CC BY
36
© Мудра А. е. УДК 615. 015 Мудра А. €.
АНАЛ13 Б10Х1М1ЧНИХ ПР0ЦЕС1В У ГЕПАТ0ПАНКРЕАС1 К0Р0ПА
ЗА 3АБРУДНЕННЯ В0ДИ ФЕН0Л0М
ДВНЗ «Тернопшьський державний медичний ушверситет ¡MeHi I. Я. Горбачевського М03 УкраГни» (м. Тернопшь)
Дана робота е фрагментом науково-дослщних poôiT держбюджетно! теми кафедри xiMiï Тернопть-ського нацioнальнoгo педагoгiчнoгo унiвеpситету iM. Володимира Гнатюка «Тoксикoспецифiчнi адап-тацiï гщробютчв та водних екосистем до юыв важ-ких металiв та ïx pегуляцiя», № деpжавнoï pеeстpацiï 0101и000303, в якiй автор дoслiджував активнють системи антиоксидантного захисту, гострофазну вщповщь та метабoлiзм залiза в тканинах коропа i рака за дм ioнiв важких металiв та фенолу.
Вступ. Проблема фенольного забруднення при-родних вод стала актуальною з друго'| половини XX ст. як в Украшу так i за ïï межами. Не втратила вона свое'| актуальнoстi й до наших дыв, oскiльки у скидах ба-гатьох промислових пiдпpиeмств (нафтoпеpеpoбнi, газов^ кoксoбензoльнi, xiмiчнi, деpевoпеpеpoбнi, текстильнi, фармацевтичы, шкipянi та iн.) мiстяться фенол i його гомологи, як з неочищеними або не-достатньо очищеними с^чними водами надходять у piчки i водойми ïx пpидаткoвoï системи [10]. Проте, прогноз токсичност фенoлiв зводиться лише до ви-мipювання кiлькoстi його самого як у водойм^ так i в тканинах тварин [11, 12]. Щодо найпростшого гомолога фенoлiв С6Н5ОН вщомо, що в opганiзмi коропа вЫ викликае iстoтнi змiни активной феpментiв антиоксидантного захисту [3]. Тому дедалi бiльшo,i уваги пpидiляeться пошуку адекватних бioмаpкеpiв гiдpoбioнтiв. Для рекомендаци бioiндикатopнoгo виду, чутливого до фенольного забруднення во-дойм, ми дослщили метабoлiчну вiдпoвiдь на дiю фенолу у opганiзмi коропа.
Мета дослщження. З'ясувати та дoслiдити ме-табoлiчну вiдпoвiдь на показники гепатопанкреасу коропа за умов фенольного забруднення, що характеризуют стан системи антиоксидантного захисту та вмют молекул середньо'|' маси, що використову-ються у клмычному аналiзi гепатoтoксичнoстi.
0б'ект i методи дослщжень. Дoслiдження проводились на двopiчкаx коропа лускатого (Cyprin-its carpio L.) масою 200-250 г. Тварин виловлювали влгтку траловим методом iз ставюв Теpнoпiльськoгo обласного рибкомбЫату (урочище Залiсцi) та адап-тували до лабораторних умов протягом 7 дiб у ба-сейнах об'емом 200 л з кiлькiстю тварин 6-10 особин на басейн при темпеpатуpi близько 18° С у вщстоя-нм, добре аеpoванiй водг Одна група тварин була
контрольною, шшм у воду додавали 2 мкг/л фенолу. Воду мшяли що двi доби, поновлюючи в нм вмiст фенолу. Пеpioд Ыкубацп становив 14 дiб. Тварин годували гранульованим кормом для риб. Bd про-цедури з видiлення та обробки зразюв проводили за температури 4 °С. Для аналiзу використовували тканину гепатопанкреасу. Bd процедури з видтення й обробки зразюв проводились на холодк Bсi реакти-ви, кpiм уже зазначених, були фipми «Реахим» квалг фiкацiï «хч».
Активнiсть супероксиддисмутази (СОД) (К.Ф.1.15.1.1) вимipювали за iнтенсивнiстю вщнов-лення нгтротетразолю синього в пpисутнoстi феназинметасульфату i НАДН [6], активнють ката-лази (К.Ф. 1.11. 1.6) - за методом Королюка i спг вавт. [2], активнють лужно'|' фосфатази (К.Ф.3.13.1), та фосфату, загальний вмют залiза у тканиы та залiзoзв'язуючу здатнiсть тканини - за допомогою стандартних набopiв pеактивiв «Lachema", концен-тpацiю вiднoвленoгo глутатюну (небiлкoвиx тioлiв) -за допомогою реактиву Еллмана [14].
Iнтенсивнiсть перекисного окиснення лт^в (ПОЛ) oцiнювали за допомогою тюбарб^рово'|' кис-лоти (ТБК), як утворення ТБК-активних пpoдуктiв, серед яких переважае один з юнцевих пpoдуктiв ПОЛ - малоновий диальдегщ [5]. Bимipювали також вмiст молекул середньо'|' маси [4]. Для видтення за-гальних бiлкiв печiнки ïx осаджували в 20 об'емах 0,5 н НС104, вiдoкpемлювали центрифугуванням та про-мивали в наступнiй послщовности у 5 об'емах ета-нолу, сум^ метанолу i хлороформу (2:1) та у дие-тиловому етерк Пiсля висушування в теpмoстатi при 37 °С бiлoк розчиняли в 1 мл 0,5 н КОН, витримуючи сумш дектька годин - добу в термостатк Загальний вмют бтюв у печiнцi визначали за методом Лоури i шш., використовуючи як стандарт сироватковий альбумЫ («Sigma").
Результати подавали у виглядi М ± m, п = 5. Bipo-гiднiсть вiдxилення двох pядiв значень обчислювали з використанням t-тесту Стьюдента. За результатами визначення показниюв стану антиоксидантно-пpooксидатнoï системи обчислювали штеграль-ний показник - коефМент антиоксидантного стану (КАС) як вщношення сум пoказникiв стану антиокси-дантних (А) i прооксидантних (П) фактopiв: КАС = J A/S П. Кожний показник визначали за формулою:
Таблиця
Вплив забруднення води фенолом на активнють ферментт та вмют метаболтв у гепатопанкреаскоропа,М±т, п = 5
Показник Дослiдна група Короп
Активнють супероксид-цисмутази, у. о. /мг бтюв Контроль 0,68 ± 0,09
Фенол 0,22 ± 0,02**
Активн\сть каталази, мкат/мг бтюв Контроль 0,16 ± 0,01
Фенол 0,24 ± 0,04
Низькомолекулярш т\оли, мкмоль/г тканини Контроль 2,2±0,2
Фенол 4,2±0,4**
ТБК-активш продукти, мкмоль/г тканини Контроль 27,4 ± 2,4
Фенол 54,4 ± 5,3**
Вм\ст магнiю, ммоль/г тканини Контроль 0,79 ± 0,06
Фенол 0,96 ± 0,01*
Вм\ст залiза, мкмоль/г тканини Контроль 6,9 ± 0,5
Фенол 8,2±0,8
Загальна залiзозв'язуюча здатнiсть, мкмоль/г тканини Контроль 23,4±2,7
Фенол 10,8 ± 1,2**
Молекули середньо! маси (й280), ум. од. /г тканини Контроль 281 ± 6
Фенол 137 ± 18**
Молекули середньо! маси (й254) ум. од. /г тканини Контроль 513± 11
Фенол 225± 11**
Активнють лужно! фосфатази, мкмоль фосфату/мг бтюв Контроль 0,9 ±0,2
Фенол 0,8+0,2
Фосфат неоргашчний, мкг/г тканини Контроль 5,6 ±0,6
Фенол 3,9 + 0,4*
Коеф^ент антиоксидантного стану, % вщхилення в\д контролю Фенол -6. 0
Примпжа:
**-р < 0,01.
*- зм\ни пор1вняно з контролем в1ропды, *-р < 0,1;
1 ± (Мд - Мк)/ Мк, де 1 - характеристика показника в норм^ Мд i Мк - середньоарифметичн значення по-казниюв вщповщно дослщно! i контрольно! серй До «А» вщносили так показники як активнють СОД, каталази, вмют небткових т\ол\в в тканиы, до «ГГ -вмют ТБК-активних продукпв та незв'язаного зал1за. За тако! юлькост даних в контрол1 КАС становить 1,5.
Результати дослщжень та Тх обговорення. Ферменти антиоксидантного захисту та вмют в\д-новленого глутатюну - це б1ох1м1чн1 параметри, як часто використовуються як бюмаркери забруднення водойм в програмах бюмонтгорЫгу [8, 11, 12]. Як видно з даних, наведених у таблиц!, у коропа вплив фенолу викликае ¡стотне зменшення актив-ност СОД. Активнють каталази виявилась нечутли-вим до дм фенолу показником, а зм\ни вмюту в\д-новленого глутат\ону у коропа мають протилежну спрямованють.
У коропа зростае вмют незв'язаного зал\за, тод\ як загальна зал\зозв'язуюча здатнють (ЗЗЗ) змен-шуеться майже вдв\ч\. Таким чином, зростання на-сичення клггинних м\шеней зал\зом до наближення
значень вмюту зал\за в тканин та II ЗЗЗ може св\д-чить про патолопю печшки, тод\ як, зменшення ступеню насичення клггинних бтюв зал\зом може мати адаптивний характер. Зменшення ЗЗЗ ткани-ни може бути ознакою ппопротешемп, запальних процес\в у тварин за д\! досл\джуваних чинник\в.
Разом з тим, у даного об'екта вщзначене ¡стотне посилення пероксидацп л\п\д\в.
Зг\дно з обчисленнями КАС, ¡нтегральн\ зм\ни ан-тиоксидантно-прооксидантного статусу гепатопан-креасу коропа мае прооксидантну спрямованють. Серед чинник\в прооксидантних зм\н простежуеться узгодженють м\ж активнютю СОД та пероксидац\ею л\п\д\в.
Нами визначались також показники, як\ часто використовуються у кл\н\чному анал\з\ гепатотоксич-ност\. За д\! фенолу вмют молекул середньо! маси у гепатопанкреас\ коропа зменшувався вдв\ч\, що свщчить про пригн\чення здатност тканини форму-вати так звану вщповщь «гострого типу», властиву для адаптацп до д\! токсиканту [1,7,15].
Використан нами б\ох\м\чн\ показники, так як вмют в\дновлених т\ол\в, магн\ю та фосфату, е по-лщетермшантними, тому анал\з причин зм\н або по-ст\йност\ !х стану за д\! на орган\зм фенолу потребуе додаткових досл\джень. Разом з тим, сл\д в\дзна-чити, що за к\льк\стю показник\в, як\ зазнають зм\н короп зазнае значного ураження. Одержан результати узгоджуються з даними про нижчий пор\г ток-сичност фенолу для риб, н\ж для ¡нших г\дроб\онт\в [10, 16]. Цей феномен являе ¡нтерес для подаль-шого дослщження, так як для ¡нших забруднювач\в водойм саме ракопод\бн\ та молюски виступають як б\льш вразлив\ [8].
Однаковий характер прооксидантних зм\н актив-ност\ СОД та утворення ТБК-активних продукт\в у коропа з огляду на ц\ спостереження може пояснюва-тись генерац\ею активних форм кисню за участю як безпосередньо фенолу, так \ ¡он\в метал\в, що легко вступають в окисно-в\дновн\ перетворення \ д\ють у кл\тинах як Фентон-метали [9, 13, 15] за умов пору-шення к гомеостазу п\д впливом фенолу.
Отже, характерною рисою токсичност фенолу для досл\джених г\дроб\онт\в е прооксидантн\ зм\ни. Використання кгмычних показник\в не дае ч\тких уяв-лень про характер впливу фенолу на коропа. Разом з тим, визначення вмюту молекул середньо! маси дозволяв оц\нити бтьшу вразливють орган\зму риби до д\! фенолу н\ж ¡нших г\дроб\онт\в.
Висновки. Зг\дно з нашими результатами для використання у б\омаркуванн\ забруднення водойм фенолом можна рекомендувати, як тестовий орга-н\зм коропа, а у якост\ б\о\ндикатор\в використову-вати показники антиоксидантного захисту, а також вмют молекул середньо! маси у гепатопанкреас\ даного виду.
Перспективи подальших дослщжень. Пода л ьш\ досл\дження будуть спрямован\ на вивчен-ня б\ох\м\чних показник\в гепатотоксиност у ¡нших представниюв гiдробiонтiв, зокрема ракоподiбних та молюскiв за умов фенольного забруднення.
Л1тература
1. Арцимович Н. Г. Биологически активные молекулы, ассоциированные с клетками печени / Н. Г. Арцимович, М. С. Ломакин, Д. Б. Казанский, Н. Н. Настоящая // Усп. соврем. биол. - 1991. - Т. 111, № 6. - С. 932 -947.
2. Кородюк М. А. Метод определения активности каталазы / М. А. Кородюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова, В. Е. Токарев // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
3. Леус Ю. В. Перекисне окиснення лтщ1в та антиоксидантний захист у риб пщ впливом фактор1в водного середовища : автореф. дис. на здобуття наукового ступеня канд. бюл. наук : спец. 03. 00. 047 «Пдробюлопя» / Ю. В. Леус. - КиТв, 1998. - 16 с.
4. Николайчик В. В. Способ определения средних молекул / В. В. Николайчик В. М. Моиш, В. В. Кирковский [и др.] // Лаб. дело. - 1991. - № 10. - С. 13-18.
5. Стальная И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И. Д. Стальная, Т. Г. Гаршивили // Современные методы в биохимии. - М. : Медицина, 1977. - С. 66-68.
6. Чевари С. Определение антиоксидантних параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте /
C. Чевари, Т. Андял, Я. Штренгер // Лаб. дело. - 1991. - № 10. - С. 9-13.
7. Цудзевич Б. О. Ксенобютики: накопичення, детоксикащя та виведення з живих оргашзм1в / Б. О. Цудзевич, О. Б. Столяр, I. В. Калшш, В. Г. Юкало. - Тернопть : Вид-во ТНТУ ¡м. I. Пулюя, 2012. - 384 с.
8. Cajaraville M. P. The use of biomarkers to assess the impact of pollution m coastal environments of the Iberian Peninsula: a practical approach / M. P Cajaraville, M. J. Bebianno, J. Blasco [et al.] // Sci. Total Environ. - 2000. - Vol. 247. - P. 295-311.
9. Carter D. E. Oxidation-reduction reactions of metal ions / D. E. Carter // Environ. Health Perspect - 1995. -Vol. 103, № 1. -P. 17-19.
10. International programme on chemical safety «Environmental health criteria 155" [Electronical sours] - http ://www.inchem. rg.
11. Lam P. K. S. Use of biomarkers in environmental monitoring / P. K. S. Lam, R. S. S. Wu // STAP Workshop on the use of bioindi-cators, biomarkers and analytical methods for the analysis of POPs in developing countries. - 2003. - P. 1-77.
12. Livingstone D. R. Biotechnology and pollution monitoring: use of molecular biomarkers in the aquatic environment /
D. R. Livingstone // J. Chem. Technolog. Biotechnolol. - 1993. - Vol. 57. - P. 195-211.
13. Lushchak V. I.. Temperature increase results in oxidative stress in goldfish tissues / V. I.. Lushchak, T. V. Bagnyukova // 2. Antioxidant and associated enzymes. Comp. Biochem. Physiol. - 2006. - Vol. 143, C (1). - P. 36-41.
14. Sediak J. Estimation of total, protein-bound and non-protein sulphhydril groups in tissue with Ellmans Reagent / J. Sediak., R. H. Lindsay // Anal. Biochem. - 1968. - Vol. 25, № 1. - P. 192-205.
15. Stoliar O. B. Environmental Pollution and Oxidative Stress in Fish. In Book: Oxidative Stress - Environmental Induction and Dietary Antioxidants / O. B. Stoliar, V. I. Lushchak // Ed. Lushchak V. In Tech. - 2012. - P. 131-166.
16. Falfushinska H. Responses of biochemical markers in carp Cyprinus carpio from two field sites in Western Ukraine / H. Falfushinska., O. Stolyar // Ecotoxicol. Environ. Saf. - 2009. - Vol. 72 (3). - P. 729-736.
УДК 615. 015
АН АЛ 13 БЮХ1М1ЧНИХ ПРОЦЕС1В У ГЕПАТОПАНКРЕАС1 КОРОПА ЗА ЗАБРУДНЕННЯ ВОДИ ФЕНОЛОМ
Мудра А. 6.
Резюме. Доогмдження проводились на двор1чках коропа лускатого (Cyprinits carpio L.) масою 200-250 г. Одна група тварин була контрольною, ¡ншм у воду додавали 2 мкг/л фенолу. Перюд ¡нкубаци становив 14 äi6. Дослщжувався вплив фенолу на антиоксидазну систему та метаболiчнi функцп гепатопанкреаса коропа.
Згщно наших результа^в, характерною рисою токсичност фенолу для доотджених гщробюн^в е прооксидантн змЫи. Використання кгмычних показниюв не дае чггких уявлень про характер впливу фенолу на коропа. Разом з тим, визначення вмюту молекул середньо! маси дозволяе оцшити бтьшу вразливють оргаызму риби до дм фенолу ыж ¡нших гщробютчв
Ключов1 слова: короп (Cyprinits carpio L.), фенол, забруднення, антиоксидазний захист, бюмаркери.
УДК 615. 015
АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ГЕПАТОПАНКРЕАСЕ КАРПА ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ВОДЫ ФЕНОЛАМИ
Мудра А. Е.
Резюме. Иследование проводилось на двухлетках карпа чешуйчатого (Cyprinits carpio L.) массой 200250 г. Одна группа животных была контрольной, другой в воду добавляли 2 мкг/л фенола. Период инкубации составлял 14 суток. Исследовалось влияние фенола на антиоксидазную систему и метаболические функции гепатопанкреаса карпа.
Согласно наших результатов, характерной чертой токсичности фенола для исследованных гидробионтов являются прооксидантные изменения. Использование клинических показателей не дает четких представлений о характере влияния фенола на карпа. Вместе с тем, определение содержания молекул средней массы позволяет оценить большую уязвимость организма рыбы к действию фенола чем других гидробионтов.
Ключевые слова: карп (Cyprinits carpio L.), фенол, загрязнение, антиоксидазная защита, биомаркеры.
UDC 615. 015
Analysis of the Biochemical Processes State in the Carp Haepathopancreas under the Phenol Contamination of Water
Mudra A. Ye.
Abstract. The phenol contamination problem of natural waters became actual as in Ukraine, as in other countries from the 50ies of the 20th century. It is still actual nowadays because phenol and its homologs are in the dumpings of many enterprises.
Though the phenol toxicity forecast is limited to measurement of phenol emission in water and in animal tissue. Concerning the simpliest phenol homolog C6H5OH it's known that it provokes considerable changes of antioxidant protection enzyme activity in carp organism.
The indexes that characterize the state of antioxidant protection system and are used in clinical analysis of hepa-totoxicity were taken for testing.
The investigations were carried out on carp (Cyprinits carpio L.) with weight of 200-250 g. The animals were caught in summer and adapted to lab conditions within 7 days. They lived in 200 litres pools with well aired water at 18 °C , the quantity of fish is 6-10 animal units. One group of fish was not treated, other was added 2.0 |ig 1-1 of phenol.
As a result of our investigation phenol influence on carp provokes considerable decrease of superoxide dis-mutase. Catalase became an insensible index to phenol action, but changes of renovated glutathione increased.
The main attention was paid to iron homeostasis indicators, which demonstrate significant elevation of unbound iron in the tissue in carp organism. A considerable enhancement of lipids peroxidation is marked too.
Under Index of antioxidative state calculations the integral changes antioxidant-prooxidant status of carp superoxide dismutase has prooxidant trend.
Under phenol influence of the middle mass molecules in carp haepathopancreas decreased twice that indicates the depression of tissue ability to form so-called answer of "acute type" characteristic to adaptation to toxicant action.
It must be stated that carp was hurted. Received results are agreed with data about lower threshold of phenol toxicity for fish then to other hydrocoles in the terms of aforesaid.
The same character of prooxidant changes of superoxide dismutase activity and formation of thiobarbituratic acid reacting substance production can be explained by active form oxygen generation with phenol metals ions participation. The last easily started oxide-reduction transformations and act as Fenton metals if homeostasis is breaking.
So, prooxidant changes are characteristic to phenol toxicity for investigated hydrocoles. The usage of clinic indexes doesn't clear up the character of phenol influence on carp. The determination of the middle mass molecules content of gives the possibility to estimate bigger sensitiveness of fish organism to phenol action than other hydrocoles.
According to our results carp can be used as a test organism or bioindicator in biomarking of polluted waters by phenol. The measuring of the antioxidant-defense system activity and of the middle mass molecules of carp haepathopancreas have been recommended as the biomarker of phenol contamination.
Keywords: carp (Cyprinits carpio L.), phenol, contamination, antioxidant-defense, biomarker.
Рецензент - проф. Гапон С. В.
Стаття надшшла 21. 08. 2014 р.
