CC BY
13
Демина Н.Л. — Альфа-адреномодулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии
АЛЬФА-АДРЕНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ
Демина Н.Л. 1, Циркин В.И.2, Тарловская Е.И2, Костяев А.А.3
1 Вятский государственный гуманитарный университет;2 Кировская государственная медицинская академия; 3 Кировский НИИ гематологии и переливания крови, Киров
Резюме
В опытах с циркулярными полосками почечной артерии коров сыворотка крови женщин и мужчин без артериальной гипертензии (АГ) и при АГIIстадии (ст.) в разведениях 1:100, 1:500, 1:1000 и 1:10000 не влияла на тонот-ропный эффект адреналина (1&6г/мл), реализуемый за счет активации а-адренорецепторов (АР), а в разведении 1:50 повышала его, т. е. проявляла а-адреносенсибилизирующую активность. При АГIII ст. сыворотка крови женщин не влияла на тонотропный эффект адреналина, а сыворотка крови мужчин снижала его в разведениях 1:50, 1:100, 1:1000, т. е. проявляла а-адреноблокирующую активность. Все это означает, что:1) сыворотка крови нормотензивныхлюдей и пациентов с АГIIст. содержит эндогенный сенсибилизатор а-АР, или ЭСААР, содержание которого у женщин и мужчин снижается при АГШст.; 2) в сыворотке крови мужчин с АГIIIст. выявляется эндогенный блокатор а-АР, или ЭБААР. Обсуждается вопрос о природе ЭСААР и ЭБААР и их участии в патогенезе АГ.
Ключевые слова: эндогенные модуляторы альфа-адренореактивности, артериальная гипертензия, экспериментальное исследование.
Считается [3,5,6,7], что в сыворотке крови и других жидких средах организма человека имеется система эндогенных модуляторов хемореактивности прямого действия, которые быстро и обратимо изменяют ответ мышечной ткани на действие катехоламинов, ацетилхолина и гистамина. В частности, на основе результатов опытов с гладкими мышцами артерий и вены пуповины новорожденных выявлено наличие эндогенного сенсибилизатора а-адренорецепторов (АР) или ЭСААР, и высказано предположение о существовании эндогенного блокатора а-АР или ЭБААР [5,6]. Однако до настоящего времени не было данных о наличии ЭСААР и ЭБААР в крови взрослых людей и об участии этих факторов в патогенезе соматических заболеваний, в том числе АГ. В связи с этим в данной работе была поставлена цель — оценить а-адреномодулирующую активность сыворотки крови мужчин и женщин без АГ и при наличии АГ II или III ст. по влиянию 50-, 100-, 500-, 103 — и 104-кратных разведений сыворотки крови на тонотропный эффект адреналина в опытах с циркулярными полосками почечной артерии коровы. При этом мы учитывали отсутствие сведений в отношении адренореак-тивности гладких мышц этого сосуда как потенциального тест-объекта для идентификации ЭСААР и ЭБААР. Поэтому в работе была поставлена вторая задача — изучить ее по реакции мышц на адреналин (10-9 -10-6г/мл), в том числе на фоне блокады а-АР — ницерголином (101010-6г/мл) и ß-АР — обзиданом и метопрололом (1010105г/мл).
Методы исследования
Проведено 16 серий опытов с 520 циркулярными полосками почечной артерии 40 коров. В 12 сериях исследовали кровь 20 мужчин и 19 женщин — нормотензивных доноров крови, а также кровь 6 мужчин и 11 женщин с АГ II ст. и 11 мужчин и 12 женщин с АГ Ш ст. Возраст женщин и мужчин без АГ составил 45,6±0,8 и 46,1±0,3 лет, при АГ II ст. — соответственно 51,2+1,2 и 48,7+2,7 лет, а при АГ III ст. -55,0+0,5 и 48,9+1,8 года. Длительность заболевания у женщин и мужчин с АГ II ст. составила соответственно 6,6+0,8 и 5,0+1,0 лет, ас АГ III ст. -8,7+1,1 и 7,2+1,5 лет. Среди пациентов с III ст. в сравнении со II ст. АГ было больше лиц, имеющих 4 группу риска (у женщин — 100,0 % против 27,3 %, у мужчин — 100,0 % против 28,6 %); и больше лиц со II стадией хронической сердечной недостаточности (у женщин — 100,0 % против 63,6 %, у мужчин — 80,0 % против 0 %). Лекарственная терапия (чаще — комбинированная) включала прием р-блокаторов, блокаторов кальциевой проницаемости, диуретиков и ингибиторов АПФ.
Забор крови (5—8 мл) из локтевой вены (в условиях стационара или на станции переливания крови) проводили в 8—9 ч. утра и подвергали центрифугированию (15 мин при 1000 об/мин). Сыворотку разводили раствором Кребса в 50, 100, 500, 1000 и 10000 раз и исследовали в течение 2—6 часов от момента забора крови.
Забор почек у коров проводили на мясокомбинате. Из почечной артерии иссекали циркулярные по-
65
-е-
Российский кардиологический журнал № 1 (69) / 2008
Рис.1. Механограммы циркулярных полосок почечной артерии коровы, демонстрирующие тоническую активность при длительном (60 мин) непрерывном воздействии адреналина (10-6 г/мл, панельА) и а-адреноблокирующую активность ницерго-лина (10-7 г/мл, панель Б). Горизонтальные линии под механограммами отражают момент воздействия ницерголина (Н-7) и адреналина (Адр-6). Калибровка-10 мН, 10 мин.
Рис. 2. Механограммы циркулярных полосок почечной артерии коровы при воздействии адреналина в концентрации 10-6г/мл: А- а-адреноблокирующая активность сыворотки крови (1:50) мужчин с АГ III стадии (опыты по схеме 3); Б- а-адреносенсибилизирующая активность сыворотки крови (1:50) женщин без АГ (схема 4);
Горизонтальные линии под механограммами отражают момент воздействия адреналина (Адр-6, Адр-5х10-7) и соответствующих разведений сыворотки (С-50...). Калибровка -10 мН, 10 мин.
лоски (2—3 мм х 6—8 мм). Регистрацию их сокращений (при 38оС) проводили по методике Циркина В.И. и соавт. с помощью 6-канального "Миоцитографа", используя механотроны типа 6МХ1С. Полоски помещали в рабочие камеры и перфузировали (шприце-вым дозатором) со скоростью 0,7 мл/мин раствором Кребса, содержащим (мМ): КаС1 - 136, КС1 - 4,7, СаС12 - 2,52, MgC12 - 1,2, КН2Р04 - 0,6, КаЫС03 -4,7, С6Н1206- 11.
Опыты по изучению влияния адреналина на тоническую активность полосок проводили по схеме 1, состоявшей из 11 этапов: раствор Кребса (РК) ^ адреналин (Адр., 10-9г/мл) ^ РК( Адр, 10-8г/мл ^ ...( РК ^ Адр, 10-6г/мл ( РК. При исследовании влияния а-адреноблокатора ницерголина (Н) опыты вели по схеме 2, в которой на всех этапах адреналин использовали в концентрации 10—'6г/мл, а блокатор -в возрастающих концентрациях. Схема состояла из 12 этапов: РК ^ Адр ^ Адр + Н, 10-10г/мл ^ Адр ^...^Адр ^ Адр+Н, 10-6г/мл ^ РК. Аналогичные схемы (из 14 этапов) применяли при исследовании влияния в-адреноблокаторов - обзидана (10-10-10-5г/мл) и метопролола (10-10-10-5г/мл) - нато-нотропный эффект адреналина (10-6г/мл). Изучение а-адреномодулирующей активности сыворотки крови проводили по схемам 3 и 4 (при использовании адреналина в концентрации 10-6г/мл). Схема 3, предусматривающая также оценку собственного тонот-
ропного эффекта сыворотки крови, состояла из 8 этапов: РК ^ Адр^ РК ^ сыворотка ^ сыворотка + Адр^ РК ^ Адр ^ РК. Схема 4 состояла из 5 этапов: РК ^ Адр ^ Адр + сыворотка ^ Адр ^ РК. На каждой полоске исследовали не более 2 разведений сыворотки- вначале 1:10000 или 1:1000, а затем - 1:500 или 1:100, или 1:50. Тонотропный эффект адреналина выражали в мН и в процентах к 1-му (т. е. до воздействия сыворотки или блокатора) тестированию адреналином. В работе использовали адреналина гидрохлорид (Россия), ницерголин (Польша), метопролол и обзидан (Германия).
Результаты исследования подвергнуты статистической обработке и представлены в виде М±т. Различия оценивали по критерию Стьюдента, считая их достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования
При перфузии раствором Кребса полоски артерии имели низкий базальный тонус. Адреналин в концентрациях 10-8и10-7г/мл не влиял на него, а в концентрациях 0,5х10-6и10-6г/мл повышал (рис.1,2,) до величины равной соответственно 2,7±0,5 мН (варьирование от 3,1 до 8,8 мН) и 8,5±1,5 мН (4,5 - 11,9 мН). Тонус достигал максимума через 5-10 минут от начала воздействия, сохранялся устойчивым (не менее 60 минут) и снижался после удаления адреналина, т. е. эффект адреналина обратим (рис.1А).
66
"О"
Демина Н.Л. — Альфа-адреномодулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии
Таблица
Достоверное наличие эндогенного сенсибилизатора а-адренорецепторов (ЭСААР) и блокатора а— адренорецепторов (ЭБААР) в сыворотке крови женщин и мужчин, выявляемые в опытах с цирку лярными
полосками артерии коровы
Группы n Разведения сыворотки крови
1:10000 1:1000 1:500 1:100 1:50
Женщины
Без АГ 19 - - - - ЭСААР
АГ II ст. 11 - ЭСААР - - ЭСААР
АГ III ст. 12 - - - - -
Мужчины
Без АГ 20 - - - - ЭСААР
АГ II ст. 6 - - - - ЭСААР
АГ III ст. 11 - ЭБААР - ЭБААР ЭБААР
Примечание: ЭСААР и ЭБААР выявлены в опытах, проведенных соответственно по схемам 4 (РК ( Адр ( Адр + сыворотка ( Адр ( РК) и 3 (РК ( Адр( РК ( сыворотка ( сыворотка + Адр ( РК ( Адр ( РК). Символ "-" означает отсутствие а-адреномодулирующей активности; АГ - артериальная гипертензия; ст.- стадия.
Ницерголин уже в концентрации 10-10 снижал тонус, вызванный адреналином (10-6г/мл), до 17,6±6,4 % от исходного уровня (рис.ЗА). Такое же снижение тонуса он вызывал в концентрациях 10-9, 10-8, 10-7и10-6г/мл (соответственно до 20,6±5,8 %; 20,6+5,5%; 21,1+5,4% и 22,7+9,3 % от исходного уровня). Метопролол и обзидан в концентрациях 10-10, 10-9и10-8г/мл не влияли на вызванный адреналином тонус (рис. 3Б и В), а в концентрациях 10-7, 10-6и10-5г/мл дозозависимо снижали его (метопролол - до 88,5+5,2 %, 61,9+7,2 % и 21,7+5,8 %, обзидан -до 73,9+10,0 %, 75,2+7,4% и 47,7+9,6 %). С учетом данных [2] о способности высоких концентраций ß-адреноблокаторов оказывать мембраностабилизи-рующее действие, результаты исследования позволяют считать, что тонотропный эффект адреналина на гладких мышцах почечной артерии коровы реализуется за счет активации, преимущественно, а-АР и, в меньшей степени, ß-АР. Это позволяет использовать полоски артерии в качестве тест-объекта при оценке а-адреномодулирующей активности сыворотки крови, что подтверждается приводимыми ниже результатами исследования.
Установлено, что сыворотка крови (1:50,....,1:10000) нормотензивных доноров и пациентов с АГ II ст. и III ст. не влияет на базальный тонус почечной артерии, в то же время она проявляет а-ад-реномодулирующую активность. Опыты, проведенные с адреналином (10-6г/мл) по схеме 4, показали (рис.2Б, рис.4, табл.), что у нормотензивных доноров (женщин и мужчин) сыворотка крови в разведении 1:50 проявляет а-адренсенсибилизирующую активность, т. е. повышает положительный тонотропный эффект адреналина. Остальные 4 разведения не изменяли эффект адреналина. Так, в опытах с 50-кратным разведением сыворотки крови женщин без АГ тонус полосок под влиянием адреналина повысился до 10,8+1,7мН, при добавлении к адреналину
сыворотки крови он возрос до 13,9+2,6 мН или до 123,7+10,0 % от значений, наблюдаемых при 1-м тестировании адреналина, а удаление сыворотки приводило к частичному восстановлению тонуса до 13,0+2,6 мН или до 116,7+9,6 % от первоначальных значений. Аналогичные данные получены при исследовании 50-кратного разведения сыворотки крови мужчин без АГ (рис.4В). Это означает, что сыворотка крови нормотензивных доноров содержат ЭСААР. Сыворотка крови пациентов с АГ II ст. (опыты по схеме 4) также достоверно (р<0,05) повышала тонотропный эффект адреналина только в разведении 1:50 (табл.): в частности, у женщин она повышала тонус с 9,8+2,0 мН до 11,8 +2,6 мН, или до 121,5+9,1 % от первоначального; для мужчин эти значения составили соответственно 4,5+1,0 мН, 6,3 + 1,5 мН, и 138,9+15,5 %.
При АГ III ст. у женщин сыворотка крови не влияла на эффект адреналина (схема 3 и 4), а у мужчин (схема 3) снижала его в разведениях 1:50, 1:100, 1:1000, т. е. проявляла а-адреноблокирующую активность (рис.2А; рис. 4, табл). Так, в опытах с 50-кратным разведением сыворотки крови мужчин тонус полосок под влиянием адреналина возрастал до 13,4+3,5 мН, при добавлении к адреналину сыворотки крови он снижался до 9,6+4,7мН или до 64,6+12,5 % от его первоначальной величины. Учитывая, что ни один из пациентов с АГ не получал а-адреноблокаторы, а "средняя условная доза блока-торов кальциевой проницаемости" у трех мужчин с АГ III ст. была даже ниже, чем у 5 мужчин с АГ II ст. — 8,0+4,4 против 15,7+7,9 мг в сутки; для женщин эти зна че ния со ста ви ли со от вет ст вен но 22,0+12,0 против 19,0+10,4 мг в сутки;(п=8 и n=7), полагаем, что при АГ III ст. в сыворотке крови женщин и мужчин снижается содержание ЭСААР и одновременно в сыворотке крови мужчин появляется ЭБААР.
67
■Ф—
Российский кардиологический журнал № 1 (69) / 2008
Рис.3. Тонус циркулярных полосок почечной артерии коровы, вызванный адреналином (106г/мл): до, при воздействии бло-катора и после его удаления (соответственно - столбцы 1, 2 и 3) в % к 1-му тестированию адреналином. Панель А- опыты с ницерголином (10-10-10-6г/мл), панель Б-с обзиданом (10-10-10-5г/мл), панель В - с метопрололом (10-10-10-5г/мл). Примечание.а и в - различия с 1-м (а) и 2-м (в) этапами эксперимента достоверны (р<0,05).
В целом, наши данные свидетельствуют о наличии в крови нормотензивных доноров ЭСААР, о снижении его содержания при АГ III ст. (женщины и мужчины) и о появлении в крови (мужчины) при АГ III ст. ЭБААР.
Обсуждение
В последние годы развивается представление о том, что АГ является следствием снижения эффективности ß-адренергических воздействий на миокард, что компенсаторно вызывает повышение продукции катехоламинов и тем самым приводит к развитию гипертрофии и фиброза миокарда [1,8]. Исследуя ß-адреносенсибилизирующую активность сыворотки крови в опытах с миометрием крысы и миокардом лягушки нам удалось показать [4], что у 40—55-летних нормотензивных доноров по сравнению с 18—22-летними женщинами и мужчинами эта активность снижена. Она также снижена у пациентов с АГ II ст. и, особенно, у пациентов в АГ III ст. В то же время кровь пациентов с АГ III ст. (особенно у женщин) приобретает способность проявлять ß-ад-реноблокирующую активность. Эти данные позволили заключить, что фоном для формирования АГ является низкое содержание ЭСБАР, а само заболевание также протекает в условиях низкого содержания этого фактора, причем с повышением тяжести заболевания возрастает содержание ЭББАР. Все это подтверждает вышеупомянутую концепцию о патогенезе АГ. Результаты изучения а-адреномодулирующей активности сыворотки крови, представленные в данной работе, указывают на то, что формирование АГ также происходит на фоне низкого содержания ЭСААР и (на более поздних стадиях АГ) повышенного содержания ЭБААР. Это означает, что формирование АГ происходит в условиях снижения эффективности активации и ß-АР, основная доля которых сконцентрирована в миокарде, и а-АР, преимущественно локализованных в гладких мышцах сосудов. Такая аре-
активность сердечно-сосудистой системы инициирует необходимость избыточной продукции катехоламинов, следствием чего является гипертрофия миокарда и повышенное развитие мышечного слоя сосудов. Таким образом, гипотезу о дефиците в-адренер-гических воздействий как первопричины развития АГ [1,8] мы предлагаем дополнить положением о дефиците а-адренергических воздействий как второй причине развития АГ.
По нашему мнению, в основе снижения эффективности в— и а-адренореактивности у людей зрелого и более старшего возраста является повышение продукции в кардиомиоцитах и миоцитах сосудов лизофосфатидилхолина (ЛФХ), который, как показано [9], увеличивается при активации перекисного окисления липидов и при стрессе, т. е. при условиях, способствующих формированию АГ.
Согласно нашим данным [7], ЛФХ способен снижать в-адренореактивность миокарда крысы и а-ад-ренореактивность гладких мышц почечной артерии коровы. Не исключено, что ЛФХ и является одним из компонентов ЭББАР и ЭБААР. Важно отметить, что в организме человека имеется фактор, который препятствует действию ЛФХ. Он находится в сыворотке крови, так как, по нашим данным [7], сыворотка крови способна восстановить в-адренореактивность миокарда крысы и а-адренореактивность гладких мышц почечной артерии коровы, сниженные под влиянием ЛФХ. Этими факторами, вероятно, и являются ЭСБАР и ЭСААР. Их компонентами, с нашей точки зрения, являются гистидин, триптофан и тирозин, так как эти аминокислоты (как и кардиопротек-тивные препараты), подобно сыворотке крови, восстанавливают сниженную ЛФХ в-адренореактивность миокарда крысы и а-адренореактивность гладких мышц почечной артерии коровы [7]. Это говорит о перспективности применения гистидина, триптофана и тирозина, а также кардиопротективных препаратов при профилактике и лечении АГ.
68
"О"
Демина Н.Л. — Альфа-адреномодулирующая активность сыворотки крови при артериальной гипертензии
»» IV -------
НИ
11111
В 1:10* 1: Кг 1:500 1:100 1:50
г я ■■
¡111111111
Рис.4. Тонус циркулярных полосок почечной артерии коровы, вызванный адреналином до, при воздействии разведений (104, .„,1:50) сыворотки крови здоровых мужчин (панели А и В) и мужчин с АГ III ст. (панели Б и Г) и после удаления сыворотки (соответственно - столбцы 1, 2 и 3), в % к 1 -му тестированию адреналином.
Примечания 1: Панели А и Б - опыты проведены по схеме 3 (РК ^ Адр^ РК ^ сыворотка ^ сыворотка + Адр ^ РК ^ Адр ^ РК). 2. Панели В и Г- опыты проведены по схеме 4:(РК ^ Адр ^ Адр + сыворотка ^ Адр ^ РК). 3.а и в - различия с 1 -м (а) и 2-м (в) этапами эксперимента достоверны (р<0,05).
Выводы
1. Адреналин (0,5 — 1,0 х 10-6г/мл) дозозависимо и обратимо повышает базальный тонус циркулярных полосок почечной артерии коровы. Это обусловлено активацией а-АР и, частично, активацией в-АР, так как эффект преимущественно снижается ницерголи-ном (10-10 -10-6г/мл).
2. Сыворотка крови (в разведении 1:50) 40—55 нормотензивных людей и пациентов с АГ II ст. проявляет а-адреносенсибилизирующую активность, а сыворотка крови пациентов с АГ III ст. утрачивает ее, приобретая при этом (у мужчин) способность ока-
зывать а-адреноблокирующую активность в разведениях 1:50, 1:100, 1:1000. Все это указывает на наличие в крови людей ЭСААР (его компонентом, возможно являются гистидин, триптофан и тирозин) и ЭБААР (его функцию, вероятно, выполняет лизофосфати-дилхолин).
3. Обосновывается представление о том, что повышение при АГ содержания ЭСААР и рост содержания ЭБААР уменьшает эффективность активации а-АР, что, вместе с подобными изменениями в содержании ЭСБАР и ЭББАР, имеет прямое отношение к фор ми ро ва нию АГ.
69
■Ф—
Российский кардиологический журнал № 1 (69) / 2008
Литература
1. Красникова Т.Л., Габрусенко С.А. Ь_-адренергические рецепторы сердца в норме и при сердечной недостаточности. //Усп. физиол. наук. 2000. Т. 31. № 2:35-50.
2. Кукес В.Г. Клиническая фармакология.- М.: ГЭОТАР, 2004.944 с.
3. Сизова Е.Н., Циркин В.И. Физиологическая характеристика эндогенных модуляторов Ъ_-адрено- и М-холинореактивнос-ти.- Киров: Изд-во ВСЭИ, 2006.- 183 с.
4. Снигирева Н.Л., Тарловская Е.И. Адрено- и М-холиномоду-лирующая активность сыворотки крови при артериальной ги-пертензии //Вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы научно-практ. конф. молодых ученых - Киров, КНИИГПК. 2007:108-110.
5. Циркин В.И., Ноздрачев А.Д., Сизова Е.Н. и др. Система эндогенной модуляции, регулирующая деятельность периферических автономных нервных структур //Доклады РАН.2002.Т.
6. Циркин В.И., Ноздрачев А.Д., Сазанова М.Л. и др. Физиологические свойства миоцитов артерий и вены пуповины человека и влияние на них сыворотки пуповинной крови // Доклады РАН. 2003. Т. 388. № 3: 426-429.
7. Циркин В.И., Пенкина Ю.А., Кашин А.Ю. и др. Способность гистидина, триптофана и тирозина восстанавливать сниженную лизофосфатидилхолином адренореактивность миокарда и сосудистых гладких мышц //Успехи современного естествознания. 2007.№ 7: 64-65.
8. Rockman H., Koch W., Lefkowitz R. Seven-transmembrane-spanning receptors and heart function // Nature. 2002.V.415. № 68:206-212.
12. Watanabe T., Koba S., Katagiri T. et al. Lysophosphatidylcholine potentiates the mitogenic effect of the various vasoactive compounds on rabbit aortic smooth muscle cells // Jpn. Heart J. 2002. V.43. № 4: 409-416.
383.№ 5:698-701.
Abstract
In experiments with longitudinal stripes of cow renal artery, serum taken from healthy people and patients with Stage II arterial hypertension (AH), in titrations 1:100, 1:500, 1:1000, and 1:10000, did not influence tonotropic, alpha-adrenoreceptor (AR) activating effect of adrenaline (10-6g/ml). In titration 1:50, this effect was enhanced, due to serum alpha-adrenosensitizing activity. In Stage III AH, female serum did not affect tonotropic effect of adrenaline, and male serum reduced it in titrations 1:50, 1:100, and 1:1000, due to alpha-adrenoblocking activity. Therefore, 1) serum of normotensive people and patients with Stage II AH could contain endogenous sensitizer of alpha-AR (ESAAR), and in Stage III AH its level might be reduced; 2) serum of males with Stage III AH could contain endogenous blocker of alpha-AR (EBAAR). The nature of ASAAR and EBAAR and their role in AH pathogenesis is discussed.
Keywords: Endogenous modulators, modulators of alpha-adrenoreactivity, arterial hypertension, experimental study.
Поступила 20.08.07
70
-е-
