CC BY
30
УДК 57.085.2:641.56:615.324 DOI: 10.21323/2071-2499-2019-6-42-44 Библ. 22.
МЕТОДОЛОГИЯ ИЗУЧЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ И ВСАСЫВАНИЯ БЕЛКОВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ IN VITRO
Василевская Е.Р., Ахремко А.Г., Грызлова А.С., Иванова Е.А.
ФНЦ пищевых систем им. В. М. Горбатова
Ключевые слова: моделирование желудка, in vitro, белковый мясной продукт Реферат
Представлены актуальные подходы к изучению биодоступности, выявлению функциональной активности и прогнозированию потенциальных негативных эффектов белков пищевых продуктов in vitro. Приведены наиболее предпочтительные и максимально приближенные к физиологическим условиям человеческого организма тест-системы. Авторы рассматривают автономные и комплексные модели процесса переваривания, включающие использование ферментов и изменение различных параметров кислотно-основной среды и солей, при этом отмечается необходимость проведения исследований с участием лабораторных животных для оценки кинетики расщепления, метаболизма и выведения белков. Отдельным блоком представлены методы оценки проницаемости, всасывания и метаболизма белков и их метаболитов: диализные мембраны в качестве наиболее простого и надёжного способа оценки проницаемости и всасывания, камеры Уссинга для изучения транспорта веществ через биологические мембраны перфузированных органов, применение специализированных клеточных линий с учётом индивидуальных особенностей культуры.
IN VITRO METHODOLOGY FOR DIGESTION AND ABSORPTION OF FOOD PROTEINS STUDY
Vasilevskaya E.R., Akhremko A.G., Gryzlova A.S., Ivanova E.A.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: digestion model, in vitro, protein meat product
Summary
The article presents relevant approaches to food protein study bioavailability, functional activity identification and potential negative effects prediction in vitro. The most preferred and the closest to human body physiological conditions test systems are presented. Authors consider digestion processes' autonomous and complex models, including enzymes and changes in various parameters of the acid-base medium and salts, and studies on laboratory animals necessity to assess the kinetics of protein breakdown, metabolism, and excretion is noted. Separate chapter presents methods for assessing proteins permeability, absorption and metabolism and its metabolites: dialysis membranes as the most simple and reliable way to assess permeability and absorption, Ussing chambers for studying substances transport through biological membranes of perfused organs, use of specialized cell lines taking into account individual characteristics of the culture.
Введение
Среди всех макромолекул в организме белки играют наиболее динамичную и разнообразную роль - катализируют биохимические реакции, формируют рецепторы и каналы в мембранах, обеспечивают поддержку цитоскелета клетки и её элементов, переносят различные ли-ганды через клеточную мембрану, внутри клетки, а также из одного органа в другой.
Большая часть физиологической активности белков осуществляется зашифрованными в них пептидными последовательностями, которые становятся активными при расщеплении исходного белка. Известно, что образующиеся при обработке продуктов (гидролиз, термическое воздействие, ферментация, созревание мяса и пр.), а также в процессе пищеварения пептиды могут обладать многочисленными свойствами, среди наиболее изученных - антигипертен-зивные, антимикробные, антитромботи-ческие, иммуномодулирующие, опиоид-ные, антиоксидантные и минеральные функции связывания [1].
В связи с этим изучение переваривания и биодеградации белковых компонентов пищевых продуктов и сырья является весьма актуальным. Накопленные знания о процессах пищеварения свидетельствуют о том, что основные превращения белки претерпевают в условиях комбинации полостного и мембранного пищеварения, при этом начальные этапы гидролиза надмолекулярных комплексов и макромолекул - белков или продуктов их неполного гидролиза, а также углеводов, жиров - происходят в нейтральной и слабокислой среде тонкого кишечника
с обязательным присутствием эндоги-дролаз, секретируемых клетками поджелудочной железы [2]. Однако всё ещё остаётся много вопросов, касающихся аспектов переваривания, элиминации и всасывания белков, содержащихся в пищевых продуктах и сырье.
Так, известно, что результатом расщепления пищевых белков в ряде случаев являются негидролизованные короткие пептиды, которые, в отличие от аминокислот, могут обладать непосредственно как позитивными, функциональными, свойствами, так и гаптенностью - антигенными свойствами - вызывать иммунную реакцию организма. Установлено, что наиболее иммунногенными являются пептиды, состоящие из 8-10 аминокислот, так как именно такой размер является оптимальным для закрепления между цепей молекулы главного комплекса ги-стосовместимости МНС-II для дальнейшей презентации фрагментов антигена Т-лимфоцитам.
Кроме того, исследованиями последних лет доказаны риски образования неперевариваемых белковых агрегатов [3], негативно влияющих на организм посредством развития воспалительных реакций в слизистой оболочке кишечника. Причём для полноценных животных белков, усвояемость которых в нативном виде превышает 90 %, вероятность образования агрегатов при обработке высокой температурой в течение длительного времени достигает 35 % [4].
Таким образом, необходимо развивать методологические подходы к проведению экспериментов in vitro и ex vivo с учётом процессов переваривания и вса-
сывания не только для изучения биологической ценности, биодоступности и выявления функциональной активности, но и для прогнозирования потенциальных негативных эффектов.
В данной статье представлен аналитический обзор различных систем in vitro для изучения переваривания, элиминации и всасывания белковых соединений, в том числе входящих в состав пищевых продуктов.
Моделирование процессов переваривания
Наиболее широко применяемым в экспериментальных исследованиях способом получения коротких пептидов является гидролиз. При этом среди гидротермического, кислотного, щелочного и ферментативного способов предпочтение отдаётся последнему [5, 6]. Ферментативный гидролиз широко применяется для улучшения физических, химических, функциональных и пищевых свойств исходных белков. Кроме того, данный процесс протекает в условиях, близких к физиологическим, с использованием протеиназ, определённых параметров температуры и рН, что позволяет получить приближённую к реальности картину. Ферментативный гидролиз также является эффективным методом для изучения функциональных белков и пептидов, используется в качестве подготовки белковых соединений перед масс-спектрометрической идентификацией методом матрично-активиро-ванной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) с использованием модели переваривания протеолитических ферментов «трипсин к пепсину».
ВСЁ О МЯСЕ № Б | 2019
Ввиду того, что процесс переваривания является достаточно сложным как с физиологической, так и с химической точки зрения, в настоящий момент активно развивается направление моделирования условий желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Существуют различные методики и рекомендации по созданию таких моделей, однако наибольшей популярностью пользуются модели с применением одно- и двухком-понентных смесей ферментов. Так, для изучения биодоступности пищевых белков и пептидов широко известны модели на основе панкреатина (в случае с гидролиза-том казеина [7]), а также в сочетании панкреатина и пепсина свиного (для молочных смесей, молочных белков и грудного молока [8]). Интересными являются способы имитирования жидкостей разных отделов ЖКТ, в которых используются ферменты альфа-амилаза, трипсина химотрипсин, липаза, а также желчные соли [9]. Такие модели могут успешно применяться для исследования готовых продуктов питания (колбас, сыров, сухого молока, фруктовых соков и пр.). Примером может служить модель с использованием «желудочного» и «дуоденального» соков человека, также на основе свиного пепсина [10].
Помимо этого, существует многосоставная модель переваривания с имитацией отделов ЖКТ, включающая следующие стадии с соответствующими растворами ферментов и рН: «ротовая полость», «желудок», в котором моделируют перемешивание исследуемого объекта с «желудочными соками», и «двенадцатиперстную кишку», в которой в смесь добавляются «дуоденальные соки» [11, 12].
Стоит отметить, что при исследовании пищевых белков и продуктов наиболее предпочтительны максимально приближённые к физиологическим условиям человеческого организма модели переваривания, включающие не только соответствующие ферменты, но и различные параметры кислотно-основной среды и соли, что необходимо для расщепления белков на короткие пептиды и аминокислоты; жиров - на этерефицированные и неэтере-фицированные жирные кислоты; углеводов - на моно-, ди- и полисахариды.
Изучение продуктов расщепления биополимеров пищи сегодня проводится с использованием широкого спектра хромато-масс-спектрометрических методов [13]. Например, для идентификации неизвестных соединений, полученных после ферментолиза сложных образцов (многокомпонентных систем), используют времяпролетную масс-спектрометрию (ЕБМОР и Б5!-дТОР) [14, 15]. Немаловажным также является изучение кинетики расщепления, метаболизма и выведения
белков, что невозможно сделать вне организма. Такие исследования преимущественно проводят на лабораторных животных: мышах, крысах, кроликах, собаках, а также свиньях. При этом основными видами биологического материала являются содержимое желудка, кишечника, фекалии, кровь, плазма или сыворотка, моча, а также различные органы и ткани. Например, в работе Боузерзюр и др. (2012) на поросятах, которым скармливали детскую смесь, продемонстрировано, что некоторые аминокислотные остатки при переваривании являются устойчивыми к протеолизу [16], что согласовывается с ранее полученными данными о том, что фосфорилированные фрагменты пептидов являются стабильными, кроме того, гидрофобные аминокислоты практически не подвергаются перевариванию, тогда как нейтральные и основные аминокислоты быстро гидролизуются [17].
Моделирование процессов всасывания
Немаловажной составляющей экспериментов по изучению преобразования белков и биодоступности их метаболитов являются эксперименты по оценке их проницаемости, всасыванию и метаболизму. На настоящий момент широко применяются такие методы, как диализ, иссечённые ткани, установленные на камере Уссинга, перфузированные органы, а также выращенные из клеток монослои или слои кишечника.
Диализ является наиболее проверенным и простым способом исследования проницаемости и всасываемости. Широкое распространение приобрёл в середине XX века для гемодиализа. В исследованиях белков и пептидов данный метод начал применяться в 1960-1970-х годах, при этом в качестве диализных мембран сначала использовались плёнки из целлюлозы. Сегодня существует огромный выбор синтетических мембран из полимеров - поликарбоната, полиамида, полисульфона, поли-этилвинилалкоголя и других, имеющих широкий диапазон размеров пор. Учитывая, что кишечные ворсинки человека способны пропускать все вещества, молекулярная масса которых ниже молекулярной массы альбумина, целесообразно использование мембран с размером пор 6065 кДа [18]. Для оценки степени «прохождения» белка или продуктов его распада через мембрану используют как качественные, так и количественные методы, среди которых особую популярность приобрели спектрофотометрические, основанные на качественных реакциях. В зависимости от концентрации веществ в конечном растворе можно использовать определение белка
по биуретовой реакции (в диапазоне 0,55,0 мг/мл); метод Брэдфорда (для диапазона концентраций 5,0-100,0 мкг/мл); метод Лоури (диапазон концентраций от 10,0 до 20,0 мкг/мл) и другие [19].
Среди способов моделирования всасывания в приближённых к ЖКТ условиям можно обозначить модель «Камера Уссинга», названную в честь Ханса Уссинга, который в 1949 году доказал существование активного транспорта веществ через биологические мембраны на примере кожи лягушки. Данный метод представляет собой камеру с расположенной в ней стенкой тонкого кишечника, которая установлена между двумя буферными растворами, снабжёнными резервуарами для подачи газа для имитирования физиологических условий. Исследуемый образец добавляют в раствор со стороны слизистой оболочки (или серозной, в зависимости от целей исследования для изучения перемещения веществ в абсорбционном или секреторном направлении) [20]. Также исследования процессов всасывания проводят на перфузированных органах, в частности, петлях кишечника, в который помещают исследуемый образец [21].
В последнее время активно развиваются направления исследования процессов проницаемости и всасывания с использованием монослоя клеток, в частности, используются стандартизированные клеточные линии аденокарциномы кишечника (СаСо-2) и карциномы кишечника (НТ-29) [22].
Примерный ход эксперимента можно представить следующим образом: клетки помещают в стерильные планшеты с лунками, покрытыми пористой мембраной для закрепления клеток, и заполняют их питательной средой, содержащей питательную сыворотку ДМ ЕМ с 1_-глута-мином, бычью, телячью сыворотку 10% и пенициллин-стрептомицин. Для образования монослоя клетки выращивают в течение 18-20 суток при температуре 37 °С и содержанием СО2-5%, заменяя питательную среду один раз в 2-3 суток. К моменту, когда клетки образуют на поверхности пористой мембраны монослой, сливают питательную среду и заменяют её другой, содержащей исследуемое вещество в необходимой концентрации. Далее клетки продолжают инкубировать в течение 2-3 дней, после чего отбирают пробы из апикальной и базолатеральной камеры и проводят качественные и количественные исследования, оценивая количество испытуемого образца. Такие модели являются популярными ввиду воспроизводимости и надёжности при постановке экспериментов по изучению механизмов клеточной абсорбции.
2019 | № Б ВСЁ О МЯСЕ
К сожалению, использование лишь модели in vitro на клеточных линиях CaCo-2 - имеет некоторые ограничения и не может являться достаточным ввиду отсутствия ряда физиологических факторов, среди которых немаловажным является слизь, влияющая на экспрессию переносчиков поглощения и пр. Одним из путей решения этого вопроса является использование совместного культивирования нескольких линий. Например, объединение клеточных линий СаСо-2 и НТ-29 в соотношении 75% к 25% приводило к образованию слоя слизи вследствие присутствия муцин-секретирующих бокаловидных клеток, способствующих модулированию плотности монослоя.
Выводы
Методология изучения переваривания и всасывания белков пищевых продуктов in vitro
При изучении процессов переваривания и всасывания белков пищевых продуктов методами in vitro, особенно при значительном содержании биоактивных белков или функционально значимых пептидов, наиболее предпочтительны максимально приближённые к физиологическим условиям человеческого организма модели переваривания, включающие не только соответствующие ферменты, но и различные параметры кислотно-основной среды и соли, что необходимо для полного расщепления биополимеров пищи. При этом не стоит забывать о том, что всасывание, распределение, метаболизм и выведение различных соединений являются взаимосвязанными процессами, на которые влияет множество факторов. Среди свойств, определяющих характер всасывания, можно отметить вид продукта или ингредиента, содержания основных нутриентов и минорных веществ, рН среды, перистальтику, а также состояние и площадь поверхности всасывания. Распределение и биотрансформацию продукта или ингредиента определяют заболевания, индивидуальные различия, в том числе соматическое состояние и состояние ферментативных систем макроорганизма, а также пол и возраст. Нельзя не отметить важную роль сочетанных факторов, в частности других нутриентов, токсинов и ядов, которые также надо учитывать при подборе методологических характеристик исследования.
© КОНТАКТЫ:
Василевская Екатерина Романовна a e.vasilevskaya@fncps.ru Ахремко Анастасия Геннадьевна a a.ahremko@fncps.ru
Грызлова Александра Сергеевна a al.gryzlova@gmail.com Иванова Екатерина Андреевна a katyrinaiv2009@mail.ru&
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
REFERENCES:
1. Chakrabarti, S. Food-Derived Bioactive Peptides in Human Health: Challenges and Opportunities / S. Chakrabarti, S. Guha, K. Majumder // Nutrients. — 2018. — V. 10. — № 11. — P. 1738. D0l:10.3390/nu10111738.
2. Langerholc, T. Novel and established intestinal cell line models — An indispensable tool in food science and nutrition / T. Langerholc, P. A. Maragkoudakis, J. Wollgast, L. Gradisnik, A. Cencic // Trends in Food Science & Technology. — 2011. — № 22. — P. 11-20. DOI: 10.1016/j.tifs.2011.03.010.
3. Chernukha, I. M. Detection of protein aggregation markers in raw meat and finished products / I. M. Chernukha, L. I. Kovalev, N. G. Mashentseva, M. A. Kovaleva, N. L. Vostrikova // Foods and Raw Materials. — 2019. — V. 7. — № 1. — P. 118-123. DOI: 10.21603/2308-4057-2019-1-118-123.
4. Oberli, M. Compared with Raw Bovine Meat, Boiling but Not Grilling, Barbecuing, or Roasting Decreases Protein Digestibility without Any Major Consequences for Intestinal Mucosa in Rats, although the Daily Ingestion of Bovine Meat Induces Histologic Modifications in the Colon / M. Oberli, A. Lan, N. Khodorova, V. Sante-Lhoutellier, F. Walker, et al. // The Journal of Nutrition. — 2016. — V. 146 (8). — P. 1506-1513. DOI:10.3945/jn.116.230839.
5. Федулова, Л. В. Применение альтернативных мето- Fedulova, L. V. Primeneniye al'ternativnykh metodov дов биомоделирования для изучения эффективности biomodelirovaniya dlya izucheniya effektivnosti funktsion-функциональных продуктов питания / Л. В. Федуло- al'nykh produktov pitaniya [Alternative methods of biomod-ва, Е. Р. Василевская, Е. А. Котенкова, Э. Б. Кашинова eling for functional food products effectiveness research] / // Food systems. — 2018. — Т. 1. — № 3. — С. 33-37. DOI: L. V. Fedulova, Ye. R. Vasilevskaya, Ye. A. Kotenkova, 10.21323/2618-9771-2018-1-3-33-37. E. B. Kashinova // Food systems. — 2018. — T. 1. — № 3. —
P. 33-37. DOI: 10.21323/2618-9771-2018-1-3-33-37.
6. Tapal, A. Nutritional and Nutraceutical Improvement by Enzymatic Modification of Food Proteins / A. Tapal, P. K. Tiku // Enzymes in Food Biotechnology. — 2019. — P. 471-481. D0I:10.1016/B978-0-12-813280-7.00027-X.
7. Maeno, M. Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysates produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790 / M. Maeno, N. Yamamoto, T. Takano // Journal of Dairy Science. — 1996. — № 79. — P. 1316-1321. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(96)76487-1.
8. Hernandez-Ledesma, B. Identification of bioactive peptides after digestion of human milk and infant formula with pepsin and pancreatin / B. Hernandez-Ledesma, A. Quiros, L. Amigo, I. Recio // International Dairy Journal. — 2007. — № 17. — P. 42-49. DOI: 10.1016/j.idairyj.2005.12.012.
9. Sánchez-Rivera, L. Peptidomics for discovery, bioavailability and monitoring of dairy bioactive peptides / L. Sánchez-Rivera, D. Martínez-Maqueda, E. Cruz-Huerta, B. Miralles, I. Recio // Food Research International. — 2014. — № 63. — P. 170-181. DOI: 10.1002/9780813811048.ch21. 10. Minekus, M. A standardized static in vitro digestion method suitable for food — an international consensus. Royal Society of Chemistry / M. Minekus, M. Alminger, et al. // Food & Function. — 2014. — № 5. — P. 1113-1124. DOI: 10.1039/c3fo60702j.
11. Mainville, I. A dynamic model that simulates the human upper gastrointestinal tract for the study of probiotics / I. Mainville, Y. Arcand, E. R. Farnworth // Int. J. Food Microbiol. — 2005. — № 99. — P. 287-296. DOI: 10.1016/j.ijfood-micro.2004.08.020.
12. Федулова, Л. В. Алгоритм оценки in vitro продуктов Fedulova, L. V. Algoritm otsenki in vitro produktov pitaniya, питания, содержащих биологически активные веще- soderzhashchikh biologicheski aktivnyye veshchestva [Algo-ства / Л. В. Федулова, Е. Р. Василевская, Е. А. Котен- rithm for evaluating in vitro food products containing biolog-кова, Е. А. Калинова // Все о мясе. — 2018. — № 6. — ically active substances] / L. V. Fedulova, Ye. R. Vasilevskaya, С. 47-49. DOI:10.21323/2071-2499-2018-6-47-49. Ye. A. Kotenkova, Ye. A. Kalinova // Vsyo o myase. — 2018. —
№ 6. — P. 47-49. D0I:10.21323/2071-2499-2018-6-47-49.
13. Иванникова, Е. В. Исследование фармакокинетики и биодоступности в создании новых оригинальных лекарственных средств пептидной структуры и их оптимальных лекарственных форм / Е. В. Иванникова, В. П. Жердев, С. С. Бойко, Е. В. Блынская, К. Г. Турчинская, К. В. Алексеев // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2013. - № 2. - С. 1-17.
Ivannikova, Ye. V. Issledovaniye farmakokinetiki i biodostupno-sti v sozdanii novykh original'nykh lekarstvennykh sredstv pep-tidnoy struktury i ikh optimal'nykh lekarstvennykh form [The study of pharmacokinetics and bioavailability in the creation of new original drugs of the peptide structure and their optimal dosage forms] / Ye. V. Ivannikova, V. P. Zherdev, S. S. Boyko, Ye. V. Blynskaya, K. G. Turchinskaya, K. V. Alekseyev // Farma-kokinetika i farmakodinamika. — 2013. — № 2. — P. 1-17.
14. Eriksen, E. Different digestion of caprine whey proteins by human and porcine gastrointestinal enzymes / E. K. Eriksen, H. Holm, E. Jensen, R. Aaboe, T. G. Devold, M. Jacobsen, et al. // British Journal of Nutrition. — 2010. — № 104. — P. 374-381. DOI: 10.1017/S0007114510000577.
15. Picariello, G. Peptides surviving the simulated gastrointestinal digestion of milk proteins: Biological and toxicological implications / G. Picariello, P. Ferranti, O. Fierro, G. Mamone, S. Caira, A. Di Luccia, et al. // Journal of Chromatography. — 2010. — № 878. — P. 295-308. DOI: 10.1016/j.jchromb.2009.11.033.
16. Bouzerzour, K. In vivo digestion of infant formula in piglets: Protein digestion kinetics and release of bioactive peptides / K. Bouzerzour, F. Morgan, I. Cuinet, C. Bonhomme, J. Jardin, I. Le Huerou-Luron, D. Dupont // The British journal of nutrition. — 2012. — № 108. — P. 1-10. D0I:10.1017/S000711451200027X.
17. García-Nebot, M. J. Milk versus caseinophosphopeptides added to fruit beverage: Resistance and release from simulated gastrointestinal digestion / M. J. García-Nebot, A. Alegría, R. Barberá, M. M. Contreras, I. Recio // Peptides. — 2010. — № 31. — P. 555-561. DOI: 10.1016/j.peptides.2009.12.021.
18. Лапин, А. А. Исследование биохимии окисления аскорбиновой кислоты в присутствии энтеросорбен-тов / А. А. Лапин, В. И. Кодолов, Р. В. Мустакимов, А. А. Калайда, В. Н. Зеленков, В. В. Потапов // Вестник медицинского института «Реавиз»: реабилитация, врач и здоровье. - 2018. - № 6 (36). -Р. 158-162.
Lapin, A. A. Issledovaniye biokhimii okisleniya askorbino-voy kisloty v prisutstvii enterosorbentov [A study of the biochemistry of the oxidation of ascorbic acid in the presence of enterosorbents] / A. A. Lapin, V. I. Kodolov, R. V. Mustakimov, A. A. Kalayda, V. N. Zelenkov, V. V. Pota-pov // Vestnik meditsinskogo instituta «Reaviz»: reabilitat-siya, vrach i zdorov'ye. — 2018. — № 6 (36). — P. 158-162.
19. Василевская, Е. Р. Методология исследования белко-во-пептидных компонентов экстрактов тканей Sus Scrofa / Е. Р. Василевская, Е. А. Котенкова, Е. А. Лу-кинова, Е. А. Калинова // Theory and Practice of Meat Processing. - 2017. - Т. 2. - № 3. - С. 79-85.
20. Фальчук, Е. Л. Изучение барьерных свойств фолли-кул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек тонкой кишки крысы: дис. ... канд. биол. наук: 03.03.01 / Е. Л. Фальчук; Место защиты: Институт физиологии им. И. П. Павлова Российской академии наук. - СПб.: 2016. - 135 с.
Vasilevskaya, Ye. R. Metodologiya issledovaniya belkovo-pep-tidnykh komponentov ekstraktov tkaney Sus Scrofa [Methodology for the study of protein-peptide components of tissue extracts Sus Scrofa] / Ye. R. Vasilevskaya, Ye. A. Kotenkova, Ye. A. Lukinova, Ye. A. Kalinova // Theory and Practice of Meat Processing. — 2017. — T. 2. — № 3. — P. 79-85. Fal'chuk, Ye. L. Izucheniye bar'yernykh svoystv follikul-as-sotsiirovannogo epiteliya Peyyerovykh blyashek tonkoy kishki krysy [Study of the barrier properties of follicle-associated epithelium of Peyer's plaques of the small intestine of rats]: dis. ... kand. biol. nauk: 03.03.01 / Ye. L. Fal'chuk; Mesto zashchity: Institut fiziologii im. I. P. Pavlova Rossiys-koy akademii nauk. — SPb.: 2016. — 135 p.
21. Hausch, F. Intestinal digestive resistance of immunodominant gliadin peptides / F. Hausch, L. Shan, N. A. Santiago, G. M. Gray, C. Khosla // American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. — 2002. — № 283. — P. 996-1003. DOI: 10.1152/ajpgi.00136.2002.
22. Hilgendorf, C. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: Permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport / C. Hilgendorf, H. Spahn-Langguth, C. G. Regardh, E. Lipka, G. L. Amidon, P. Langguth // Journal of Pharmaceutical Sciences. — 2000. — № 89. — P. 63-75. D0I:10.1002/(SICI)1520-6017(200001)89:1<63:: AID-JPS7>3.0.C0;2-6.
ВСЁ О МЯСЕ № Б I 2019
