CC BY
7
УДК 57.085.2:641.56:615.324 DOI: 10.21323/2071-2499-2018-6-47-49 Библ. 19.
АЛГОРИТМ ОЦЕНКИ IN VITRO ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА
Федулова Л.В., канд. техн. наук, Василевская Е.Р., Котенкова Е.А., канд. техн. наук, Калинова Е.А.
ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: in vitro, модель пищеварения, продукты питания Реферат
Рассмотрены современные методы моделирования желудочно-кишечного тракта для изучения биологической активности пептидных соединений, образующихся в процессе переваривания. Авторами предложена модель пищеварения in vitro для изучения физиологических эффектов пищевых продуктов функциональной и специализированной направленности, а также биологически активных добавок.
ALGORITHM OF IN VITRO ASSESSMENT FOR PRODUCTS CONTAINING BIOACTIVE SUBSTANCES
Fedulova L.V., Vasilevskaya E.R., Kotenkova E.A., Kalinova E.A.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: in vitro, digestion model, food Summary
The article deals with modern models of gastrointestinal tract to study biological activity of peptide compounds formed during digestion. The authors propose digestion model in vitro to study functional and specialized food products physiological effects, as well as biologically active additives.
Продукты питания помимо пластических пищевых веществ содержат также соединения, оказывающие благотворное влияние на здоровье. Согласно последним исследованиям в пищевых продуктах как животного и растительного, так и микробного происхождения содержатся в значительных количествах биоактивные органические соединения.
Среди растительных источников, содержащих физиологически активные белки, углеводы, каротиноиды и фенольные соединения, определены и широко используются злаковые и бобовые культуры, пряности и другие. Установлено, что пшеничные и соевые белки помимо улучшения технологических свойств - связывания воды и жира, несут позитивные для здоровья эффекты, предотвращая метаболические заболевания, ишеми-ческую болезнь сердца и рак толстой кишки [1, 2]. Внесение в продукты экстрактов розмарина, шалфея, зеленого чая, цитрусовых корок, кунжутного семени способствует не только улучшению вкуса и текстуры, торможению окисления липидов, но и повышает адаптогенные способности организма за счет выраженных антиоксидантных свойств [3].
Эндогенные пептиды являются одним из основных трендов при изучении биоактивных веществ сырья животного происхождения. На настоящий момент известно, что идентифицированные функциональные пептиды, нативно присутствующие в животных белках, приобретают выраженное биокоррегирующее
действие в процессе технологической обработки, а также в процессе трансформации при прохождении желудочно-кишечного тракта. Данные соединения доказанно обладают анти-амнестическим, антитромботическим, иммуномодулирующим, опиоидными эффектами, антибактериальной, ан-тиоксидантной и гипотензивной активностью и другими [4, 5]. В качестве примеров можно привести сыровялен-ные и ферментированные мясные продукты - хамон, свиные колбасы «Чоризо», «Петровац» и кантонскую колбасу, в которых выявлены пептиды, обладающие антиоксидантными и гипотензивными свойствами [6].
Ввиду особенностей исследования эффективности потенциальных биологически активных компонентов пищевых продуктов остро встала необходимость обобщения современных подходов к изучению их характеристик.
Традиционно биологическую активность веществ, в том числе бел-ково-пептидной природы, определяют с использованием различных биотест-систем, при этом в России наиболее часто используют лабораторных животных. Однако современные концепции научных исследований направлены на внедрение в практику альтернативных методов биомоделирования, позволяющих не только рационализировать использование лабораторных животных в медико-биологических исследованиях, но также прогнозировать и оценивать механизмы действия исследуемых веществ. Биологические методы in vitro, где объектами иссле-
дования являются культуры клеток, сделали возможным исследование взаимодействия биоактивных веществ напрямую с клеткой и определение их влияния на клеточные и субклеточные структуры, исключая компенсаторные и регуляторные механизмы целостного организма, имеющие место при исследованиях in vivo [7].
В данной статье сделана попытка сформулировать алгоритм исследования методом in vitro продуктов питания, потенциально содержащих биологически активные вещества животного происхождения.
Традиционно комплексная оценка характеристик биоактивных соединений животного происхождения основывается на базе физико-химических исследований объектов, включающих в себя скрининг аминокислот и жирных кислот, составление белкового и пептидного профилей, с последующим биоинформационным анализом [8, 9]. По полученным данным определяется перечень целевых веществ, потенциально обладающих биологической активностью, и составляется программа подтверждения или обоснования их эффективности биологическими методами.
Современные методы in vitro, направленные на изучение эффективности и выполняемые преимущественно на клеточных культурах, рассчитаны на использование в качестве объектов чистых моновеществ или их смесей, в связи с чем продукты питания функциональной и специализированной направленности, а также биологически активные добавки, ввиду их многоком-
2018 | № 6 ВСЕ О МЯСЕ
понентности и разнообразия, являются достаточно сложными объектами для такого исследования. В связи с чем для продуктов питания необходимо включение этапов экстракции, гидролиза или фракционирования для разделения и концентрирования потенциальных активных веществ. Одним из наиболее интересных методов при этом является система переваривания in vitro ввиду максимальной близости к физиологическим процессам, что является ключевым критерием к оценке пищевых продуктов.
Многие модели пищеварения in vitro, описанные до сих пор, остаются достаточно упрощенными по сравнению с естественными условиями и статичными.
Процессы, происходящие в желудке, воспроизводятся с помощью гидролиза ферментами гомогенизированного объекта при фиксированном кислотно-щелочном балансе (рН 1-2) и температуре (37 °C) в течение определенного времени (60-180 мин) [10]. Иногда схему исследования расширяют дополнительным этапом имитации работы тонкого кишечника посредством использования ферментов поджелудочной железы с желчью или без (рН 6-7). Подобные модели обычно используются для конкретных целей: оценки усвояемости белка, крахмала или для оценки распада и растворения лекарственных препаратов. Более сложные - статические модели могут включать в себя этап удаления конечных продуктов расщепления или могут быть дополнены процессом, имитирующим частичные моторные функции желудка. Однако данные модели не предусматривают такие динамические характеристики, как тонические и перистальтические сокращения, непрерывное изменение рН и температуры, различные скорости потока содержимого желудка. Для решения этой проблемы были разработаны динамические модели пищеварения. Среди прочих можно выделить систему, состоящую из трех последовательных отсеков. В первом отсеке происходит смешение желудочных соков с пищей, во втором - имитируется перемешивание и сокращение желудка, далее «полупереваренное» содержимое (мельчайшие частицы) попадает в третий отсек посредством клапана, при этом более крупные нагреваются
и с обратным холодильником попадают в предыдущую камеру, чтобы перевариться повторно [11]. Также разработана динамическая модель верхних отделов ЖКТ, состоящая из реакторов (37 °C), один моделировал условия желудка, а второй - двенадцатиперстной кишки [12].
Для изучения выживания различных пробиотических бактерий и их взаимодействия с кишечной микрофлорой человека и животных [13, 14, 15] была разработана комплексная система, включающая модели верхнего пищеварительного тракта TIM-1 и модели TIM-2 толстой кишки человека. TIM-1 состоит из четырех условных отсеков: желудок, двенадцатиперстная, тощая и подвздошная кишки. Компьютерное управление позволяет регулировать работу клапанов каждого из отсеков, поддерживать постоянную температуру (37 °C) и рН путем добавления соляной кислоты, а гибкие стенки имитируют перистальтические движения. Физиологические условия здоровых взрослых людей имитируются добавлением желчных кислот и ферментов поджелудочной железы. В модели кишечника TIM-2 такие параметры, как температура (37 °C), pH [16] и перистальтические движения также контролируются компьютером, но дополнительно в систему включены полупроницаемые полые волокна для удаления микробных метаболитов и воды. Целью исследования F. Kong [16] было создание модели желудка человека, учитывающей непрерывную перистальтику с одинаковой амплитудой и частотой. Система состоит из латексной камеры, стенки которой приводит в движение механическая система привода, также помимо секреции и опорожнения системы происходит постоянный контроль температуры. Несмотря на достаточно близкую имитацию изменений физико-химических свойств желудочного содержимого и превращения пищевых компонентов, даже в данном случае обеспечивается лишь частичное представление о пищеварении.
В экспериментальной клинике-лаборатории биологически активных веществ животного происхождения ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН для исследования биологических эффектов мясных про-
дуктов была адаптирована модель «искусственного желудка» [14]. Образцы продуктов подвергались воздействию имитированных пищеварительных жидкостей с фиксированным значением рН в течение определенного времени, основываясь на физиологии человека. Для моделирования экспериментального пищеварения все компоненты желудочно-кишечного тракта (слюна, желудочный сок и кишечная жидкость) были предварительно нагреты до физиологической температуры тела человека до 37 °C.
Для имитирования пережевывания мясного продукта в их натуральном виде был предложен этап измельчения соответствующего количества объектов (5 г) до размера частиц 3±0,5 мм. Далее добавлялся щелочной раствор слюны (3,5 мл) для создания пастообразной консистенции, 0,5 мл а-амилазы, 25 мкл 0,3 М хлорид кальция и 975 мкл дистиллированной воды и тщательно перемешивался в течение 2 мин. Имитирование желудочного пищеварения в течение 120 мин. обеспечивалось путем смешивания 10 мл жидкого перораль-ного содержимого с 7,5 мл раствора желудочного сока, с последующим добавлением 1,6 мл раствора свиного пепсина (25000 Ед/мл), полученного в исходном растворе желудочного сока и 5 мкл 0,3 М хлорида кальция. Для снижения рН до физиологического значения (рН желудка 3,0) добавляли 0,4 мл 1 М соляной кислоты и 0,495 мкл дистиллированной воды. Далее моделировалось кишечное пищеварение в течение 130 мин., при котором 20 мл желудочного химуса смешивалось с 10 мл кишечной жидкости, содержащей 5,0 мл раствора свиного панкреатина (800 Ед/мл), 1,5 мл консервированной бычьей желчи и 40 мкл 0,3 М хлорида кальция. Для нейтрализации смеси до рН 7,0 добавляли 0,6 мл 1 М гидроксида натрия и 986 мкл дистиллированной воды.
Нейтрализованную смесь ультрацентрифугировали с использованием пробирок Amicon Ultra 4 (размер пор до 3 кДа) для получения низкомолекулярных фракций продуктов.
Полученные по данной методике продукты переваривания мясных изделий обладали оптимальными характе-
ВСЕ О МЯСЕ № 6 | 2018
ристиками, позволяющими проводить дальнейшие исследования, например, оценки механизма их биологической активности (в частности, с использованием культур клеток).
Заключение
В завершении хотелось бы отметить, что выбор наиболее подходящей модели пищеварения продуктов питания in vitro требует тщательной оценки преимуществ и ограничений, предоставляемых каждым типом системы. Несмотря на то, что невозможно полностью имитировать общие пищеварительные параметры в моделях in vitro, их применение позволяет получить продукты переваривания исследуемых объектов. При этом получаемые фракции будут максимально приближены к веществам, потенциально образующимся в организме в процессе переваривания. Далее физико-химическим анализом возможно идентифицировать продукты расщепления и выявить среди них функциональные пептиды, подобрать оптимальные методы оценки их эффективности in vitro, что, в свою очередь, позволит более точно охарактеризовать биологическую активность продукта.
Стоит отметить, что сегодня все больше исследований направлено на всестороннее изучение воздействия пищи на здоровье человека на молекулярном уровне, что требует инструментов, позволяющих оценить не только трансформацию веществ, но и биодоступность, биомолекулярные взаимодействия и биологическую активность низкомолекулярных компонентов пищи [17, 18]. Такие исследования невозможны без систем пищеварения in vitro. Актуальной задачей биомоделирования сегодня является разработка методов, позволяющих изучать взаимодействия геномов пищевых продуктов, кишечной микробиотой и геномом человека [19].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
REFERENCES:
1. Chatterjee, C. Soybean Bioactive Peptides and Their Functional Properties / C. Chatterjee, S. Gleddie, C.W. Xiao // Nutrients. — 2018. — № 10. — P. 1211. [https://doi.org/10.3390/nu10091211].
2. Cicero, A.F.G. Food and plant bioactives for reducing cardiometabolic disease risk: An evidence based approach / A.F.G. Cicero, F. Fogacci, A. Colletti // Food Funct. — 2017. — № 8. — P. 2076-2088.
3. Eric, A. Healthier meat products as functional foods / A. Eric, E.A. Decker, Y. Park // J. Meat Science. — 2010. — V. 86. — № 1. — P. 49-55.
4. Olmedilla-Alonso, B. Development and assessment of healthy properties of meat and meat products designed as functional foods / B. Olmedilla-Alonso, F. Jiménez-Colmenero, F.J. Sánchez-Muniz // Meat science. — 2013. — № 95. — P. 919-930.
5. Lafarga, T. Bioactive peptides from meat muscle and by-products: generation, functionality and application as functional ingredients / T. Lafarga, M. Hayes // Meat science. — 2014. — № 98. — P. 227-239.
6. Escudero, E. Antihypertensive effect and antioxidant activity of peptide fractions extracted from Spanish dry-cured ham / E. Escudero, M.C. Aristoy, H. Nishimura, K. Arihara, F. Toldra // Meat Sci. — 2012. — V. 91. — № 3. — P. 306-311.
У. Anisimov, V.N. Peptide bioregulation of aging: results and prospects / V.N. Anisimov, V. Kh. Khavinson // Bioger-ontology. - 2010. - V. 10. - P. 1З9-149.
8. Chernukha, I.M. Identification of tissue-specific proteins and peptides forming innovative meat products corrective properties to confirm authenticity of meat raw materials / I.M. Chernukha, N.L. Vostrikova // Foods and Raw Materials. — 2018. — T. 6. — № 1. — P. 201-209.
9. Чернуха, И.М. Протеомика как инструмент для изучения качества мяса / И.М. Чернуха, Н.Л. Вос-трикова, Я.С. Манюхин // Все о мясе. — 2016. — № 2. — С. 3-8.
Chernukha, I.M. Proteomika kak instrument dlya izucheniya kachestva myasa [Proteomics as a tool for the study of meat quality] / I.M. Chernukha, N.L. Vostrikova, Y.S. Manyukhin // Vsyo o myase. — 2016. — № 2. — P. 3-8.
10. Guerra, A. Relevance and challenges in modeling human gastric and small intestinal digestion / A. Guerra, L. Etienne-Mesmin, V. Livrelli, S. Denis, S. Blanquet-Diot, M. Alric // Trends in Biotechnology. — 2012. — V. 30. — № 11. — P. 591-600.
11. Mercuri, A. The effect of composition and gastric conditions on the self-emulsification process of ibupro-fen-loaded self-emulsifying drug delivery systems: a microscopic and dynamic gastric model study / A. Mercuri, A. Passalacqua, M.S. Wickham, R.M. Faulks, D.Q. Craig, S.A. Barker // Pharm. Res. — 2011. — № 28. — P. 1540-1551.
12. Mainville, I. A dynamic model that simulates the human upper gastrointestinal tract for the study of probiotics / I. Mainville, Y. Arcand, E.R. Farnworth // Int. J. Food Microbiol. — 2005. — № 99. — P. 287-296.
13. Minekus, M. A multicompartmental dynamic computer-controlled model simulating the stomach and the small intestine / M. Minekus, P. Marteau, R. Havenaar // Alternatives to Laboratory Animals. — 1995. — V. 23. — № 2. — P. 197-209.
14. Hatanaka, M. Influence of Bacillus subtilis C-3102 on microbiota in a dynamic in vitro model of the gastrointestinal tract simulating human conditions / M. Hatanaka, Y. Nakamura, A.J.H. Maathuis, K. Venema, I. Murota and N. Yamamoto // Benef Microbes. — 2012. — V. 3. — № 3. — P. 229-236.
15. Charteris, W. Development t and application of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract / W. Charteris, P. Kelly, L. Morelli, J.K. Collins // Journal of Applied Microbiology. — 1998. — № 84. — P. 759-768.
16. Kong, F. A human gastric simulator (HGS) to study food digestion in human stomach / F. Kong, R.P. Singh // J. Food Sci. — 2010. — № 75. — E627-E635.
17. Yao, S. Peptidomics of potato protein hydrolysates: implications of post-translational modifications in food peptide structure and behavior / S. Yao, C.C. Udenigwe // R Soc Open Sci. — 2018. — V. 5. — № 7. — P. 172425. [https://doi.org/10.1098/rsos.172425].
18. Lacroix, I.M.E. Investigation into the bioavailability of milk protein-derived peptides with dipeptidyl-peptidase IV inhibitory activity using Caco-2 cell monolayers / I.M.E. Lacroix, X.M. Chen, D.D. Kitts, E.C.Y. Li-Chan // Food Funct. — 2017. — V. 8. — № 2. — P.701-709. [https://doi.org/10.1039/c6fo01411a].
19. Bayram, B. Breakthroughs in the health effects of plant food bioactives: a perspective on microbiomics, nutri(e-pi)genomics, and metabolomics / B. Bayram, A. Gonzalez-Sarrias, G. Istas, M. Garcia-Aloy, C. Morand, K. Tuohy, R. Garcia-Villalba, P. Mena // J Agric Food Chem. — 2018. — V. 66. — № 41. — P. 10686-10692. [https://doi. org/10.1021/acs.jafc.8b03385].
© КОНТАКТЫ:
Федулова Лилия Вячеславовна а l.fedulova@fncps.ru Василевская Екатерина Романовна а e.vasilevskaya@fncps.ru
Котенкова Елена Александровна а lazovlena92@ya.ru Калинова Евгения Андреевна а jane135@mail.ru
Уважаемые читатели!
В журнале «Все о мясе» № 4 за 2018 год в статье «Упаковка колбасных изделий: ключевые факторы, определяющие стабильность качества» авторов Ревуцкой Н.М., Насоновой В.В., Милеенковой Е.В на стр. 19 допущена ошибка в библиографическом описании ссылок № 7 и № 8 Списка литературы в фамилии автора статей: «Натуральные оболочки в зеркальном отражении», журнал «Мясная сфера», 2010, № 1, С. 52-56 и «Проницаемые оболочки: разбираемся в колбасных обрезках», журнал «Мясная сфера», 2010, № 3, С. 56-62 . Фамилию автора следует читать: Загоровская, В. Редакция журнала приносит свои извинения автору статей и редакции журнала «Мясная сфера».
2018 I № 6 ВСЕ О МЯСЕ
