали, что использование метода изотопной масс-спектрометрии позволяет выявить образцы мёда, содержащие в своем составе экзогенные сахара. На основании методики А0АС 998.12, в 2 образцах мёда из 36 было выявлено присутствие экзогенных сахаров из С4-типа растений в количестве 18 и 6.5 % в пересчете на тростниковый сахар. Однако данный метод не позволяет выявить присутствие внесенных сахаросодержащие веществ из С3-типа растений. В связи с этим были проведены исследования значений показателей С13С, С18О и С2Н этанола, выделенного из ферментированного меда. Показали, что свекловичные сахар и меласса характеризуются более высоким содержанием «лёгкого» изотопа 160. Для рисового сиропа, значения С18О смешаются в сторону меньшего содержания «лёгкого» изотопа 16О. Таким образом, показатель С180 может выступать в качестве идентификационного критерия при установлении присутствия сахаров в мёде из С3-типа растений. Данный способ выявления фальсифицированной продукции основан на полученном
патенте РФ RU2809285C1 по определению экзогенных сахаросодержащих веществ в пчелином мёде.
Изучение отношений изотопов азота в белковой части мёда может быть полезным инструментом для определения его подлинности и дополнительным критерием идентификации пчеловодческой продукции. Стоит отметить, что, если в пробе мёда не выделяется белок в процессе ее подготовки, это может свидетельствовать о достаточно грубой фальсификации, так как в натуральном мёде всегда присутствует белковая составляющая.
Критерии авторства
Л. А. Оганесянц - идея и научное руководство. А. Л. Панасюк - обзор литературы. Д. А. Свиридов, О. В. Серебрякова - подготовка образцов к анализам, обработка результатов экспериментальных исследований. М. Ю. Ганин, А. А. Шилкин - подготовка текста, анализ образцов на изотопном масс-спектрометре.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution
L.A. Oganesyants developed the research concept and provided scientific guidance. A.L. Panasyuk reviewed scientific publications. D.A. Sviridov and O.V. Serebrya-kova prepared the samples and processed the experimental research results. M.Yu. Ganin and A.A. Shilkin drafted the manuscript and performed the isotope mass spectrometry.
Conflict of interest
The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this article.
References/Список литературы
1. Khatun MA, Yoshimura J, Yoshida M, Suzuki Y, Huque R, Kelly SD, et al. Isotopic characteristics (<13C, <15N, and S18O) of honey from Bangladesh retail markets: Investigating sugar manipulation, botanical and geographical authentication. Food Chemistry. 2024;435:137612. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.137612
2. Zdiniakova T, Lorchner C, De Rudder O, Dimitrova T, Kaklamanos G, Breidbach A, et al. EU Coordinated action to deter certain fraudulent practices in the honey sector. JRC Technical Report. 2023. https://data.europa.eu/doi/10.2760/184511
3. Kovalev AM. Beekeeper's Textbook: Textbook for rural vocational technical school. Moscow: Kolos; 1973. 432 p. (In Russ.). [Ковалев А. М. Учебник пчеловода: Учебник для сельского профессионального технического училища. Москва: Колос, 1973. 432 с.]
4. 70 percent of honey in Russia may be adulterated: how to recognize deception [Internet]. [cited 2024 Jan 15]. Available from: https://www.gastronom.ru/text/nepravilnyj-med-do-70-meda-v-rossii-mozhet-okazatsya-falsificirovannym-1017587.
5. Tosun M. Detection of adulteration in honey samples added various sugar syrups with 13C/12C isotope ratio analysis method. Food Chemistry. 2013;138(2-3):1629-1632. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.11.068.
6. Ajlouni S, Sujirapinyokul P. Hydroxymethylfurfuraldehyde and amylase contents in Australian honey. Food Chemistry. 2010;119(3):1000-1005. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.07.057
7. Chen C-T, Chen B-Y, Nai Y-S, et al. Novel inspection of sugar residue and origin in honey based on the 13C/12C isotopic ratio and protein content. Journal of Food and Drug Analysis. 2019;27(1):175-183. https://doi.Org/10.1016/j.jfda.2018.08.004
8. Kawashima H, Suto M, Suto N. Stable carbon isotope ratios for organic acids in commercial honey samples. Food Chemistry. 2019;289:49-55. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.03.053
9. Cabañero AI, Recio JL, Rupérez M. Liquid Chromatography Coupled to Isotope Ratio Mass Spectrometry: A New Perspective on Honey Adulteration Detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006;54(26):9719-9727. https:// doi.org/10.1021/jf062067x
10. Xu JZ, Liu X, Wu B, Cao YZ. A comprehensive analysis of 13C isotope ratios data of authentic honey types produced in China using the EA-IRMS and LC-IRMS. Journal Food Science Technology. 2020;57(4):1216-1232. https://doi.org/10.1007/ s13197-019-04153-2
11. Vetrova OV, Melkov VN, Simonova GV, Kalashnikova DA. Detection of honey adulterations with sugar syrups by stable isotope mass spectrometry. Journal of Analytical Chemistry. 2017;72(7):756-760. https://doi.org/10.1134/S1061934817070152
12. Tsagkaris AS, Koulis GA, Danezis GP, Martakos I, Dasenaki M, Georgiouc CA, et al. Honey authenticity: analytical techniques, state of the art and challenges. RSC Advances. 2021;11:11273-11294. https://doi.org/10.1039/d1ra00069a
13. Oganesyants LA, Panasyuk AL, Kuzmina EI, Kharlamova LN. Determination of the carbon isotope 13С/12С in ethanol of fruit wines in order to define identification characteristics. Food and raw materials. 2016;4(1):141-147. https:// doi.org/10.21179/2308-4057-2016-1-141-147
14. Oganesyants LA, Panasyuk AL, Kuzmina EI, Sviridov DA, Ganin MYu, Shilkin AA. Traditional siders and perry identification by isotope mass spectrometry. Food Industry. 2021;4:55-57. (In Russ.). https://doi.org/10.24412/0235-2486-2021-4-0036 ; https://www.elibrary.ru/XLXEAU
15. Oganesyants LA, Panasyuk AL, Kuzmina EI, Ganin MYu. Isotopes of Carbon, Oxygen, and Hydrogen Ethanol in Fruit Wines. Food Processing: Techniques and Technology. 2020;50(4):717-725. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2020-4-717-725; https://www.elibrary.ru/TRNZXN
16. Oganesyants LA, Panasyuk AL, Kuzmina EI, Sviridov DA. Geographical place of origin influence on isotope characteristics of ethanol elements and wine aquatic component. Food industry. 2020;(12):78-80. (In Russ.). https://doi. org/10.24411/0235-2486-2020-10152; https://www.elibrary.ru/MVIQNZ
17. Oganesyants LA, Panasyuk AL, Kuzmina EI, Peschanskaya VA. Application features of isotopic mass spectrometry when analyzing carbon ethanol in cognac and cognac distillates. Winemaking and viticulture. 2016;3:4-7. (In Russ.). https:// doi.org/10.24412/0235-2486-2021-4-0036; https://www.elibrary.ru/WFSBFD
18. Talibova A, Kolesnov A. Quality and safety assessment of food products by isotope mass spectrometry. Analytics. 2011;(1):44-48. (In Russ.). [Талибова А., Колеснов А. Оценка качества и безопасности пищевой продукции методом изотопной масс-спектрометрии // Аналитика. 2011. № 1. С. 44-48.]. https://www.elibrary.ru/PIEIFJ
19. Oganesyants LA, Panasyuk AL, Kuzmina EI, Sviridov DA, Ganin MYu, Shilkin AA. Using the isotope mass spectrometry method to detect the presence of exogenous sugars in honey. Food Industry. 2023;(12):105-113. (In Russ.). https://doi.org/10.52653/PPI.2023.12.12.021; https://www.elibrary.ru/BHHQJQ
20. AOAC official methods of analysis. Method 998.12: C-4 plant sugars in honey, internal standard stable carbon isotope ratio method, AOAC Int. Gaithersburg MD USA. 1999;44:27-30.
21. Rogers KM, Cook JM, Krueger D, Beckmann K. Modification of AOAC Official Method SM 998.12 to Add Filtration and/or Centrifugation: Interlaboratory Comparison Exercis. Journal of AOAC International. 2013;96(3):607-614. https://doi.org/10.5740/jaoacint.12-386
22. Bocian A, Buczkowicz J, Jaromin M, Hus KK, Legáth J. An Effective Method of Isolating Honey Proteins. Molecules. 2019;24(13):2399. https://doi.org/10.3390/molecules24132399
23. White JW, Doner LW. The 13C/12C ratio in honey. Journal of Apicultural Research.1978;17:94-99. https://doi. org/10.1080/00218839.1978.11099910
24. Trifkovic J, Andric F, Ristivojevic P, Guzelmeric E, Yestilada E. Analytical Methods in Tracing Honey Authenticity. Journal of AOAC in International. 2017;100(4):827-839. https://doi.org/10.5740/jaoacint.17-0142
25. Kalashnikova DA, Simonova GV. Ratios of stable isotopes 13C/12C and 15N/14N in samples of dead honey bees and beekeeping products. Journal of Analytical Chemistry. 2021;76(4):359-368. (In Russ.). https://doi.org/10.31857/ S004445022104006X; https://www.elibrary.ru/JHBSUQ
26. Taki H, Ikeda H, Nagamitsu T, Yasuda M, Sugiura S, Maeto K, et al. Stable nitrogen and carbon isotope ratios in wild native honeybees: the influence of land use and climate. Biodivers Conserv. 2017;26:3157-3166 https://doi.org/10.1007/ s10531-016-1114-x
27. Stocker A, Rossmann A, Kettrup A, Bengsch E. Detection of royal jelly adulteration using carbon and nitrogen stable isotope ratio analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2005;20(2):181-184. https://doi.org/10.1002/rcm.2287
28. Dinca O-R, Ionete RE, Popescu R, Costinel D, Radu G-L. Geographical and Botanical Origin Discrimination of Romanian Honey Using Complex Stable Isotope Data and Chemometrics. Food Analitical Methods. 2015;8:401-412.https:// doi.org/10.1007/s12161-014-9903-x
29. Izol E, Kaya E, Karahan D. Investigation of Some Metals in Honey Samples Produced in Different Regions of Bingol Province by ICP-MS. Mellifera. 2021;21:1-17.
