CC BY
52
УДК 618.12-007.29-07:612.621
АНАЛИЗ ГОРМОНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ, БАЛАНСА ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА В ЯИЧНИКАХ У ЖЕНЩИН С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ БЕСПЛОДИЕМ
Л.Ф. Зайнетдинова ЧГМА, г. Челябинск
У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в первую фазу менструального цикла установлен дефицит продукции эстрогенов, рост числа клеток яичника, экспрессирующих маркеры пролиферации (РСКА и Кл67) без колебаний уровня экспрессии р53 в половых железах женщин.
Ключевые слова: трубно-перитонеальное бесплодие, половые гормоны, пролиферация, апоптоз.
Введение. Трубно-перитонеальное бесплодие (ТПБ) характеризуется анатомо-функциональными нарушениями маточных труб с развитием спаечного процесса в полости малого таза, в 65 % случаев развивающегося вследствие хронического воспалительного процесса в женских половых органах [1,3]. Вовлечение в воспалительный процесс яичников, развитие фиброзных спаек на их поверхности приводят к нарушению фолликулогенеза, овуляции и секреции половых гормонов у этих пациенток [2]. Стандартным методом оценки гормональной функции яичников является определение количества вырабатываемых в них стероидных гормонов (эстрадиола, прогестерона, тестостерона) в крови для проведения последующей корригирующей гормональной терапии. Однако не всегда введение половых гормонов приводит у пациенток с ТПБ к нормализации функции яичников. Одной из причин может быть отсутствие связи между уровнем гормонов крови и реакцией на них со стороны рецепторного аппарата яичников в условиях хронического воспаления и спаечных изменений в них. При длительно текущем хроническом воспалительном процессе в половых органах женщин при ТПБ могут также происходить изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации клеток женских гонад, зависящих от состояния эндокринной и нитроксидергической регуляции.
Цель исследования: анализ гормональной функции, баланса процессов пролиферации и апоптоза в яичниках и нитроксидергической регуляции у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.
Материалы и методы исследования. Основную группу исследования составили 50 пациенток с ТПБ на фоне верифицированного гистологически хронического воспаления в репродуктивных органах. Все женщины находились на диспансерном наблюдении в Областном центре планирования семьи и репродукции. Длительность бесплодия до 3 лет была у 14 (28 %), до 5 лет - у 28 (56 %), более 5 лет - у 8 (16 %). Средний возраст пациенток составил 27,0 ± 2,3 лет. Нарушения со стороны
менструальной функции в анамнезе отметили 38 (76 %) женщин. У 13 (26 %) наблюдалась гиперполименорея, у 8 (16 %) - гипоменорея при сохранении 28-дневного цикла, у 5 (10%) гипоменстру-альный синдром, 17 (34 %) женщин имели место мажущие выделения от 3 до 7 дней до и после менструации, дисменорея наблюдалась у 14 (28 %) женщин, метроррагии - у 4 (8 %). В гинекологическом отделении клиники ЧГМА всем пациенткам была проведена манипуляционно-диагностическая лапароскопия с биопсией ткани яичников для им-муногистохимического исследования. В день поступления в стационар производили забор венозной крови для определения конечных стабильных метаболитов оксида азота уровня sFas. Группу контроля для анализа показателей крови составили 25 здоровых женщин (средний возраст 23,5 ±1,3 лет).
Количественное содержание гормонов в сыворотке крови (общего тестостерона, прогестерона, эстрадиола) у пациенток определяли методом ИФА с помощью реактивов фирмы Immunotech (Франция). Определение эстрадиола и тестостерона проводили на 5-7 день, а прогестерона - на 20 день менструального цикла.
Определение количества клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам, прогестерону и андрогенам, проводили с помощью тест-систем: «Нафтол AS-MX-фосфат Free acid (№4875 Sigma)» (USA); «RTU-ER-6F11»; «RTU-PGR-1А6». Экспрессию белков Ki67, PCNA и p53 в гистологических срезах из яичников проводили иммуно-гистохимическим методом с применением тест-систем: «RTU-Ki-67 -ММ 1», «NCL-L-PCNA»
(Novocastra, Великобритания); «АМ256-2М (clone F39.4.1) (BioGenex, USA), и системы мечения Immune-mark (ICN) в парафиновых гистологических срезах. Результаты иммуногистохимической реакции с антителами против рецепторов к эстрогенам, прогестерону и андрогенам оценивали путем подсчета объемной плотности (об. %) ядер клеток с положительной иммуногистохимической реакцией в гистологическом препарате, а резуль-
тат реакции с антителами к Ki67, PCNA и р53 выражали количеством клеток на 1 мм2.
Уровень продукции эндогенного оксида азота оценивали по концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови по модифицированному методу Griess (Э.Н. Коробейникова, 2002).
Растворимый Fas (sFas) определяли в сыворотке крови пациенток иммуноферментным методом с помощью тест-системы Austria. Beuder Med Systems Gimble numan sAPO l|Fas BMS 245 LOT 335 35230, регистрация результатов - на «Multiscan Plus» (Labsystem) при длине волны 450 нм.
Статистическая обработка материала произведена с применением пакета прикладных программ STATISTICA for Windows версия 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США). Для сравнения количественных признаков применялись параметрические и непараметрические методы.
Результаты исследования. Данные определения уровня стероидных гормонов яичников в сыворотке крови у женщин с ТПБ представлены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, у женщин с ТПБ имеется значительное снижение уровня эстрадиола в крови в I фазу менструального цикла в сравнении со здоровыми женщинами репродуктивного возраста (62,1 пг/мл и 235 пг/мл соответственно). По показателям прогестерона во II фазе цикла достоверных различий с контрольной группой не получено. Количество общего тестостерона фактически не отличалось от показателей контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют о дефиците продукции эстрогенов у женщин с ТПБ.
Функцию яичника характеризует не только уровень продукции половых гормонов, но и ха-
рактер экспрессии рецепторов к ним в тканях яичника, т.к. снижение продукции гормона может сопровождаться изменением количества рецепторов к ним, способных воспринимать эндокринный сигнал, участвовать в обеспечении обратной связи между уровнем гормона в крови и функцией яичника. Результаты определения количества клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к эстрадиолу, прогестерону и андрогенам, приведены в табл. 2.
При параллельном определении объемной плотности ядер клеток в яичнике, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам, прогестерону и андрогенам в пролиферативную фазу менструального цикла у женщин с ТПБ, достоверных различий с показателями секреторной фазы менструального цикла по этим показателям не обнаружено, хотя в фазе секреции все приведенные в таблице показатели несколько ниже, чем в фазе пролиферации. Вместе с тем, хотя соотношение клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам и прогестерону в фазе пролиферации по отношению к
фазе секреции, меняется незначительно, в 1,28-1,5 раза, количество таких клеток, несущих рецепторы к андрогенам, в фазе секреции снижается по отношению к фазе пролиферации восьмикратно, т.е. меняется более значительно.
Изменение гормональной функции гонад может определяться также балансом процессов пролиферации и апоптоза клеток яичников. Мы определяли в биоптатах яичников, полученных при манипуляционно-диагностической лапароскопии, маркеры пролиферации (РСМА, Ю67) и проапопто-генный фактор (р53), влияющие на апоптоз различных клеток. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 1
Уровень половых гормонов в сыворотке крови женщин с ТПБ в разные фазы менструального цикла
Показатель Основная группа Контроль Р
Фаза пролиферации п = 42 Фаза секреции п = 34
Me Q25-Q75 Me Q25-Q75 Me Q25-Q75
Эстрадиол, пг/мл 62,1 44,6-75,9 - 235 198-284 0,001
Тестостерон общий, нг/дл 2,2 1,9-3,0 — 2,5 2,1-3,4 0,2
Прогестерон, нг/мл - - 6,06 4,5 9,78 10,3 6,9-12,4 0,3
Таблица 2
Объемная плотность ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к стероидным гормонам у женщин с ТПБ, %
Показатель Фаза пролиферации п = 42 Фаза секреции п = 34 Р
М ± m М ± m
К эстрогенам 3,22 ± 0,90 2,50 + 0,60 1,28 0,5
К андрогенам 2,90 ±1,50 0,33 ± 0,10 8,78 од
К прогестерону 3,60 ±0,67 2,40 ±0,60 1,5 0,5
Проблемы здравоохранения
Таблица 3
Количество клеток яичников с маркерами пролиферации, апоптоза у женщин с ТПБ в разные фазы менструального цикла на 1 мм2
Показатель Фаза пролиферации менструального цикла п= 15 Фаза секреции менструального цикла п= 10 Р
М ± m М ± m
Ki67 876,9 ± 50,7 740,6 ±32,1 0,05
PCNA 863,3 ±28,8 666,5 ± 53,7 0,001
р53 757,2 ± 48,8 708,8 ±43,3 0,7
Таблица 4
Уровень конечных стабильных метаболитов оксида азота у женщин с ТПБ
Показатель Пациентки с ТПБ п = 35 Контрольная группа п = 25 Р
Me Q25-Q75 Me Q25-Q75
no2 5,6 3,87-12,5 4,39 3,21-6,3 0,1
NOx 20,1 17,3-30,2 14,85 12,3-22,1 0,04
N03 14,5 10,9-19,53 12,185 5,17-18,89 0,3
Число клеток фолликулов яичника, экспрессирующих маркеры PCNA и Ki67 в фазу пролиферации, оказалось достоверно выше, чем в фазу секреции. Эта закономерность особенно характерна для экспрессии ядерного белка PCNA. Существенных колебаний в течение менструального цикла уровня проапоптогенного фактора р53 не было обнаружено. По данным авторов [4, 5], с экспрессией р53 связан апоптоз клеток гранулезы, который запускается только в гранулезных клетках зрелого, преову-ляторого фолликула. Апоптоз клеток яичника контролируют мембранный Fas-рецептор и его лиганд FasL, а также растворимые молекулы Fas и FasL. Fas-антиген является медиатором апоптоза при регрессии желтого тела и фолликулярной атрезии [6]. При обследовании пациенток с ТПБ достоверных различий в уровне растворимого Fas-рецептора сыворотки крови в сравнении с группой здоровых женщин репродуктивного возраста не выявлено; у пациенток количество рецептора в крови составляло 57,4 пкг/мл, а у здоровых женщин 59,1 (р = 0,8).
Исследование конечных стабильных метаболитов оксида азота, оказывающих влияние на апоптоз различных клеток, у женщин с ТПБ в сопоставлении с группой здорового контроля без учета фазы менструального цикла представлено в табл. 4.
Как видно из представленных в таблице данных, у пациенток с ТПБ в сыворотке крови достоверно повышен уровень суммарных конечных метаболитов оксида азота (NOx). Изменение уровня N0, являющегося универсальным внутриклеточным мессенджером, может быть связано с активацией секреторной функции макрофагов и эндоте-лиоцитов. Общеизвестно, что накопление оксида азота оказывает, с одной стороны, провоспали-тельный эффект на окружающие ткани, а с другой -влияет на процессы апоптоза клеток. По данным авторов [4], оксид азота подавляет FasL-зависимый
апоптоз, вызывающий фолликулярную атрезию, а с потерей Fas накапливаются фолликулы средних размеров или развиваются кисты яичников [7].
Гормональный баланс и регуляция процессов пролиферации и апоптоза клеток зависят не только от уровня отдельных гормонов, молекулярных мессенджеров, но и от характера взаимодействия между ними. Нами проведен корреляционный анализ взаимосвязей между изучаемыми параметрами: уровнем метаболитов оксида азота и растворимого Fas-рецептора, половых гормонов в крови, числом клеток яичников, экспрессирующих рецепторы к ним, а также маркеры пролиферации, апоптоза. Достоверные корреляционные связи между изучаемыми показателями представлены в табл. 5.
При анализе данных таблицы выявлены достоверные позитивные корреляционные связи умеренной силы между уровнями тестостерона в крови пациенток с ТПБ и числом клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к нему, свидетельствующие о взаимозависимости этих изучаемых показателей. Вполне ожидаемой является также наличие положительной корреляционной связи умеренной силы между числом клеток яичника с рецепторами для эстрадиола и прогестерона, обладающих регулирующим действием на менструальный цикл, последовательную смену его фаз.
Наибольшее число достоверных позитивных корреляционных связей умеренной силы было обнаружено у пациенток с ТПБ между уровнем экспрессии проапоптогенного белка р53 в клетках яичников, с одной стороны, и % ядер клеток яичников, экспрессирующих рецепторы к эстрадиолу, прогестерону и андрогенам, с другой. Известно, что белок р53 запускает процесс апоптоза в зрелом, преовуляторном фолликуле [8], где, вероятно, нарастает число клеток с рецепторами для половых гормонов.
Таблица 5
Достоверные корреляционные связи между изучаемыми показателями у пациенток с ТПБ
Анализируемый показатель г Р
Уровень тестостерона в крови и % ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к андрогенам 0,76 0,03
% ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к эстрадиолу, и % ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к прогестерону 0,71 0,04
РБИА - Кл67 0,68 0,0001
Р53 - % ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к эстрадиолу 0,5 0,02
Р53 - % ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к прогестерону 0,5 0,03
Р53 - % ядер клеток яичника, экспрессирующих рецепторы к андрогенам 0,6 0,04
Шх-Р53 -0,6 0,02
N0* - бРэб -0,4 0,05
Шх-Ж)з 0,8 0,0001
Шх-Ш2 0,4 0,0004
Помимо внутрисистемных связей между уровнями отдельных метаболитов нитрокисдер-гической системы, нами обнаружены также отрицательные корреляции между количеством NOx в крови и экспрессией проапоптогенного белка р53 в клетках яичника, а также с уровнем растворимого сывороточного Fas рецептора у пациенток с ТПБ, что предположительно отражает разные стороны влияния оксида азота на отдельные молекулярные механизмы, сопряженные с инициацией апоптоза клеток.
В целом полученные результаты свидетельствуют, что у женщин с ТПБ воспалительного генеза формируется нарушение продукции эстрадиола, баланса уровня сывороточного тестостерона и числа клеток яичников, экспрессирующих ядерные рецепторы к нему, происходит изменение уровня нитроксидергической регуляции и сопряженной с ней экспрессии проапоптогенного белка р53 в репродуктивных органах, а также уровня растворимого Fas-рецептора в циркуляции, отражающих молекулярно-клеточные механизмы дискоордина-ции созревания и атрезии фолликулов.
Литература
1. Влияние инфекции на репродуктивную систему женщин / В.И. Краснопольский, О.Ф. Серова, В.А. Туманова и др. //Российский вестник акушера-гинеколога, 2004. - Т. 4, № 5. - С. 26-29.
2. Спаечная болезнь как проблема репродукции и методы ее профилактики / А.А. Попову Т.Н. Ма-никова, Г.Г. Шагинян и др. // Российский вестник акушера-гинеколога, 2005. - Т. 5, № 4. - С. 41-45.
3. Яглов, В.В. Воспалительные заболевания органов малого таза / В.В. Яглов // Гинекология, 2001. - Т. 3, № 3. - С. 93-97.
4. Endocrinology / О. Chon, Т. Yano, Н. Matsumi et al. - 2005. - V. 146, № 2. - P. 808-815.
5. Endocrinology / К.1. Tilly, S. Banerjee, P.P. Ba-nerjee, J.I. Tilly. -1995. - V. 136, № 4. -P. 1394-1402.
6. Clin. Endocrinol. Metabol/H. Kondo, T. Maruo, X. Peng, M.J. Mochizuki. - 1996. - V. 81, № 7. -P. 2702-2710.
7. Mol Reprod Dev / K. Sakamaki, H. Yoshida, Y. Nishimura et al. -1997. -V. 47. -P. 11-18.
8. Steroids / A. Amsterdam, A. Dantes, K. Hoso-kawa et al. -1998. - V. 63. -P. 218-314.
Поступила в редакцию 10 февраля 2009 г.
