CC BY
57
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ УДК 577.23:616.36-056.25
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук, О.Д. Бадяк
АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЭНЗИМОВ МАЛАТ-АСПАРТАТНОГО ШУНТА В ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ АЛИМЕНТАРНОЙ ДЕПРИВАЦИИ ПРОТЕИНА
Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета
имени Юрия Федьковича Кафедра биохимии и биотехнологии, Украина, 58012, г. Черновцы, ул. Коцюбинского, 2. E-mail: [email protected]
Цель: изучить активности митохондриальных изоформ малатдегидрогеназы и аспартатаминотрансфера-зы, а также количественное содержание оксалоацетата и цитоплазматическое соотношение NAD+/NADH в печени крыс в условиях алиментарной депривации протеина.
Материалы и методы: исследования проводили на 2 группах животных, сформированных в зависимости от количества примененного в рационе белка: 1 — крысы, содержащиеся на низкопротеиновом рационе; 2 — крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе.
Результаты: в условиях алиментарной депривации протеина активность митохондриальной изоформы малатдегидрогеназы достоверно не изменяется, при этом наблюдается торможение активности митохон-дриальной изоформы аспартатаминотрансферазы и снижение количественного содержания оксалоацетата на фоне увеличения цитоплазматического соотношения NAD+/NADH
Выводы: результаты указывают на торможение притока гликолитического NADH, что может рассматриваться как один из возможных механизмов нарушения работы системы биотрансформации энергии в условиях недостаточности белка в рационе.
Ключевые слова: алиментарная депривация протеина, аспартатаминотрансфераза, малатдегидрогеназа, оксалоацетат, цитоплазматическое соотношение NAD+/NADH.
O.N. Voloshchuk, G.P. Kopylchuk, O.D. Badyak
ACTIVITY OF THE LIVER MALATE-ASPARTATE SHUTTLE MITOCHONDRIAL ENZYMES IN RATS UNDER THE CONDITIONS OF ALIMENTARY DEFICIENCY OF PROTEIN
Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named by
Yurii Fedkovych, Biochemistry and biotechnology department, 2 Kotsyubyns'kogo st., Chernivtsi, Ukraine, 58012. E-mail: [email protected]
Purpose: activity of the mitochondrial isoforms of malate dehydrogenase and aspartate aminotransferase, the qualitative content of oxaloacetate and cytoplasmic ratio NAD+/NADH in the rats' liver under the conditions of alimentary deprivation of protein was studied in the research. Materials and methods: research was conducted on 2 groups of animals: 1 — rats fed a hypoprotein diet; 2 - rats fed a complete semi-synthetic ration.
Results: it is estimated that under the conditions of alimentary deprivation of protein the activity of the malate dehydrogenase mitochondrial isoform isn't changed significantly.
Conclusion: at the same time an inhibition of the aspartate aminotransferase mitochondrial isoform activity along with the decrease of oxaloacetate qualitative content against the background increase of the cytoplasmic ratio NAD+/NADH is observed, indicating the inhibition of glycolytic NADH inflow, which may be considered as one of the possible mechanisms of energy biotransformation system disturbance under the conditions of protein deficiency in the ration.
Key words: alimentary deprivation of protein, aspartate aminotransferase, malate dehydrogenase, oxaloacetate, cytoplasmic ratio NAD+/NADH.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Введение
Печень является основным гомеостатическим органом, формирующим обменный и энергетический пул для метаболизма биомолекул [1]. В первую очередь, состояние энергообеспечения гепатоци-тов зависит от эффективности работы дыхательной цепи митохондрий [2, 3]. В то же время, одной из ключевых реакций, обеспечивающей образование восстановленных эквивалентов, используемых электронтранспортной цепью митохондрий, является реакция гликолитической оксидоредукции. При этом основным метаболическим путем передачи гликолитического NADH из цитоплазмы в митохондрии для его дальнейшего окисления является малат-аспартатная челночная система [4, 5]. Ключевые энзимы малат-аспартатного челночного механизма — цитозольная и митохондриальная ма-латдегидрогеназа и аспартатаминотрансфераза [6]. На сегодня остается открытым вопрос последовательности биохимических реакций, определяющих развитие и реализацию дисфункции работы системы биотрансформации энергии в печени в условиях алиментарной депривации протеина. Показано, что в условиях низкобелкового питания наблюдается снижение эффективности окислительного фос-форилирования [7], однако причины такого факта не изучены. При этом вклад нарушений работы ма-лат-аспартатного шунта в дисбаланс системы энергообеспечения клеток печени в условиях белковой недостаточности в литературе не рассматривается.
Цель исследования — определить активности митохондриальных изоформ малатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы в печени крыс, содержащихся при различных режимах белкового питания.
Экспериментальная часть
Исследования проводили на белых нелинейных крысах массой 90-100 г и возрастом 2-2,5 месяца. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Крыс содержали по одной в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.
В зависимости от количества примененного в рационе белка было сформировано 2 группы животных: 1 — крысы, содержащиеся на низкопротеиновом рационе (НПР); 2 — крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе (К).
Животные контрольной группы на протяжении 28 суток получали рацион, включающий 14% белка (в виде казеина), 10% жиров и 76% углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [9]. Животные экспериментальной группы получали изоэнергети-ческий рацион, содержащий 4,7 % белка, 10% жиров, 85,3% углеводов.
Цервикальную дислокацию крыс под легким эфирным наркозом осуществляли на 29 сутки эксперимента.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Выделение митохондриальной фракции из гомо-гената печени проводили с помощью метода дифференциального центрифугирования при 0-30С [3]. Цитозольную фракцию получали после отделения микросомной фракции [9].
Активность аспартатаминотрансферазы в ми-тохондриальной фракции печени определяли спектрофотометрически [10]. Активность мито-хондриальной изоформы малатдегидрогеназы регистрировали по накоплению NADН в реакции окисления малата при Х=340 нм [11].
Соотношение редокс-форм никотинамидных коферментов рассчитывали на основе констант равновесия реакций, протекающих в определенном компартменте клетки:
1 [окисл. субстрат] NADH + H+ К [восстан. субстрат]
Цитоплазматическое соотношение NAD+/ NADН вычисляли с учетом константы равновесия лактатдегидрогеназной реакции [12]:
1 [пируват]
NADH + Н+~ 1,11 X 10"4 Х [лактат]
Концентрацию пирувата в цитозольной фракции определяли методом Умбрайта и регистрировали при 440 нм [13], а концентрацию лактата колориметрическим методом [14].
Концентрацию оксалоацетата определяли колориметрическим методом, базирующемся на взаимодействии оксалоацетата с п-нитроанилином с образованием NN'-бис-(n-нитрофенил)-С-оксалилформазана, имеющим максимум поглощения при Х=450 нм [15].
Статистическую значимость полученных результатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных «$1айзйса 6.0».
Результаты и их обсуждение
В печени крыс, содержащихся в условиях алиментарной депривации протеина, активность мито-хондриальной изоформы малатдегидрогеназы (рис. 1), катализирующей реакцию превращение малата в оксалоацетат, по сравнению с контролем достоверно не изменяется. Продуктами реакции транс-аминирования митохондриального оксалоацетата с глутаматом, катализируемой митохондриальной изоформой аспартатаминотрансферазы, являются аспартат и а-кетоглутарат, транспортируемый в цитоплазму клетки [6]. В условиях белковой недостаточности в митохондриях печени белок-дефицитных животных нами зарегистрировано снижение активности митохондриальной изоформы аспартатаминотрансферазы (рис. 2), использующей оксалоацетат в качестве субстрата, в 2 раза. Установленный факт снижения активности аспартата-минотрансферазы может быть связан либо с нарушением структурно-функционального состояния изучаемого фермента, либо с дефицитом оксало-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ацетата как его субстрата. Результаты наших исследований подтвердили данное предположение: в митохондриях печени животных, содержащихся в условиях алиментарной депривации протеина, наблюдается 5-кратное снижение количественного содержания оксалоацетата по сравнению с показателями контрольной группы животных (рис. 3). Поскольку оксалоацетат в митохондриях является субстратом не только для аспартатаминотрансфе-разы, но и является субстратом для цитратсинта-зы — фермента, катализирующего первую реакцию
цикла Кребса, вероятно, установленный нами факт снижения активности митохондриальной изофор-мы аспартатаминотрансферазы на фоне снижения количественного содержания оксалоацетата указывает на его усиленное использование в цикле трикарбоновых кислот. Учитывая роль оксалоаце-тата в обмене веществ, следствием снижения его концентрации в может являться нарушение работы системы биотрансформации энергии, гюконеогене-за либо снижение уровня аспартата, необходимого для синтеза мочевины [16].
Рис .1. Активность NAD+-малатдегидрогеназы митохондрий печени в условиях алиментарной депривации протеина
л
со х
К НПР
Рис. 2. Активность аспартатаминотрансферазы митохондрий печени в условиях алиментарной депривации протеина
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 3. Содержание оксалоацетата в митохондриях печени в условиях алиментарной депривации протеина
Рис. 4. Цитоплазматическое соотношение NAD+/NADH в клетках печени в условиях алиментарной депривации протеина
Важным показателем энергетического состояния клетки является соотношение между окисленной и восстановленной формой никотинамидных кофер-ментов NAD+/NADH [17]. Окислительно-восстановительный статус никотинамидных коферментов определяет скорость и направленность реакции оксидоредукции и контролирует функционирование метаболических путей в клетке [18]. Соотношение NAD+/NADH регулирует активность ряда фермента, в том числе гликолитического энзима глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, катали-
зирующего реакцию превращения глицеральдегид-3-фосфата с образованием 1,3 дифосфоглицерата и восстановленной формы NADH. Результаты наших исследований показали, что в условиях алиментарной депривации протеина наблюдается увеличение цитоплазматического соотношения NAD+/NADH (рис. 3), что указывает на нарушение реакции гли-колитической оксидоредукции, а также ингибиро-вание аэробного гликолиза [17], следствием чего, вероятно, будет нарушение потока гликолитиче-ского NADH в митохондрии. Сохранение актив-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ности митохондриальной малатдегидрогеназы на уровне контроля на фоне увеличение цитоплазма-тического соотношения NAD+/NADH, вероятно, указывает на активацию анаплеротических реакций, направленных на образование малата либо других метаболитов цикла Кребса с целью сохранения функциональной активности основного амфиболи-ческого пути клетки на уровне, достаточном для обеспечения энергозависимых процессов в печени.
Итак, в условиях алиментарной депривации протеина наблюдается увеличение цитоплазмати-ческого соотношения NAD+/NADH на фоне торможения активности митохондриальной изоформы аспартатаминотрансферазы и снижения количественного содержания оксалоацетата.
Выводы
Установленные изменения в работе энзимов ма-лат-аспартатного шунта и повышение цитоплазма-тического соотношения NAD+/NADH могут рассматриваться как один из возможных механизмов нарушения работы системы биотрансформации энергии в условиях недостаточности белка в рационе.
Работа исполнена в рамках госбюджетной НИР "Биохимические аспекты респонсивной интеграции метаболизма эссенциальных нутриентов" (№ госрегистрации 0115Ш03231)
ЛИТЕРАТУРА
1. Дворщенко К.О., Савко УВ., Вакал С.6. та iH. Структурно-функцiональний стан мiтохондрiй печiнки щурiв за умов ви-разкових уражень шлунка // Фiзика живого. - 2008. - Т. 16, № 2. - С. 112 - 115.
2. Sangar V., Eddy A., Price N.D., Simeonidis E. Mechanistic modeling of aberrant energy metabolism in human disease // Front. Physiol. - 2012. - Vol. 3. - P. 404.
3. Voloshchuk O.N., Kopylchuk G.P. The Peculiarities of the Structural and Functional State of the Cytochrome Component of the Liver Mitochondrial Respiratory Chain under Conditions of Acetaminophen-Induced Hepatitis on the Background of Alimentary Protein Deprivation // Biophysics. - 2015. - Vol. 60, № 3. - Р. 420-424.
4. Wang C., Chen H., Zhang J., Hong Y., Ding X., Ying W Malate-aspartate shuttle mediates the intracellular ATP levels, antioxidation capacity and survival of differentiated PC12 cells.// Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol. - 2014. - Vol. 6, № 2. -Р. 109-114.
5. Ying W NAD+/NADH and NADP+/NADPH in cellular functions and cell death: regulation and biological consequences // Antioxid. Redox. Signal. - 2008. - Vol. 10. - Р. 179-206.
6. Nielsen Т.Т., St0ttrup N.B.,Lofgren B., B0tker H.E. Metabolic fingerprint of ischaemic cardioprotection: importance of the malate-aspartate shuttle // Cardiovascular Research. - 2011. -Vol. 91. - Р. 382-391.
7. Волощук О.Н., Копыльчук Г.П., Кадайская Т.Г. Состояние системы энергообеспечения митохондрий печени в условиях алиментарной депривации протеина // Вопр. питания. -2014. - Т. 83, № 3. - С. 12-16.
8. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet // J. Nutr. - 1993. - № 5. - P. 1939 -1951.
9. Schenkman J. B., Cinti D. L. Preparation of microsomes with calcium. // Methods Enzymol. - 1978. - Vol. 52. - P. 83-89.
10. Zhou Y.-H., Shi D., Yuan B., Sun Q.-J., Jiao B.-H., Sun J.J, Miao M.-Y. Mitochondrial ultrastructure & release of proteins during liver regeneration // Indian. J. Med. Res. - 2008. - Vol. 128. -P. 157-164.
11. Cetica P., Pintos L., Dalvit G., Beconi M. Involvement of enzymes of amino acid metabolism and tricarboxylic acid cycle in bovine oocyte maturation in vitro // Reproduction. - 2003. - Vol. 126. -P. 753-763.
12. Williamson D.H., Lund P., Krebs H.A. The redox state of free nicotinamide-adenine dinucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver. // Biochem. J. - 1967. - Vol. 103. -P. 514-527.
13. Umbright J. Biochemical Methods of Chemical Studies. M.: Mir, 1969. 271 p.
14. Barker S.B., Summerson W.H. The colorimetric determination of lactic acid in biological material // J. Biol. Chem. - 1941. -Vol. 138. - P. 535-554.
15. Kalnitsky G., Tapley D.F. A sensitive method for estimation of oxaloacetate // Biochem. J. - 1958. - Vol. 70. - P. 28-34.
16. Cash A. Oxaloacetic Acid Supplementation as a Mimic of Calorie Restriction //Open Longevity Science. - 2009. - Vol. 3. - P. 22-27.
17. Christensen C.E., Karlsson M., Winther J.R., Jensen P.R., Lerche M.H. Non-invasive in-cell determination of free cytosolic [NAD+]/[NADH] ratios using hyperpolarized glucose show large variations in metabolic phenotypes // J. Biol. Chem. - 2014. -Vol. 289, № 4. - P. 2344-2352.
18. Stein L. R., Imai S.-I. The dynamic regulationof NAD metabolism in mitochondria // Trends Endocrinol Metab. - 2012. -Vol. 23(9). - P. 420-428.
