CC BY
51
2007
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 3. Вып. 3
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 612.118+612.73+612.327+612.328
А. А. Куншин, А. Д. Ноздрачев, В. И. Циркин, С. И. Трухина, С. А. Дворянский, Т. В. Помаскина, С. Ф. Гуляева, А. Н. Костяев
ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА М-ХОЛИНО- И а-, р-АДРЕНОРЕАКТИВНОСТЬ ГЛАДКИХ МЫШЦ ЖЕЛУДКА КРЫСЫ
Введение. Работы, выполненные на гладкомышечных полосках рога матки крысы [7, 8, И, 12,16-18,21,22,24], коронарных артерий свиньи [10,12,15], артерий и вены пуповины человека [21], почечной артерии коровы [13], трахеи коровы [12,25] и на изолированном сердце лягушки [12,14] свидетельствуют о наличии в сыворотке крови и других жидких средах организма человека системы эндогенных модуляторов хемореактивности прямого действия, в том числе повышающих эффективность активации соответствующих клеточных рецепторов (эндогенных сенсибилизаторов) и снижающих ее (эндогенных блокаторов). В частности, получены доказательства существования эндогенных сенсибилизаторов р- и а-адренорецепторов (ЭСБАР, ЭСААР), М-холинорецепторов (ЭСМХР) и гистаминовых рецепторов (ЭСГР), а также эндогенных блокаторов р-АР (ЭББАР), сх-АР (ЭБААР) и М-ХР (ЭБМХР). Так, установлено, что 50-, 100- и 500-кратные разведения сыворотки крови человека способны дозозависимо снижать стимулирующую реакцию на ацетилхолин (АХ) гладких мышц матки крысы [7,12,22,23,25], трахеи коровы [12,25] и миокарда лягушки [12,24]. Это объясняется наличием в крови ЭБМХР. Ранее М-холинолитическую активность сыворотки крови лягушки, крысы и кролика отметили в лаборатории Т, М. Турпаева в опытах с изолированным сердцем лягушки и кролика [9,38], что мы также расцениваем как доказательство наличия в крови ЭБМХР.
Вопросы, касающиеся физиологической роли эндогенных модуляторов, их природы, участия в развитии заболеваний и клинического применения, изучаются в основном в нашей лаборатории. В частности, удалось показать, что содержание ЭСБАР, ЭББАР и ЭБМХР меняется при инфаркте миокарда [7, 22, 23], бронхиальной астме [25] и гипертонической болезни [13]. Также выявлено, что р-адреносенсибилизирующую активность проявляют гистидин, триптофан и тирозин, в связи с чем они рассматриваются в качестве компонентов ЭСБАР [8,12]. Ее проявляют и лекарственные препараты, например триме-тазидин и милдронат [12, 20]. Получены доказательства, что функцию ЭБМХР может выполнять лизофосфатидилхолин [6,9,38].
Влияние эндогенных модуляторов хемореактивности на гладкие мышцы желудка не исследовалось. Поэтому мы считали возможным провести изучение этого вопроса, используя в качестве тест-объекта гладкие мышцы крысы, свойства которых описаны
© А. А. Куншин, А. Д. Ноздрачев, В. И. Циркин, С. И. Трухина, С. А. Дворянский, Т. В. Помаскина, С. Ф. Гуляева, А. Н. Костяев, 2007
в литературе [3,26,35,36,37].Однако анализ этих работ показал, что ряд аспектов физиологии гладких мышц желудка крысы, важных в методическом отношении для исследования эндогенных модуляторов хемореактивности, недостаточно изучен, в частности, в отношении зависимости М-холинореактивности миоцитов желудка от их локализации в соответствующем слое и в регионе желудка [3,26] и характера сократительных эффектов катехоламинов [30,31,33]. В связи с этим в работе была поставлена цель - изучить влияние сыворотки крови человека (как источника эндогенных модуляторов хемореактивности) на М-холино- и а- и р-адренореактивность гладких мышц различных отделов желудка крысы.
Методика. Проведено три серии исследований. В серии 1 в опытах с продольно- и циркуляр-но-иссеченными гладкомышечными полосками фундуса, корпуса и антрума желудка крысы изучали сократительные ответы на ацетилхолин (АХ, 10~8-10~5 г/мл), а также влияние на тонотроп-ный эффект АХ (Ю-6 г/мл) четырех разведений (1:1000,1:500,1:100 и 1:50) сыворотки пуповинной крови новорожденных и взрослых здоровых людей. В сериях 2 и 3 исследовали сократительные ответы полосок фундуса желудка крысы при селективной активации адреналином (10~9-10~6 г/мл) р-адренорецепторов (на фоне блокады а-АР ницерголином, 10~6 г/мл; серия 2) или при активации а-адренорецепторов (на фоне блокады р-АР обзиданом, 10~6 г/мл, серия 3) и влияние на эффекты адреналина (10~6 г/мл) 1000-, 500-, 100- и 50- кратных разведений сыворотки пуповинной крови и/или взрослого человека.
Опыты проведены на 368 гладкомышечных полосках, иссеченных из различных отделов желудка 172 половозрелых беспородных крыс-самок (без учета фазы астрального цикла). Полоски имели длину 5-8 мм и ширину 2-3 мм. Забой животных осуществляли в соответствие с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР от 12.08.77). Регистрацию сократительной активности (СА) полосок проводили на 6-канальном «Миоцитографе» по методике [17] при 38 "С, скорости перфузии раствора Кребса, равной 0.7 мл/мин, пассивной аэрации рабочей камеры (объемом в 1 мл) и исходной нагрузке полосок, равной 500 мг (4.9 мН). «Миоцитограф» собран на базе механотронов 6МХ1С (Россия), самопишущих приборов Н-3020 (Россия), а также шприцевого дозатора и термостата оригинальных конструкций. При оценке исходной М-холинореактивности полосок опыты вели по схеме: раствор Кребса исследуемая концентрация АХ —> раствор Кребса (при длительности каждого этапа не менее 10 мин). На одной полоске обычно исследовали последовательно все 4 концентрации АХ (начиная с минимальной), реже 1-2 концентрации. При оценке М-холиномодулирую-щих свойств сыворотки крови опыты вели по схеме: раствор Кребса —» АХ (10-6 г/мл) -» АХ + исследуемое разведение сыворотки крови —» АХ -» раствор Кребса. Адренореактивность и ее изменение под влиянием сыворотки крови оценивали при действии адреналина в условиях блокады р-АР обзиданом (10~6 г/мл) или блокады а-АР ницерголином (Ю-6 г/мл), в том числе при повышении базального тонуса полосок гиперкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса (ГРК) или сывороткой крови. При этом использовали тот же принцип процедуры тестирования, как и в опытах с АХ. В работе применяли ацетилхолина хлорид (Россия), атропина сульфат (Россия), адреналина гидрохлорид (Россия), обзидан (Германия) и ницерголин (Россия). Во всех опытах раствор Кребса (рН=7.4) имел следующий состав (мМ): ЫаС1 - 136, КС1 - 4.7, СаС12 - 2.52, ]У^С12 - 1.2, КН2Р04 - 0.6, КаНС03 - 4.7, С6Н1206 - И. В опытах использовали сыворотку крови пуповинной крови 144 новорожденных и сыворотку венозной крови 48 взрослых людей. Пуповин-ную кровь, остающуюся после благоприятного рождения плода, получали (по 7-10 мл) в родильном доме, а венозную кровь (по 7-10 мл, при добровольном согласии) - у доноров крови (средний возраст - 55.6±1.9 лет; 5 женщин и 6 мужчин) и у пациентов с кислотозависимыми заболеваниями (КЗЗ) пищеварительного тракта (59.1±1.3 года; 22 женщины и 15 мужчин). Сыворотку крови получали путем центрифугирования крови при 1000 об/мин в течение 15 мин; в последующем ее разводили раствором Кребса в 50, 100, 500 и 1000 раз и исследовали в течение 6-24 ч от момента ее забора.
Результаты тестирований полосок оценивали по механограммам (качественно и количественно). Изменение тонической активности полосок выражали в миллиньютонах или в процентах к одному из этапов эксперимента, указанном в соответствующем разделе работы. Результаты опытов
подвергнуты статистической обработке с использованием параметрического метода; различия показателей (их считали достоверными прир<0.05) оценивали по критерию Стьюдента или Тьюки [4].
Результаты исследования и их обсуждение. Влияние ацетилхолина на сократительную активность гладкомышечных полосок различных регионов желудка крысы. Продольные и циркулярные полоски фундуса, корпуса и антрума желудка в условиях их перфузии раствором Кребса проявляли низкий базальный тонус, на фоне которого (это особенно характерно для полосок корпуса и антрума) могли генерироваться низкоамплитудные фазные сокращения. Все это согласуется с данными литературы, полученными в опытах с полосками фундуса и антрума желудка крысы [3], морской свинки [3,32] и свиньи [33].
На всех полосках желудка АХ (Ю-8-Ю-5г/мл) дозозависимо и обратимо повышал базальный тонус (рис. 1, Д рис, 2), на фоне которого (полоски корпуса и антрума) можно было наблюдать низкоамплитудные фазные сокращения. Величина тонуса полосок при воздействии АХ в концентрациях Ю-8, Ю-7,10~6 и 10~5 г/мл варьировала соответственно от 0.36 до 0.88 мН, от 0.98 до 1.87 мН, от 1.79 до 4.81 мН и от 2.77 до 6.81 мН (см. рис. 2, табл. 1). Тонотропный эффект АХ наблюдали и другие авторы в опытах с полосками желудка крысы, кролика, кошки, собаки и человека [27,33,35], а индукция фазной активности под влиянием АХ отмечена Т. ОЫ;а и соавторами [34] в опытах на крысах.
А
Б
Рис. 1. Механограммы циркулярных полосок фундуса желудка крысы, демонстрирующие до-зозависимый эффект ацетилхолина в концентрации 10 8,10~7,10~6 и 10~5 г/мл (АХ-8-АХ-5) и его блокирование атропином (АТ-8, Ю-8 г/мл). Калибровка - 10 мН, 10 мин.
Таблица 1. Тонус, вызываемый АХ (10~5 г/мл), и константа диссоциации для АХ продольных и циркулярных полосок желудка крысы
Регионы Продольные полоски Циркулярные полоски
желудка Тонус, мН Кд, нг/мл Тонус, мН Кд, нг/мл
п М±т п М±т п М±т п МШ
Фундус 6 6.81±1.70 24 710±120 4 4.41+1.05 24 635+130
Корпус 5 4.01+0.78 20 240±160ф 6 2.77+0.24 24 502+140
Антрум 6 4.65±0.74 24 615±130 5 4.01+0.96 20 915+140к
Примечание. ф, к - различие с соответствующими полосками из фундуса (ф) и корпуса (к) достоверно (р>0.05) по критерию Тьюки; и - число полосок.
мН
А
1 6 5 4 3 2 1 1 О
9 1
8 7 6 5 4 3 2 1 О
Рис. 2. Величина тонуса (мН, М±т) продольных (панель А) и циркулярных (панель Б) полосок из фундуса (квадратные маркеры, «ф»), корпуса (треугольные маркеры, «к») и антрума (круглые маркеры, «а») желудка крысы при действии ацетилхолина.
Атропин (Ю-10,10~9, Ю-8, Ю-7 г/мл) дозозависимо снижал (рис. 1, Б) реакцию полосок на АХ (10~6 г/мл), что согласуется с данными К. Сокпк^еп, Н. [31]. Следовательно,
реализация тонотропного эффекта АХ происходит за счет активации М-ХР, которые с учетом данных литературы [36], вероятнее всего, относятся к подтипу М2-ХР и МЗ-ХР.
Константа диссоциации (Кд) для АХ у циркулярных и продольных полосок фундуса, корпуса и антрума варьировала от 240 до 915 нг/мл (см. табл. 1). Наиболее высокая М-холинореактивность былау полосок корпуса (Кд - 240 и 502 нг/мл), средняя - у полосок фундуса (635 и 710 нг/мл), а самая низкая - у полосок антрума (615 и 915 нг/мл). Во всех регионах циркулярные полоски обладали такой же М-холинореактивностью, как и продольные, что согласуется с данными [26], полученными в опытах с полосками фундуса желудка крысы.
Таким образом, все полоски желудка, независимо от их локализации (фундус, корпус, антрум), и ориентации (слои) обладают относительно высокой М-холинореактивностью. Это позволяет использовать их в качестве тест-объекта при исследовании М-холиномодулирующей активности сыворотки крови.
Влияние сыворотки пуповинной крови новорожденных на тонотропный эффект АХ (10'6 г/мл). В опытах с продольными и циркулярными полосками фундуса, корпуса и антрума желудка крысы 1000-, 500-, 100- и 50-кратные разведения сыворотки пуповинной крови снижали тонотропный эффект АХ (Ю-6 г/мл), т. е. проявляли М-холинобло-кирующую активность (рис. 3, табл. 2). Ее степень повышалась с уменьшением кратности разведения. Так, в опытах с продольными полосками фундуса АХ-вызванный тонус снижался соответственно до 71.30,61.73,38.30 и 18.09% от первоначального (см. табл. 2). На полосках из разных регионов и слоев желудка АХ-вызванный тонус под влиянием разведения 1:50 снижался до 5.41-39.06%, что сопоставимо с М-холиноблокирующим эффектом атропина, используемого в концентрациях 10_8-10~7г/мл (рис. 1, Б и 3).
т
10" 1(Г
Ах, г/мл
А
АХ-6 сыв 1:103
]0
АХ-б
сыв 1:100
В
АХ"6 сыв 1:500
АХ"6 сыв 1:50
АХ-б
сыв 1:10
АХ"6 сыв 1:500
Рис. 3. Механограммы циркулярных полосок фундуса (панели А и Б) и антрума (панель В) желудка крысы, демонстрирующие наличие (панели Аи Б) М-холиноблокирующей активности сыворотки пуповинной крови на фоне ацетилхолина (Ю-6 г/мл, АХ-6) или ее отсутствие (панель В).
Сыв 1:103-1:50 - разведения сыворотки 1:103,1:500,1:100 и 1:50. Калибровка - 10 мН, 10 мин (панель А, Б), 5 мНДО мин (панель В).
На продольных и циркулярных полосках фундуса сыворотка крови достоверно (р<0.05, по критерию Тьюки) проявляла М-холиноблокирующую активность в разведениях 1:1000, 1:500,1:100 и 1:50 (табл. 2), на продольных полосках корпуса и антрума - б разведениях 1:500,1:100 и 1:50, а на циркулярных полосках этих регионов - в разведениях 1:100 и 1:50. Это означает, что чувствительность полосок желудка к сыворотке как блокатору М-ХР зависит от их локализации - она максимальна у продольных и циркулярных полосок фундуса, обладающих, как отмечено выше, средним уровнем М-холинореактивности, и минимальна - у циркулярных полосок корпуса и антрума, имеющих соответственно высокую и низкую М-холинореактивность.
Таблица 2. Тонус полосок желудка крысы, вызванный ацетилхолином (10 6 г/мл), при действии 4 разведений сыворотки пуповинной крови новорожденных (в % от первоначального)
Сыворотка 1:1000 Сыворотка 1:500 Сыворотка 1:100 Сыворотка 1:50
Полоски п М±т п М±т п М±т п М±т
о ч продольные 10 71,30±9,49* 11 61.73*7.84* 10 38.30±7.61* 11 18.09±5.66*
& е циркулярные 13 64.69±4.83* 13 60.85±3.42* 13 19.38±6.65* 12 5.41±3.09*
о >-. с продольные 10 94.50±7.83 13 88.50i3.70" 13 58.38±6.32* 11 33.45±8.38*
и, о Ы циркулярные 9 100.80±12.11 12 92.33±8.31 11 52.27±4.31* 10 39.06±8.06*
2 >» О. продольные 13 90.23±10.43 14 66.38±9.49* 14 20.50±6.63* 12 4.58±3.10*
н XI < циркулярные 10 114.0±8.04 10 86.40±5.98 11 51.0±8.37*# 10 23.20±4.43*#
* Различие с первоначальной величиной тонуса достоверно (р<0.05) по критерию Тьюки; # - различие с продольными полосками достоверно (р<0.05) по критерию Стьюдента.
При оценке М-холиноблокирующей активности сыворотки крови взрослых здоровых людей, проведенной лишь на циркулярных полосках фундуса, показано, что разведения 1:1000,1:500,1:100 и 1:50 достоверно (р<0.05, по критерию Тьюки) и дозозависимо снижают тонус, вызванный АХ (10~6 г/мл), соответственно до 83.00+6.75% (77=10), 72.30+11.99% (л-10), 33.90+5.43% (п=11) и 16.09+6.07% (п=11).
Таким образом, и сыворотка крови новорожденных и сыворотка венозной крови взрослых людей проявляет выраженную М-холиноблокирующую активность по отношению к гладким мышцам желудка. Полагаем, что выявленная нами активность сыворотки крови подобна М-холиноблокирующей активности, которая ранее была отмечена в отношении гладких мышц матки крысы [7, 12, 22, 23, 25] и трахеи коровы [12, 25], а также сердца лягушки [9,12,24,38] и обусловлена наличием в ней ЭБМХР. Это означает, что 1) гладкие мышцы желудка крысы, независимо от их локализации, восприимчивы к действию ЭБМХР; 2) их активность может регулироваться эндогенными модуляторами М-холинореактивности (ЭБМХР и, вероятно, ЭСМХР); 3) эти мышцы можно использовать как тест-объект для идентификации ЭБМХР и ЭСМХР и для оценки их содержания в жидких средах организма человека и животных.
Сократительные эффекты адреналина (10'9 -10~6 г/мл) в опытах с циркулярными полосками фундуса желудка при избирательной активации $-АРмиоцитов (на фоне блокады а-АР ницерголином, 10~в г/мл) и влияние сыворотки крови новорожденных и пациентов с КЗЗ нарелаксирующий эффект адреналина (10~6 г/мл). В литературе отмечено, что при активации р-АР адреналин снижает тонус мышц желудка [2]. Поэтому, учитывая, что гладкие мышцы желудка имеют низкий базальный тонус, опыты проводили на полосках, тонус которых был повышен гиперкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса (ГРК). Как и другие авторы [34, 35], мы выявили, что при действии ГРК все полоски развивали относительно стойкое и обратимое повышение тонуса, величина которого
В
60 мМ КС1 Ддр-8+Обз-б 60мМКС1 Ддр-7+Обз-б
Рис. 4. Механограммы циркулярных полосок фундуса желудка крысы, демонстрирующие действие адреналина (Ю-9,10~8,10"7 и 10"6 г/мл, Адр-9...-6) в смеси с ницерголином (10"6 г/мл, Ниц-6, панели Л и Б) или обзиданом (10~6 г/мл, Обз-б, панель В) на фоне гиперкалиевого раствора Кребса (60 мМ КС1).
Калибровки - 10 мН, 10 мин.
варьировала от 6.64 до 10.01 мН (рис. 4, табл. 3). Адреналин в концентрации 10~9 г/мл в условиях КС1-вызванного тонуса и блокады а-АР ницерголином (Ю-6 г/мл), т. е. при активации интактных р-АР (см. рис, 4, А, табл. 3) повышал тонус полосок (до 122.10% от первоначального). Подобное явление описано и другими авторами [5]; они объясняли этот эффект активацией р-АР, локализованных на холинергических интернейронах энте-ральной нервной системы. Вероятно, подобное явление происходило и в наших опытах. В концентрации 10~8 г/мл адреналин не влиял на тонус полосок (см. рис. 4, А, табл. 3), а в концентрациях 10"7 и 10~6 г/мл (см. рис. 4, Б, табл. 3) дозозависимо снижал его (соответственно до 82.0 и 43.67% от первоначального). Релаксирующий эффект адреналина был описан и другими авторами [29,31]; они объясняли наличие такого эффекта активацией (3-АР миоцитов желудка. Очевидно, что подобная трактовка приемлема и в отношении результатов, полученных нами.
Таблица 3. Тонус циркулярных полосок фундуса желудка крысы при действии гиперкалиевого (60 мМ КС1) раствора Кребса (ГРК, мН) и адреналина (Ю-6 г/мл) совместно с ницерголином (Ю-6 г/мл), в % к 1-му этапу
Этапы эксперимента Концентрация адреналина, г/мл
КГ9 (п=Т) 10"8 (п=9) 1(Г7 {п-9) КГ6 (л=6)
1-й ГРК 6.64±0.73 8.49±1.16 10.01±0.78 8.90±1.79
2-й ГРК + адреналин + ницерголин 122.10±10.51* 108.30±6.31 82.0±2.79* 43.67±6.41*
* Различие с 1-м этапом достоверно (р<0.05) по критерию Стьюдента.
При исследовании влияния сыворотки крови новорожденных, проведенном лишь в отношении релаксирующего эффекта адреналина при использовании его в концентрации 10"6 г/мл на фоне ницерголина (Ю-6 г/мл), было показано (рис. 5), что этот эффект блокировался 100- и 50-кратными разведениями сыворотки (влияние 500- и 1000-кратных разведений в этих опытах не изучали). Действительно, если исходно адреналин снижал КСЬвызванный тонус циркулярных полосок фундуса желудка до 61.73±2.66%* от первоначального (п=11), то на фоне 100- и 50-кратных разведений сыворотки он снижал его соответственно лишь до 80.0±4.67 и 81.88+6.11% от первоначального. Это означает, что выявленная
А
«а-ЫЫм Адр.6+Ниц-6
Рис. 5. Механограммы циркулярных полосок фундуса желудка крысы, демонстрирующие |3-адреноблокирующую активность 100- и 50-кратных разведений сыворотки пуповинной крови (сыв 1:100,1:50) на фоне гиперкалиевого раствора Кребса (КС1 - 60 мМ).
Адр-6 + Ниц-6 - адреналин (10"6 г/мл) + ницерголин (Ю-6 г/мл). Калибровка - 10 мН, 10 мин.
ранее на полосках миометрия крысы (3-адреноблокирующая активность сыворотки крови [11,12,16-18,22,23] проявляется и в отношении гладких мышц желудка крысы. Наиболее вероятно, что такая активность сыворотки обусловлена наличием в ней ЭББАР.
В других экспериментах серии 2, проведенных с циркулярными полосками фундуса желудка, было установлено (рис. 6, табл. 4), что базальный тонус полосок дозозависимо возрастает под влиянием 1000-, 500-, 100- и 50-кратных разведений сыворотки крови пациентов с КЗЗ - соответственно до 1.51,1.73, 2.30 и 2.30 мН. Мы объясняем этот эффект наличием в крови фактора, увеличивающего тонус миоцитов желудка. Ранее М. Си^еа [28] обнаружил в сыворотке крови фактор, повышающий тонус гладких мышц подвздошной кишки морской свинки, а в нашей лаборатории была выявлена способность 500-, 100-, 50- кратных разведений сыворотки венозной крови человека повышать исходный тонус и фазную СА продольных полосок рога матки небеременных крыс, что объяснялось наличием в крови ЭАСМ, т. е. эндогенного активатора сократимости миоцитов [7, 16, 22, 23, 25]. Таким образом, наши данные свидетельствует о том, что ЭАСМ может влиять и на гладкие мышцы желудка крысы. Ранее на полосках миометрия крысы нам удалось показать [12], что ЭАСМ-активность сыворотки крови снижается под влиянием блокатора кальциевых каналов дилтиазема (10 7 г/мл). Это указывает на то, что ЭАСМ повышает вход Са2+ в клетки. С учетом данных литературы о способности инозитолтри-фосфата активировать кальциевые каналы миоцитов [1], мы не исключаем, что этот вторичный посредник и является одним из компонентов ЭАСМ.
сыв 1:100
Адр-б+Ниц-б
сыв 1:50
Адр-б+Ниц-6
Рис. 6. Механограмма циркулярных полосок фундуса желудка крысы, демонстрирующая ми-оцитстимулирующую и р-адреноблокирующую активность сыворотки крови (больных КЗЗ) в разведениях 1:100 и 1:50 (сыв 1:100,1:50).
Адр-6 +Ниц-6 - адреналин (10~6 г/мл) + ницерголин (10~б г/мл). Калибровка - 2 мН, 10 мин.
Таблица 4. Тонус циркулярных полосок фундуса желудка крысы при действии сыворотки крови пациентов КЗЗ (мН) и адреналина (10 6 г/мл) совместно с ницерголином
(Ю-6 г/мл), в % к 1-му этапу
Разведения сыворотки
Этапы эксперимента 1:1000 («=12) 1:500 (и=11) 1:100 (л=10) 1:50 (и=10)
1-й Сыворотка 1.51±0.18 1.73±0.26 2.30±0.28 2.30±0.25
2-й Сыворотка + адреналин+ ницерголин 47.17±8.36* 23.27±7.90*® 55.50±8.54* 55.70±10.06*
* Различие с 1-м этапом достоверно (р<0.05) по критерию Тьюки; ® - различие с разведениями 1:100 и 1:50 достоверно (р<0.05) по критерию Тьюки.
В этой же серии опытов показано, что на фоне тонуса, вызванного 1000-, 500-, 100- и 50-кратными разведениями сыворотки крови пациентов с КЗЗ, адреналин (10~6 г/мл) в присутствие ницерголина (Ю-6 г/мл) снижал этот тонус соответственно до 47.17,23.27, 55.50 и 55.70% (см. рис. 6 и табл. 4). Следовательно, активация р-АР приводит
к снижению тонуса, вызванного не только ГРК, но и сывороткой крови. Важно отметить, что на фоне 50- и 100-кратных разведений сыворотки крови пациентов с КЗЗ релаксиру-ющий эффект адреналина был достоверно (р<0.05, по критерию Тыоки) меньше (тонус снижался до 55.5-55.7% от исходного уровня), чем на фоне 500-кратного разведения (23.27%). Выявленная особенность, с нашей точки зрения, объясняется способностью сыворотки крови (за счет наличия в ней ЭББАР) проявлять {3-адреноблокирующую активность. Мы также не исключаем, что более выраженный релаксирующий эффект 500-кратного разведения обусловлен наличием в крови ЭСБАР.
В целом результаты серии 2 демонстрируют способность адреналина за счет активации р-АР угнетать СА гладких мышц желудка. Эта способность адреналина существенно снижается за счет наличия в крови ЭББАР.
Сократительные эффекты адреналина (10~8-10 в г/мл) в опытах с циркулярными и продольными полосками фундуса желудка при селективной активации а-АР (на фоне блокады р-АР обзиданом, 10~6 г/мл) и влияние на них сыворотки крови человека. Так как в литературе сообщалось, что при активации а-АР катехоламины вызывают релаксацию гладких мышц желудка [29, 30], первоначально опыты проводили на полосках, тонус которых был повышен под влиянием ГРК. Как и в опытах, описанных выше, ГРК стойко и обратимо повышал тонус циркулярных (до 5.51-7.70 мН) и продольных (до 7.74-8.52 мН) полосок (см. рис. 4,5; табл. 5). Вопреки ожиданию, адреналин ни в одной из исследуемых концентраций (10 8— 10-6 г/мл) не снижал КС1-вызванный тонус (см. табл. 5). Более того, в концентрации Ю-6 г/мл адреналин достоверно повышал его (до 113.60 % от первоначального) у циркулярных полосок. Это означает, что миоциты всех слоев желудка (и, вероятно, всех его областей) помимо р-АР содержат а-АР, активация которых приводит к росту С А полосок.
Таблица 5. Тонус циркулярных и продольных полосок фундуса желудка крысы при действии гиперкалиевого (60 мМ КС1) раствора Кребса (ГРК в мН) и адреналина (10 6 г/мл, Адр.) совместно с обзиданом (10" г/мл, Обз), в % к 1-му этапу
Этапы эксперимента Концентрация адреналина, г/мл
10~8 1 10 1 10^
Циркулярные полоски фундуса желудка
1-й ГРК п М±т п М±т п М±т
7 п 5.51±1.05 6 юски 4 п 7.59±0.91 1 п 7.70±0.95
2-й 1-й ГРК + Адр + Обз ГРК 107.0±9.16 Продольные по; М±т 109.30±6.72 >ундуса желудка М±т 113.60±4.39* М±т
Ь 7.74±1.29 5 8.52±2.03 5 7.93±1.96
2-й ГРК + Адр + Обз 101.20±7.63 107.0±4.11 102.40±6.27
* Различие с 1-м этапом достоверно (р<0.05) по критерию Стьюдента.
Вывод о повышении тонуса полосок при избирательной активации а-АР подтвержден и в опытах с интактными циркулярными полосками фундуса желудка (рис. 7, А, заключительный фрагмент) - адреналин (Ю-6 г/мл) совместно с обзиданом (10~6 г/мл) повышал их базальный тонус до 2.01±0.22 мН (гс=10). Ранее подобное явление отметили К. Мапс1гек и Б. Кгав. [33].
^КС1снв1:100А^6ТО5З-6 60 мМ КС1 сыв 1:50 ==f3_6
Рис. 7. Механограммы циркулярных1 полосок фундуса желудка крысы, демонстрирующие ми-оцитстимулирующую активность сыворотки крови (больных КЗЗ) в разведениях 1:103, 1:500, 1:100 и 1:50 на интактных полосках (панель А), и сыворотки пуповинной крови на фоне ГРК (60 мМ КС1; панель Б).
Калибровки: 3 мН, 10 мин (панель А); 10 мН, 10 мин (панель Б).
Исследование влияния 1000-, 500-, 100- и 50-кратных разведений сыворотки крови новорожденных и пациентов с КЗЗ на стимулирующий эффект адреналина (Ю-6 г/мл) при наличии в среде обзидана (Ю-6 г/мл) было проведено на циркулярных полосках фундуса желудка в двух вариантах: на фоне ГРК-вызванного тонуса (сыворотка новорожденных) и на интактных полосках (сыворотка пациентов с КЗЗ).
На фоне ГРК-вызванного тонуса (рис. 7, Б, табл. 6), величина которого варьировала от 5.30 мН до 7.84 мН, 1000-, 500- и 50-кратные разведения сыворотки крови новорожденных дополнительно повышали тонус (соответственно до 135.70,118.60 и 117.50% от первоначального). И хотя 100-кратное разведение не изменяло тонус полосок (103.90%), эти данные, с одной стороны, подтверждают наличие в крови ЭАСМ, а с другой - впервые демонстрируют способность ЭАСМ повышать С А миоцитов даже в условиях их деполяризации, вызванной ГРК. Кроме того, в этих опытах было показано (см. рис. 7, Б и табл. 6), что дополнительное введение на фоне ГРК и сыворотки крови адреналина (10~6 г/мл) совместно с обзиданом (10~6 г/мл) не меняло достоверно тонус полосок. Это означает, что содержащиеся, согласно данным нашей лаборатории [11,19,23], в сыворотке крови человека эндогенные модуляторы а-адренореактивности (ЭСААР, ЭБААР) не способны в этих условиях проявить характерную для них активность.
Таблица 6. Тонус циркулярных полосок фундуса желудка крысы при действии гиперкалиевого (60 мМ КС1) раствора Кребса (ГРК, мН) сыворотки пуповинной крови и адреналина (Ю-6 г/мл) совместно с обзиданом (10 6 г/мл), в % к 1-му этапу
Этапы эксперимента Разведения сыворотки крови
1:1000 (и=6) 1:500 (п-9) 1:100 (п=8) 1:50 (п= 13)
1-й ГРК 5.30±0.59 7.84±0.77 7.04±0.95 7.04±0.95
2-й ГРК + сыворотка 135.70±9.52* 118.60±3.57* 103.90±6.19 117.50±3.99*
3-й ГРК + сыворотка + адреналин! обзидан 127.0±8.04* 113.80±6.64* 102.10±6.89 111.80±4.57
* Различие с 1-м этапом достоверно (р<0.05) по критерию Тьюки.
В опытах на интактных циркулярных полосках фундуса желудка показано (см. рис. 7, А; табл. 7), что 1000-, 500-, 100- и 50-кратные разведения сыворотки пациентов с КЗЗ повышают базальный тонус полосок (соответственно до 0.79,1.42,1.59 и 2.01 мН), что также свидетельствует о наличии ЭАСМ в сыворотке крови. Адреналин (Ю-6 г/мл) совместно с обзиданом (Ю-6 г/мл) в отсутствие сыворотки крови повышал тонус полосок до 2.01мН, а при наличии 1000-кратного разведения сыворотки - лишь до 1.89 мН, что составляет 108.9% от этой величины. При наличии 500-, 100- и 50-кратных разведений сыворотки адреналин повышал тонус соответственно до 2.54,2.63 и 3.48 мН или до 126.40, 122.10 и 179.90% от этой величины (различие с контролем было достоверно лишь в опытах с разведением 1:50). Если бы сыворотка крови не содержала ЭБААР, то во всех случаях тонус, вызываемый адреналином на фоне сыворотки, был бы не меньше аддитивной величины, т.е. суммы тонуса, вызываемого сывороткой, и тонуса, вызываемого адреналином (соответственно 2.80, 3.43, 3.60 и 4.02 мН). Однако реально он оказался меньше (в среднем на 0.90 мН), особенно при действии адреналина на фоне разведений 1:1000,1:500 и 1:100. Косвенно эти данные свидетельствуют о наличии в сыворотке крови ЭБААР, который может снижать а-стимулирующий эффект адреналина. Полагаем, что вопрос о влиянии ЭБААР и ЭСААР на а-адренореактивность гладких мышц желудка требует дальнейших исследований.
Таблица 7. Тонус циркулярных полосок фундуса желудка крысы при действии сыворотки крови пациентов с КЗЗ (мН), а также сыворотки крови совместно с адреналином (10 6 г/мл) и обзиданом (Ю-6 г/мл) (мН) в % к тонусу, вызванному адреналином (Ю 6 г/мл) совместно с обзиданом (10 6 г/мл) в отсутствие сыворотки крови и равному 2.01±0.22 мН (я=10)
Этапы эксперимента Разведения сыворотки
1:1000 (и=8) 1:500 (и=10) 1:100(л=8) 1:50(и=9)
1-й Сыворотка крови мН 0.79±0.27 1.42±0.21 1.59±0.24 2.01±0.40
2-й Сыворотка + мН 1.89±0.32* 2.54±0.45* 2.63±0,31* 3.48±0.бГа
адреналин + обзидан % 108.9&Ы8.01 126,40±15.95 122.10±11.82 179.90±23.66а
* Различие с 1-м этапом достоверно (р<0.05) по критерию Тьюки. а - различие с разведениями 1:100 и 1:50 достоверно (р<0.05) по критерию Тьюки.
Наши данные о стимулирующем влиянии а-адренергических воздействий позволяют предположить, что в условиях организма характер и эффективность адренергических влияний на сократительную деятельность желудка будет зависеть от соотношения популяций а-АР и р-АР, а также от наличия эндогенных и экзогенных модуляторов адрено-реактивности. Например, адренергические воздействия могут повышать СА желудка у больных, принимающих ¡3-адреноблокаторы, и существенно снижать С А желудка у беременных женщин, так как у них, согласно данным нашей лаборатории [12,16], повышено содержание ЭСБАР, за счет которого возрастает эффективность активации (3-АР.
В целом результаты наших исследований 1) подтверждают гипотезу о наличии в крови системы эндогенных модуляторов хемореактивности [11, 12,19]; 2) демонстрируют способность ЭБМХР, ЭББАР и ЭБААР, а также ЭАСМ участвовать в регуляции моторной функции желудка; 3) свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения роли эндогенных модуляторов М-холино, а- и р-адренореактивности в условиях нормы и патологии, их природы, а также поиска их аналогов среди используемых в медицине лекарственных средств.
Выводы. 1. Ацетидхолин (АХ, 10"8-Ю-5 г/мл) дозозависимо повышает тонус полосок желудка крысы. Их М-холинореактивность зависит от места иссечения: она наиболее высокая у полосок корпуса, а самая низкая - у полосок антрума. Сыворотка крови новорожденных дозозависимо снижает АХ-вызванный тонус полосок, т. е. проявляет М-холиноблокирующую активность. Это объясняется наличием в крови эндогенного бло-катора М-холинорецепторов (ЭБМХР). Чувствительность полосок к ЭБМХР зависит от места их иссечения - она максимальна у продольных и циркулярных полосок фундуса (ЭБМХР-активность проявляли разведения 1:1000, 1:500, 1:100 и 1:50) и минимальна у циркулярных полосок корпуса и антрума (1:100,1:50). На циркулярных полосках фундуса сыворотка крови взрослых здоровых людей (1:1000,1:500,1:100 и 1:50) проявляет такую же ЭБМХР-активность, как и сыворотка крови новорожденных. 2. Адреналин в концентрациях 10~7 и Ю-6 г/мл при избирательной активации p-адренорецепторов (АР), т. е. на фоне ницерголина (Ю-6 г/мл), снижает тонус полосок желудка, вызванный гипер-калиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса (ГРК) или сывороткой крови (1:1000, 1:500, 1:100,1:50) пациентов КЗЗ. Сыворотка крови (новорожденные, пациенты с КЗЗ) вразве-дениях 1:100,1:50 уменьшает релаксирующий эффект адреналина (10~б г/мл), т. е. проявляет p-адреноблокирующую активность, что объясняется наличием в крови эндогенного блокатора р-АР (ЭББАР). 3. Адреналин в концентрации 10~6 г/мл при избирательной активация а-АР, т. е. на фоне обзидана (Ю-6 г/мл), повышает базальный тонус полосок фундуса желудка, а также их тонус, вызванный ГРК или сывороткой новорожденных (1:1000,1:500,1:100 и 1:50). Сыворотка пациентов с КЗЗ (1:1000,1:500 и 1:100) снижает стимулирующий эффект адреналина, что объясняется наличием в ней эндогенного блока-тора а-АР (ЭБААР).4. Сыворотка крови (1:1000,1:500,1:100 и 1:50) дозозависимо повышает базальный тонус полосок фундуса желудка крысы (пациенты с КЗЗ) и дополнительно увеличивает их KCl-вызванный тонус (новорожденные), т. е. проявляет миоцитстимулирующую активность. Это объясняется наличием в крови эндогенного активатора сократимости миоцитов (ЭАСМ). 5. ЭБМХР, ЭББАР, ЭБААР, а также ЭАСМ участвуют в регуляции сократительной активности гладких мышц желудка.
Summary
Kunshin A. A., Nozdrachev A. D., Tsirkin V. I., Truhina S. I., Dvorjanskij S. A., Pomaskina Т. V., Guljaeva S. F., KostjaevA. N. Influence of human blood serum on M-cholino - and a-, /3-adrenoreactivity of rat stomach smooth muscles.
Research is made on 386 smooth muscle strips of rat stomach (rc=172).It is shown, that acetylcholine (Ach, 10~8-10~5 g/ml) raises a tonus of strips (it is dependent on a doze). Especially high sensitivity to Ach was characterized for corpus stips. Adrenaline (10 7, 10~6 g/ml) at selective activation of p-adrenoceptors (on a background nicergoline, 10~6 g /ml) reduced a stomach strip tonus, caused hyperpotassium (60 mM KC1) Krebs solution (HKS) or blood serum, and at selective activation of a-adrenoceptors (on a background obsidan, 10~6 g/ml), on the contrary (in concentration of 10~6 g/ml), raised basal tonus and a tonus, caused by blood serum or HKS. Blood serum in dilution 1:1000, 1:500, 1:100 and 1:50 reduced (it is dependent on a doze) stimulating effect of Ach (10-® g/ml), especial ly in experiments with fundus strips; in dilution 1:100 and 1:50 it reduced inhibitory effect of adrenaline (10~6 g/ml); in dilution 1:1000, 1:500 and 1:100 reduced stimulating effect of adrenaline (10~6 g/ml). Besides, blood serum in dilution 1:1000, 1:500, 1:100 and 1:50 raised basal tonus of fundus strips and in addition increased its HKS-induced tonus. It thus appears that blood serum showed M-cholino-, p- and a-adrenoblokatory and also myocytstimulatory activity It is explained by the presence in blood serum of endogenous blokators of M-cholinoceptors, р-adrenoceptors and a-adrenoceptors (EBMChR, EBBAR, EBAAR) and also endogenous activator myocytes contractility (EAMC). It is supposed, that these factors in conditions in vivo regulate the activity of smooth muscles of a rat stomach.
E-mail: tsirkin@eist.ru
Литература
1. Авакян А. Э., Ткачук В. А. Структурная и функциональная организация систем передачи сигнала через рецепторы, сопряженные с G-белками // Рос. физиол. журн. 2003. Т. 89. №2. С. 219-239.2. Александров А. Я, Овсянников В. И. Эффект стимуляции альфа-адренорецепторов и блокады миоэлектрической активности тонкой кишки и пилорического сфинктера // Физиол. журн. СССР. 1990. Т. 76. №12. С. 1691-1700. 3. Богач П. Г., Каплуненко H.A. Чайченко Г.М., Миленов К. Т. Электрическая активность гладких мышц желудка и тонкой кишки // Физиол. журн. СССР. 1971. Т. 57. №2. С. 276-283.4. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.; 1999. 5. Гройсман С. Д., Красилъников К. Б. Исследование действия катехоламинов на моторную функцию желудка и двенадцатиперстной кишки ненаркотизированных собак // Автономная нервная система. 1986. Т. 17. №1. С. 33-44. 6. Куншин A.A., Проказова Я В., Трухина С. И. Влияние фосфатидилхолина и лизофосфатидилхолина на М-холинореактивность гладких мышц фун-дального отдела желудка крысы // Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: Тез. докл. Сыктывкар, 2006. С. 75-76. 7. Мальчикова С. В., Сизова Е. Я, Циркин В. И. М-холиноблокирующая активность сыворотки крови при остром коронарном инциденте и влияние на нее физических тренировок // Рос. физиол. журн. 2003. Т. 89. №5. С. 556-563.8. Ноздрачев А. Д., Туманова Т. В., Дворянский С. А. Активность ряда аминокислот как возможных сенсибилизаторов ß-адренорецепторов гладкой мышцы // Докл. РАН. 1998. Т. 363. №1. С. 133-136. 9. Проказова Н. В., Звездина Я. Д., Суслова И. В. Влияние лизофосфатидилхолина на чувствительность сердца к ацетилхолину и параметры связывания хинуклидинилбензила-та с мембранами миокарда // Рос. физиол. журн. 1998. Т. 84. №10. С. 969-978.10. Сизова Е. Я, Циркин В. И., Дворянский С, А. Изучение роли эндогенных модуляторов хемореактивности в регуляции коронарного кровотока// Рос. физиол. журн. 2002. Т. 88. №7. С. 856-864. И. Сизова Е. Я, Ноздрачев А. Д., Циркин В. И. Гипотеза о системе эндогенной модуляции деятельности периферических автономных нервных структур //Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 2. С. 40-46. 12. Сизова Е. Я, Циркин В. И. Физиологическая характеристика эндогенных модуляторов ß-адре-но- и М-холинореактивности. Киров, 2006. 13. Снигирева Н. Л., Тарловская Е. И., Кашин Р. Ю. Влияние сыворотки крови больных с артериальной гипертензией на адренореактивность гладких мышц почечной артерии коровы //Артериальная гнипертензия. 2006. Т. 12, приложение. С. 78. 14. Трухин А. Н., Циркин В. И., Сизова Е. Н. Повышение ß-адренореактивности миокарда лягушки под влиянием гистидина // Бюл. эксп. биол. и мед, 2004. Т. 138. №8. С. 144-147.15. Циркин В. И., Дворянский С. А., Ноздрачев А. Д. Повышение ß-адренореактивности коронарных артерий под влиянием сыворотки крови // Докл. РАН. 1996. Т. 351. №4. С. 565-566.16. Циркин В. И, Дворянский С. А. Сократительная деятельность матки (механизмы регуляции). Киров, 1997. 17. Циркин В. И., Дворянский С. А., Ноздрачев А. Д. Адреномодулирующие эффекты крови, ликво-ра, мочи, слюны и околоплодных вод человека // Докл. РАН. 1997, Т. 352. №1. С. 124-126. 18 .ЦиркинВ. И., Ноздрачев А. Д., Дворянский С. А. Эндогенный сенсибилизатор ß-адренорецепторов // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 1997, Вып. 1. С. 74-84. 19. Циркин В. И., Ноздрачев А. Д., Сизова Е. Н. Система эндогенной модуляции, регулирующая деятельность периферических автономных нервных структур //Докл. РАН. 2002. Т. 383. №5. С. 698-701. 20. Циркин В. И., Сизова Е. Н., Подтетенев А. Д. Триметазидин и милдронат как ß2-aflpeHoceHCH6wm3aTopbi прямого действия (экспериментальные доказательства) //Рос. кард иол. журн. 2002. №1 (33). С. 45-52. 21. Циркин В. И., Ноздрачев А. Д., Сазонова М. Л. Физиологические свойства миоцитов артерий и вены пуповины человека и влияние на них сыворотки пуповинной крови //Докл. РАН. 2003. Т. 388. № 3. С. 426-429. 22. Циркин В. И., Ноздрачев А. Д., Сазонова М. Л. Утероактивные, ß-адре-номодулирующие и М-холиномодулирующие свойства сыворотки пуповинной крови человека // Докл. РАН. 2003. Т. 388. №5. С. 704 -707. 23. Циркин В, И., Ноздрачев А. Д., Сизова Е. Н. Изменение содержания в крови эндогенных модуляторов ß-адрено- и М-холинореактивности под влиянием физических тренировок у лиц, перенесших инфаркт миокарда // Бюл. эксп. биол. и мед. 2003. Т. 136. №7. С. 18-22.24. ЦиркинВ. Я, Трухин А. Я, СизоваЕ. Я. Изменение М-холинореактивности миокарда лягушки под влиянием сыворотки пуповинной крови человека // Рос. кардиол. журн. 2004. №2. С. 64-69,25. Циркин В. Я„ Кононова Т. Я, Сизова Е. Я ß-Адрено- и М-холиномо-дулирующая активность сыворотки крови и мочи при бронхиальной астме // Вятский мед. вестн.
2006. №1. C. 53-65.26. Boev K., Kortezova N., Papasova M. Coordination between the longitudinal and circular layers of the stomach during the excitator-contractile process // Acta Physiol. Pharmacol. Bulg. 1976. Vol. 2. N 3. P. 15-22. 27. Burches E. Effects of calcium antagonists on rat normal and skinned fundus //J. Pharm. Pharmacol. 1992. Vol. 44. N6. P. 500-506. 28. Cirstea M. An unidentified serum factor with smooth muscle stimulating properties // Rev. Roum. Physiol. 1973. Vol. 10. N4. P. 309-315. 29. Fandriks L.,Jonson C. Effects of adrenoceptor antagonists on vagally induced gastric and duodenal HCO3" secretions in the cat // Acta Physiol. Scand. 1987.Vol. 130. N2. P. 243-249. 30. Fulop K., Zadori Z., RonaiA., Gyires K. Characterisation of alpha 2-adrenoceptor subtypes involved in gastric emptying, gastric motility and gastric mucosal defence // Eur. J. Pharmacol. 2005. Vol. 528. N13. P. 150-157, 31. Golenhofen K., WegnerH. Spike-free activation mechanism in smooth muscle of guinea-pig stomach // Pfliigers Arch. 1975. Vol. 354. P. 29-37.32. Hennig G., Hirst G., Park K. Propagation of pacemaker activity in the guinea-pig antrum // J. Physiol. 2004. Vol. 556. Pt. 2. P. 585-599. 33. Mandrek K., Kreis S. Regional differentiation of gastric and of pyloric smooth muscle in the pig: mechanical responses to acetylcholine, histamine, substance P, noradrenaline and adrenaline //J. Auton Pharmacol. 1992. Vol. 12. N1. P. 37-49.34. OhtaT.,ItoS., OhgaA, Effects of vasoactive intestinal peptide (VIP) on contractile responses of smooth muscle in rat stomach // Br. J. Pharmacol. 1991. Vol. 102. N3. P. 621-626. 35. Petroianu A., Weinberg J. Motility of isolated mammalian gastric fundus // Comp. Biochem. Physiol. 1986. Vol. 85. N1. P. 57-59. 36. Wang B„ Cheng F. Subtypes of muscarinic receptors and functions of intestinal smooth muscles // Zhongguo bingli shengli zazhi. 2001. Vol. 17. N11. P. 1093-1096. 37. Xue L., Fukuta H., Yamamoto Y., Suzui H. Properties of junction potentials in gastric smooth muscle of the rat // Jap, J. Physiol. 1996. Vol. 46. N2, P. 123-130. 38. Zvezdina N. D., Prokazova N. V., Vaver V. A., Bergelson L. D., Turpaev T. M. Effect of lysolecithin and lecithin of blood serum on the sensitivity of heart to acetylcholine // Biochem. Pharm. 1978. Vol. 27. N10. P. 2793-2801.
Статья принята к печати 19 февраля 2007 г.
