CC BY
4
УДК 619: 578. 825: 636.085.3 + 636.085. 57
Назар Б.1., 1, кандидат ветеринарних наук;
Державный науково-дослгдний контрольный ¡нститут ветпрепарат1в та кормових добавок, м. Львгв.
АКТУАЛЬН1 ПИТАННЯ ВИДОВО1 ДИФЕРЕНЦ1АЦП Б1ЛК1В ТВАРИННОГО ПОХОДЖЕННЯ МЕТОДОМ ПЛР
Видова диференщащя бткгв тваринного походження методом пол1меразног ланцюговог реакцИ (ПЛР) у рибному та м'ясному борошт, комбжормах для с.г.тварин, птищ, сухих I консервованих кормах для домаштх тварин (собак I котгв) у сирих м'ясних продуктах та тих, що тддавались кул1наршй обробщ тощо, дозволяе запоб1гати фальсифжацп даног продукцп.
Одним iз складних завдань, яке постшно доводиться виршувати ветеринарнш службу е видова диференщащя м'яса в продуктах харчування i кормах, що тддавалися термiчнiй обробщ. Необхщшсть цього очевидна для захисту споживача вщ фальсифшаци м'ясно! продукци. Значимють ще1 проблеми в останнi роки ще бiльше зросла у зв'язку з вiдкриттям нових видiв прюнних захворювань сiльськогосподарських i домашнiх тварин, що вщносяться до групи трансмiсiйних губкоподiбних енцефалопатiй (ГЕ).
З 1996р. у вах крашах Свропейського Союзу (£С) уведена заборона на згодовування жуйним тваринам м'ясо-кiсткового борошна, виготовленого з ссавщв. Проте, ризик зараження досить великий через незаконний збут м'ясо-юсткового борошна в краши, що не е членами £С i фальсифшаци добавками проте1шв ссавщв. У зв'язку з вщкриттям в останш роки ГЕ кiшок, у групу ризику потрапили i корми для домаштх тварин. Крiм вищевикладеного, необхiдно контролювати вiдсутнiсть тваринного бшка i в комбiкормах для племшно! птицi.
Усе вищевикладене пояснюе актуальшсть визначення видово! приналежностi м'ясних iнгредiентiв у складi кормiв. Причому в кормах, що тддавалися термiчнiй обробщ (м'ясо-кюткове борошно, рибне борошно, сухi i консервованi корми для юшок i собак) визначити видову приналежшсть тваринного бiлка значно складнiше, шж у нативних м'ясо-продуктах. Термiчна обробка приводить до денатураци бiлкiв i втрати ними видово1 специфiчностi, а значить, таю методи, як iмунодифузiя в гел^ iзоелектричне фокусування, iмуно-ферментний аналiз, що використовуються для видово1 щентифшацл сирого м'яса, стають малопридатними.
Метод 1ФА дозволяе надшно виявляти домiшки м'ясо-кiсткового борошна в рибному i курячому борошнi тшьки в концентраци не менш 50%, у той час як ПЛР виявляе вже 1% домшок. Таким чином, при виявленш домшок тканин жуйних тварин у складi кормiв, чутливiсть ПЛР е, принаймнi, у 100 разiв вищою, нiж 1ФА.
1 Науковий кер1вник Д.Ф. Гуфрш д.в.н., професор Назар Б.1., 2009
100
Тому останшм часом усе бшьше поширення одержують нов^ш методи дiагностики, заснованi на виявленш в дослiджуваних клiнiчних зразках специфiчних нуклеотидних послiдовностей генома бiлкiв тваринного походження. Найбшьшо1 уваги серед цих методiв заслуговуе полiмеразна ланцюгова реакщя, в основi яко! лежить багаторазове повторення циклiв подвоення (амплiфiкацiя) специфiчноl дiлянки нуклеотидно! послiдовностi. Як уже вщзначалось, головна перевага методу - дуже висока чутливiсть. У результат амплiфiкацil концентрацiя специфiчноl ол^онуклеотидно1 послщовност в реакцiйнiй пробi зростае в десятки мшьйошв разiв.
Вихiдним матерiалом для аналiзу генiв методом ПЛР може бути геномна ДНК (у крайньому випадку з одинично! кл^ини чи кiлька хромосомних фрагментiв, отриманих на мжромашпулятор^, РНК (можливо всього декшька клiтин), нуклешова кислота з архiвних зразкiв, клонованна ДНК чи самi ПЛР-продукти.
Два ключових компоненти ПЛР, ДНК-полiмераза i праймери заслуговують спецiального коментаря. В даний час для ПЛР використовують ДНК-полiмеразу ^егтш aguaticus (Таg-полiмеразу). Таg-полiмераза термостабiльна i тому вiдпадае необхiднiсть додавати свiжу порцiю ферменту пiсля кожного циклу ПЛР. Оптимум роботи Таg-полiмерази лежить в дшянщ 75°С, що дозволяе вести вщпалювання праймера i елонгащю при досить високiй температурi, збшьшуючи тим самим специфiчнiсть взаемоди праймерiв з матрицею. У якостi праймерiв використовують зазвичай олiгодезоксирибонуклеотиди. Специфiчнiсть амплiфiкацil задано1 дiлянки ДНК забезпечуеться за рахунок специфiчностi i пбридизаци праймерiв. Однак, як уже вiдзначалося, необхщшсть наявностi шформаци про послiдовнiсть ДНК, для яко! синтезуються праймери, е недолгом, властивим ПЛР. У той же час саме використання двох рiзних праймерiв рiзко пiдвищуе специфiчнiсть реакци.
ПЛР заснована на амплiфiкацil ДНК за допомогою ДНК-полiмерази, яка здшснюе синтез взаемно комплементарних ланцюпв ДНК, починаючи з двох ол^онуклеотидних праймерiв (запалiв). Праймери комплементарнi протилежним ланцюгам ДНК у дiлянках, що обмежують обрану область ДНК, i орiентованi З'-кiнцями назустрiч один одному й убж ие1 послiдовностi, яку необхщно амплiфiкувати. Очевидно, що для амшлфшацл цiкавлячого району ДНК необхщно мати хоча б мшмальну шформащю про його кiнцевi дiлянки (наприклад, про N- i З-кiнцевi послщовност бiлка, якщо мова йде про амплiфiкацiю структурно1 областi його гена) для того, щоб синтезувати вщповщш праймери. При синтезi ДНК праймери фiзично вбудовуються в ланцюг, знову синтезуючи молекули ДНК.
ПЛР - це ци^чний процес; у кожному ци^ число молекул ДНК мшеш роздiляються при нагрiваннi, потiм при охолодженш з ними зв'язуються праймери. Даш ДНК - полiмераза нарощуе праймери, приеднуючи до них нуклеотиди. ДНК-полiмераза - це фермент, здатний нарощувати короткi ланцюги ДНК, так зваш олiгонуклеотиднi праймери, якщо щ короткi ланцюги зв'язанi з бшьш довгим "матричним" ланцюгом ДНК. У результат утворюються копи ланцюгiв вихщно1 ДНК-мiшенi. Оскiльки число копiй зростае експотенщально, усього за кiлька годин можна одержати бшьш 100 млрд. копш.
101
Практична сторона виглядае досить просто. У пробiрцi змшують ДНК, праймери, дезоксирибонуклеозидтрифосфати, буфер i ДНК-полiмеразу.
Циклiчна змiна температури реакцшно! сумiшi (яке пiддаеться автоматизацп): денатуращя (94°С) - гiбридизацiя праймера (звичайно 40-60°С) -елонгацiя (72°С) забезпечуе протiкання ПЛР.
Ефективнiсть методу ПЛР така, що по проходженню 25-30 ци^в для того, щоб побачити пофарбований бромистим етидiем ДНК-продукт тсля електрофорезу в агарозi, досить узяти для ан^зу десяту частину реакцшно! сумш^ навiть у тому випадку, якщо вихiдна кiлькiсть потрiбно! ДНК у пробi була дуже малою.
Результати дослщжень.
Незважаючи на те, що в крашах Свропейського Союзу введено заборону на згодовування жуйним тваринам м'ясо-кiсткового борошна, виготовленого iз ссавцiв, ризик зараження досить великий через незаконшсть збуту такого борошна у третi краши свiту i фальсифшаци рибного борошна добавками проте!шв ссавцiв.
Завданням дано! роботи було розробити методику визначення наявност ДНК жуйних тварин, свиней та птищ у кормових добавках, кормах та сировиш тваринного походження.
Для встановлення чутливостi методу визначення видово! приналежност бiлкiв було виготовлено зразки комбiкормiв з рiзним вмiстом м'ясо- юсткового борошна з жуйних тварин ( яловичина та баранина) в процентному спiввiдношеннi: 0,5; 0,8; 1,0; 1,5 та свининою i птицею: 0,5; 0,8; 1,0; 1,5.
У дослщжуваних пробах проводили визначення наявност бшюв для встановлення мiнiмальноl кiлькостi м'ясо-юсткового борошна з жуйних тварин, свиней та птищ, яку можна визначити за допомогою ПЛР аналiзу.
Таблиця 1
Результати по ПЛР за 2001 - 2008 роки.
До^джувальт зразки Всього Негативт Позитивт
Загальна к1льк1сть визначень 629 558 71
1. Корми для непродуктивних тварин 402 338 64
2. Премжси, бшково-вгтамшш добавки 116 166 -
3. Комбжорми, корми для с.г. тварин, птищ та риб , борошно рибне 1 тваринного походження. 29 29 -
4. 1нше (фарш1 р1зного походження, супи, препарати та шше) 67 55 12
У перюд з 2001 по 2008 рш включно нами було проведено 629 визначень з виявлення наявност бшюв жуйних тварин у кормах для непродуктивних тварин, премшсах i бшково-в^амшних добавках та iншому (фаршi рiзного походження, супах, ветеринарних препаратах) котрi iмпортуються в Укра1ну.
При проведенш дослiджень було виявлено наявшсть бiлкiв жуйних тварин у 64 пробах iз 402 кормiв для непродуктивних тварин, котрi надiйшли для реестрацп дано! продукци в Укра1ш. Крiм цього, виявлено в 12 пробах шшо! продукци (фаршi рiзного походження, супах, ветеринарних препаратах) при спробi завезення в Укра!ну. Отриманi результати подано в таблищ 1.
102
Для запоб^ання розповсюдження прюнних шфекцш в Укра!ш реестращю з подальшим завезенням до Укра!ни продукци, в яКй виявлено бшки жуйних тварин було вiдмовлено.
Метод визначення видово! приналежностi м'яса i м'ясних iнгредieнтiв, що входять до складу продовольчо! сировини тваринного походження, кормiв i готових харчових продукив необхiдний для пiдтвердження якостi й автентичност цих зразкiв. Найчастiше при лабораторному дослщженш деяких проб, у !хньому складi можуть бути знайдеш компоненти, не декларованi виробником, або навпаки, вщсутш заявленi iнгредieнти, тобто, встановлювалась фальсифiкацiя цих продуктiв. Межа виявлення залежала вщ глибини переробки дослщжувано! проби (у тому числ^ вiд глибини термообробки) i вщ складу зразка. Наприклад, межа виявлення рiзних видiв м'яса в сосисках чи в шшш готовiй м'яснш продукци складала близько 1% i бiльше. При дослiдженнi кормiв межа виявлення звичайно складала 0,5% i бшьше, залежно вiд складу зразка.
Результати встановлення видово!" приналежност тканин тварин ПЛР-1ФА
методом (2005-2008 роки).
Дослгджувальт зразки Всього Виявлено незадекларованих тканин
ВРХ Птищ Свиней
1. Корми для непродуктивних тварин 80 8 10 7
2.Фарш1 р1зного походження,) 60 12 7 -
3. Супи, препарати та шше 10 2 1 -
4. 1нше ( 15 2 6 3
Висновок.
Використання тест-системи для визначення видово! приналежност тканин тварин (велико! та дрiбноl рогато! худоби, свиней та птищ у рибному i м'ясному борошнi, комбiкормах для с/г-ких тварин i птицi, сухих i консервованих кормах для домашнiх тварин (собак i кiшок), у сирих м'ясних продуктах i м'ясних продуктах, що тддавались кулiнарнiй обробцi. дозволить запоб^ти фальсифiкацi! рибного борошна та шшо! продукци тканинами ссавцiв, проводити диференцiацiю видово! приналежностi проте!нiв у складi кормiв для тварин i м'ясних продуктах, що становить важливе економiчне й епiдемiологiчне значення.
Лггература:
1. Методичнi рекомендацi! з проведення роб^ у дiагностичних лабораторiях, що використовують метод полiмеразно! ланцюгово! реакци. Основнi положення.
Стаття надшшла до редакцИ 11.09.2009
103
