CC BY
29
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Волощук Оксана Николаевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича
Адрес: 58000, Украина, г. Черновцы, ул. М. Коцюбинского, д. 2 Телефон: (0373) 58-48-38 E-mail: oxbm@mail.ru
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук
Соотношение редокс-форм убихинона в митохондриях печени при токсическом гепатите, индуцированном на фоне алиментарной белковой недостаточности
#
The ratio of ubiqiunon redox forms in the liver mitochondria under toxic hepatitis induced on the background of alimentary protein deficiency
O.N. Voloshchuk, G.P. Kopylchuk
Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича, Украина Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsky National University named after Yuri Fedkovych, Ukraine
В работе исследовано содержание общего убихинона, а также редокс-форм Со( в митохондриях печени крыс в условиях алиментарной белковой недостаточности и токсическом гепатите, индуцированном на фоне белковой недостаточности. Исследования проведены на 36 белых нелинейных крысах, разделенных на 4 группы: 1-я - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе; 2-я - крысы, содержащиеся на низкобелковом рационе; 3-я - крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе; 4-я - крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях белковой недостаточности. Содержание общего и окисленного убихинона определяли спектрофотометрически при Х=275нм (коэфициентмолярной экстинкцииубихинона 12,25Мм-1хсм-1). Содержание восстановленного убихинона определяли по разнице содержания общего и окисленного убихинона. Количество тирозина в печени определяли в депротеинизированных 6% сульфосалициловой кислотой экстрактах ткани на автоматическом анализаторе аминокислот. Установлено, что в митохондриях печени животных в условиях низкобелкового питания наблюдается снижение содержания общего убихинона на 35% на фоне двукратного уменьшения уровня окисленного убихинона и сохранения количества восстановленного убихинона. Одновременно в ткани печени содержание тирозина, предшественника убихинона, снижено в 5 раз. Показано, что если в условиях ацетаминофен-инду-цированного гепатита уровень общего убихинона и его редокс-форм в митохондриях печени полноценно питающихся крыс по сравнению с контролем достоверно не изменяется, то в митохондриях печени крыс с гепатитом, содержащихся на низкобелковом рационе, наблюдается снижение общего убихинона на 60% на фоне резкого (в 18 раз) уменьше-
82
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук
ния количества восстановленного убихинона. Установленные изменения содержания в митохондриях печени крыс редокс-форм убихинона -ключевого компонента системы окислительного фосфорилирования -можно рассматривать как один из механизмов нарушения работы системы биотрансформации энергии в условиях токсического повреждения печени, вызванного у белок-дефицитных животных.
Ключевые слова: белковая недостаточность, токсический гепатит, убихинон, крысы
The level of the total ubiqiunon and redox forms CoQ in the rat liver mitochondria under the conditions of alimentary protein deficiency and toxic hepatitis, induced on the background protein deficiency has been investigated. Research has been carried out on 36 white non-linear rats, divided into 4 groups: 1 - rats, maintained on the complete semisynthetic ration; 2 - rats, fed low-protein ration; 3 - rats with acute acetaminophen-induced hepatitis, maintained on complete ration; 4 - rats with acetaminophen-induced hepatitis, maintained under the conditions of protein deficiency. The content of total and oxidized ubiqiunon was determined spectrophotometrically at X=275 nm (molar extinction coefficient 12.25 Mm-1xsm-1). Reduced ubiqiunon content was determined by the difference between total and oxidized ubiqiunon content. The amount of tyrosine in the liver was measured in deproteinised by 6% sulfosalicylic acid extracts of liver tissue on an automated amino acid analyzer. The decrease of the total ubiqiunon content in liver mitochondria by 35% on the background of 2-fold decrease of oxidized ubiqiunon and preservation of reduced ubiqiunon amount has been estimated under the conditions of low-protein diet. Simultaneously the 5-fold decrease of liver content of tyrosine - the ubiqiunon precursor - has been observed. It has been shown, that under the conditions of acetaminophen-induced hepatitis the content of total ubiqiunon and its redox forms in the liver mitochondria of rats fed complete diet didn't change significantly comparing to control. A decrease of total ubiqiunon by 60% on the background of acute (18-fold) decrease of reduced ubiqiunon in liver mitochondria of rats with hepatitis, fed low-protein diet, has been observed. Established changes of the content of redox ubiquinone forms (a key component of the oxidative phosphorylation system in the liver mitochondria) can be considered as one of the mechanisms of malfunction of energy biotransformation system under the conditions of toxic liver injury in animals with protein deficiency.
Keywords: protein deficiency, toxic hepatitis, ubiqiunon, rats
В настоящее время активно формируются представления о биохимических механизмах и роли дисбаланса системы биотрансформации энергии в условиях дефицита ряда нутриентов [10, 14]. В то же время сведения о биохимических механизмах нарушения клеточной энергетики при белковой недостаточности и индуцированном в этих условиях токсическом повреждении печени в литературе практически отсутствуют. Ранее нами было показано, что в реализации изменений в митохон-дриальной системе биотрансформации энергии в условиях алиментарной белковой недостаточности лежат нарушения на уровне комплекса I дыхательной цепи [2]. Коферментом комплекса I является убихинон: в составе фермента обнаружены, по крайней мере, 2 типа прочно связанного убисемихинона [3]. Убихинон (коэнзим Q, CoQ)
является единственным жирорастворимым окислительно-восстановительным соединением, синтезируемым во всех аэробных организмах и имеющим исключительное значение для синтеза АТФ в процессе окислительного фосфорилирования [9]. Убихинон обеспечивает транспорт электронов от митохондриальных комплексов I и II к цитохромно-му участку дыхательной цепи [18]. Кроме того, CoQ является акцептором электронов от нескольких дегидрогеназ, в том числе ферментов р-окис-ления жирных кислот и синтеза пиримидиновых нуклеотидов [11, 13], а также он проявляет анти-оксидантную активность [6]. Учитывая ключевую роль убихинона в биоэнергетических процессах, а также формирование энергетического дисбаланса у белок-дефицитных крыс в условиях токсического повреждения печени [5], целью работы было
83
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
#
изучение изменения количественного содержания общего убихинона, а также его редокс-форм в митохондриях печени крыс как одного из возможных механизмов нарушения работы системы биотрансформации энергии.
Материал и методы
Исследования проводили на белых нелинейных крысах (n=36) с массой тела 90-100 г и возрастом 2-2,5 мес. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Крыс содержали по одной в пластмассовых клеток с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.
Животные были разделены на 4 группы по 9 особей в каждой: 1-я - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе (К); 2-я - крысы, содержащиеся на низкобелковом рационе (НБР); 3-я - крысы с острым ацетамино-фен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе (Г); 4-я - крысы с ацета-минофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях белковой недостаточности (НБР+Г). Животные 1-й, контрольной, группы и 3-й группы получали рацион, содержащий 14% белка (в виде казеина), 10% жиров, 76% углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [2, 17]. Содержание витаминов в 1 кг рациона составляло: В1 (тиамина гидрохлорид) - 5 мг, В2 (рибофлавин) - 6 мг, В6 (пиридоксина гидрохлорид) - 6 мг, ниацин - 30 мг,
«
К
НБР
Г
НБР + Г
кальция пантотенат - 15 мг, фолиевая кислота -2 мг, d-биотин - 0,2 мг, В12 (цианокобаламин) -25 мкг, А (пальмитат ретинола) - 4000 МЕ, Е (ацетат а-токоферола) - 75 МЕ, D3 (холекальциферол) -1000 ME, K (менадион) - 75 мкг. Состав солевой смеси (г/кг микса): натрия хлорид - 139,3 г, калия монофосфат - 388,8 г, магния сульфат - 57,4 г, кальция карбонат - 380,4 г, железа сульфат - 26,4 г, калия йодид - 0,77 г, марганца сульфат - 4,55 г, цинка сульфат - 0,53 г, меди сульфат - 0,48 г, кобальта хлорид - 0,024 г, натрия фторид - 0,5 г, алюмокалие-вые квасцы - 0,11 г (35 г микса/кг рациона).
Животные 2-й и 4-й групп получали изоэнерге-тический рацион, включающий 4,7% белка, 10% жиров и 85,3% углеводов. Энергетическая ценность рациона составляла 3601,0 ккал/кг.
После 4-недельного содержания крыс на экспериментальной диете моделирование ацетами-нофен-индуцированного гепатита животным 3-й и 4-й групп осуществляли путем введения per os ацетаминофена в дозе 1 г на 1 кг массы тела животных в 2% крахмальной взвеси на протяжении 2 дней с помощью специального зонда [1].
Цервикальную дислокацию крыс под легким эфирным наркозом осуществляли на 31-е сутки эксперимента.
Выделение митохондриальной фракции из гомогената печени проводили с помощью метода дифференциального центрифугирования при 0-3 °С [19]. Убихинон из митохондриальной фракции выделяли методом быстрой экстракции смесью гептан:метанол в соотношении 1:1 [15]. Содержание общего и окисленного убихинона определяли спектрофотометрически при Л=275 нм (коэфициент молярной экстинкции убихинона 12,25 Мм-1хсм-1). Содержание восстановленного убихинона определяли по разнице уровня общего и окисленного убихинона. Содержание редокс-форм убихинона выражали в мкмоль/мг белка митохондрий. Определение тирозина в депротеинизированных 6% сульфосалициловой кислотой экстрактах ткани печени проводили на автоматическом анализаторе аминокислот Т-339 («Mikrotechna», Чехия).
Определение содержания белка осуществляли по методу Лоури [12].
Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных Statistica 6.0.
Рис. 1. Содержание общего убихинона в митохондриях печени при токсическом гепатите, индуцированном на фоне алиментарной белковой недостаточности
Здесь и на рис. 2-3: * - достоверное отличие (р<0,05) от показателя контрольных животных; ** - достоверное отличие (р<0,05) от показателя животных с токсическим гепатитом, содержащихся на полноценном рационе (р<0,05). Расшифровку аббревиатур см. в тексте.
Результаты и обсуждение
Результаты исследований показали, что в митохондриях печени животных, содержащихся на низкобелковой диете, наблюдается снижение содержания общего убихинона на 35% (рис. 1), что свидетельствует о нарушении работы системы
84
4
3
2
1
0
#
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук
биотрансформации энергии в условиях белковой недостаточности и развитии энергодефицитного состояния. Ранее было показано [7], что при снижении содержания убихинона на 25% наблюдается нарушение энергетического метаболизма, а снижение уровня убихинона на 75% сопровождается гибелью клеток. Одной из причин установленного нами факта, вероятно, может быть нарушение синтеза убихинона в условиях белковой недостаточности, учитывая, что его предшественником является аминокислота тирозин [4], и именно внутриклеточный синтез - основной источник коэн-зима Q10 [8, 16, 20]. Действительно, результаты хроматографического определения содержания тирозина в ткани печени показали его снижение в 5 раз по сравнению с контролем (рис. 2). Следует также отметить, что в митохондриях печени крыс, содержащихся в условиях белковой недостаточности, наблюдается перераспределение редокс-форм убихинона. Результаты исследований показали, что снижение содержания общего убихинона в митохондриях печени крыс, содержащихся на низкобелковом рационе, сопровождается двукратным снижением содержания окисленного уби-хинона (рис. 3а) на фоне сохранения количества восстановленного убихинона (рис. 3б).
Интересным оказался факт, что в условиях ацет-аминофен-индуцированного гепатита уровень общего убихинона (см. рис. 1) и содержание окисленной (см. рис. 3а) и восстановленной (см. рис. 3б) формы CoQ в митохондриях печени крыс, находящихся на полноценном сбалансированном рационе, достоверно не отличается от контроля. В то же время в митохондриях печени крыс с гепатитом, содержащихся на низкопротеиновом рационе, наблюдается снижение общего убихинона на 60% (см. рис. 1) по сравнению с контролем и на 35% по сравнению с белок-дефицитными животными, что свидетельствует о критическом снижении рабо-
2520г =
сз
- 15-
ё 10-
5
Г1-!
ц
К
НБР
Г
НБР + Г
Рис. 2. Содержание тирозина в печени при токсическом гепатите, индуцированном на фоне алиментарной белковой недостаточности
ты биотрансформации энергии в клетках печени в исследуемых экспериментальных условиях. При этом у белок-дефицитных крыс с ацетаминофен-индуцированным гепатитом наблюдается снижение содержания окисленного убихинона на 40% (см. рис. 3а) на фоне снижение содержания восстановленного убихинона в 18 раз (см. рис. 3б) по сравнению с показателями полноценно питающихся животных с токсическим повреждением печени. Учитывая роль восстановленного убихинона в обеспечении функциональной активности дыхательной цепи митохондрий, установленное нами снижение содержания восстановленного убихино-на будет сопровождаться нарушением передачи электронов от убихинона к цитохромному участку дыхательной цепи и может рассматриваться как один из механизмов нарушения работы системы энергообеспечения в исследуемых условиях.
Итак, нехватка белка в рационе крыс с ацет-аминофен-индуцированным гепатитом определяет изменения содержания убихинона в печени, что
4-г
3,5-
3-
ак
кл е 2,5-
б
2-
ло м 1,5-
к
м 1--
0,5-
0-
2,5
НБР
НБР + Г
1,51
0,5 0
НБР
НБР + Г
Рис. 3. Содержание окисленного (а) и восстановленного (б) убихинона в митохондриях печени при токсическом гепатите, индуцированном на фоне алиментарной белковой недостаточности
85
0
2
К
Г
Г
К
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
проявляется снижением общего убихинона на 60% на фоне снижения содержания окисленного убихинона на 40%, а восстановленного убихинона -в 18 раз. Изменения в митохондриях печени крыс уровня редокс-форм убихинона - ключевого компонента системы окислительного фосфорилирова-ния - можно рассматривать как звено механизма нарушения работы системы биотрансформации энергии в условиях токсического повреждения
печени, вызванного у белок-дефицитных животных. Результаты наших исследований открывают перспективы для дальнейшего изучения целесообразности коррекции энергетического дисбаланса путем введения экзогенного убихинона либо его предшественников в рацион организмов с признаками белковой недостаточности с целью устранения последствий нарушения энергетического обмена.
Сведения об авторах
Волощук Оксана Николаевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича (Украина) E-mail: oxbm@mail.ru
Копыльчук Галина Петровна - доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича (Украина) E-mail: kopilchuk@gmail.com
Литература
#
1. Волощук О.Н., Копыльчук Г.П., Бучковская И.М. Активность маркерных ферментов печени при токсическом гепатите в условиях алиментарной депривации протеина // Экспер. и клин. гастроен-терол. 2014. Т. 108, № 8. С. 96-100.
2. Волощук О.Н., Копыльчук Г.П., Кадайская Т.Г. Состояние системы энергообеспечения митохондрий печени в условиях алиментарной депривации протеина // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 12-16.
3. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Митохондриальный Комплекс I // Успехи биол. химии. 2003. T. 43. C. 19-58.
4. Ключников С.О., Гнетнева Е.С. Убихинон (коэнзим Q10): теория и клиническая практика // Педиатрия. 2008. Т. 87, № 3. С. 103-110.
5. Копильчук Г.П., Волощук О.М. Актившсть ^ЭН^хшонредук-тази та сукцинатдепдрогенази в клтнах печшки щурiв за умов токсичного гепатиту, шдукованого ацетамшофеном на фон алiментарноí нестачi протешу // Укр. б^м. журн. 2015. Т. 87, № 1. С. 20-25.
6. Кучменко Е.Б., Петухов Д.Н., Донченко Г.В., Мхитарян Л.С. и др. Влияние комплексов предшественников и модуляторов биосинтеза кофермента Q на функциональное состояние митохондрий сердца старых крыс // Биомед. химия. 2010. Vol. 56, вып. 2. C. 244-256.
7. Убихинон композитум - комплексный энергетический биостимулятор клеточного метаболизма // Биол. терапия. 2009. № 2. C. 42-44. URL: www.uabm.org/images/journal/BT_2_2009.pdf
8. Crane F.L. Discovery of ubiquinone (coenzyme Q) and an overview of function // Mitochondrion. 2007. Vol. 7, suppl. P. S2-S7.
9. Fernandez-Ayala D.J.M., Jimenez-Gancedo S., Guerra I., Navas P. Invertebrate models for coenzyme Q10 deficiency // Mol. Syndro-mol. 2014. Vol. 5, N 3-4. P. 170-179.
10. Huskisson E., Maggini S., Ruf M. The role of vitamins and minerals in energy metabolism and well-being // J. Int. Med. Res. 2007. Vol. 35, N 3. P. 277-289.
11. Lopez-Lluch G., Rodriguez-Aguilera J.C., Santos-Ocana C., Navas P. Is coenzyme Q a key factor in aging? // Mech. Ageing Dev. 2010. Vol. 131, N 4. P. 225-235.
12. Lowry O.H., Rosenbrough M.J., Farr A.L., Rendal R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, N 1. P. 265-275.
13. Nowicka B., Kruk J. Occurrence, biosynthesis and function of iso-prenoid quinones // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1797, N 9. P. 1587-1605.
14. Pieczenik S.R., Neustadt J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease // Exp. Mol. Pathol. 2007. Vol. 83. P. 84-92.
15. Pumphrey A.M., Redfearn E.R. A method for determining the concentration of ubiquinone in mitochondrial preparations // Biochem. J. 1960. Vol. 76. P. 61-64.
16. Quinzii C.M., Hirano M. Coenzyme Q and mitochondrial disease // Res. Rev. 2010. Vol. 16. P. 183-188.
17. Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. 1993. Vol. 123, N 11. P. 1939-1951.
18. Turunena M., Olsson J., Dallner G. Metabolism and function of coen-zyme Q // Biochim. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1660. P. 171-199.
19. Voloshchuk O.N., Marchenko M.M. Effects of low-dose radiation on glutamate dehydrogenase activity in tissues of rats with transplanted Guerin's carcinoma // Bull. Experim. Biol. Med. 2013. Vol. 156, N 1. P. 91--93.
20. Wangand Y., Hekimi S. Molecular genetics of ubiquinone biosynthesis in animals // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2013. Vol. 48, N 1. P. 69-88.
References
Voloshchuk O.N., Kopylchuk G.P., Buchkovskaia I.M. Activity of the marker liver enzymes under the conditions of toxic hepatitis and alimentary deprivation of protein. Eksperementalnaia i Klinicheskaia Gastroenterologia [...]. 2014; Vol. 108 (8): 96-100. (in Russian)
Voloshchuk O.N., Kopylchuk G.P., Kadayskaia T.G. State of the energy-supply system of the liver mitochondria under the conditions of alimentary deficiency of protein. Vopr Pitan [Problems of Nutrition]. 2014; Vol. 83 (3): 12-6. (in Russian)
86
2
O.H. Bono^yK, r.n. KonbrnbnyK
10.
Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. Mitochondrial complex I. Uspe- 12. khi Biol Khimii. 2003; Vol. 43: 19-58. (in Russian) Kliuchnikov S.O., Gnetneva Ye. Ubiqiunon (koenzyme Q10): theory and clinical practice. Pediatry. 2008; Vol. 87 (3): 103-10. (in Russian) 13. Kopylchuk G.P., Voloshchuk O.N. NADH-dehydrogenase activity and succinate dehydrogenase in liver cells of rats in the toxic hepatitis induced on the background of protein deficiency. Ukr Biohim J. 2015; 14. Vol. 87 (1): 20-5. (in Ukrainian)
Kuchmenko Ye.B., Petukhov D.N., Donchenko G.V., Mhitarian L.S. 15. et al. Influence of the complexes of precursors and biosynthesis modulators of koenzyme Q on the functional state of heart mitochondria of old rats. Biomed Chemistry. 2010; Vol. 56 (2): 244-56. (in Russian) 16. Ubiqiunon compositum - complex energetic biostimulator of cell metabolism. Biological Therapy. 2009; N 2: 42-4. URL: www.uabm. 17. org/images/journal/BT_2_2009.pdf
Crane F.L. Discovery of ubiquinone (coenzyme Q) and an overview of function. Mitochondrion. 2007; Vol. 7, suppl.: S2-7. Fernandez-Ayala D.J.M., Jimenez-Gancedo S., Guerra I., Navas P. 18. Invertebrate models for coenzyme Q10 deficiency. Mol Syndromol. 2014; Vol. 5 (3-4): 170-9. 19.
Huskisson E., Maggini S., Ruf M. The role of vitamins and minerals in energy metabolism and well-being. J Int Med Res. 2007; Vol. 35 (3): 277-89.
Lopez-Lluch G., Rodriguez-Aguilera J.C., Santos-Ocana C., Navas 20. P. Is coenzyme Q a key factor in aging? Mech Ageing Dev. 2010; Vol. 131 (4): 225-35.
Lowry O.H., Rosenbrough M.J., Farr A.L., Rendal R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951; Vol. 193 (1): 265-75.
Nowicka B., Kruk J. Occurrence, biosynthesis and function of isoprenoid quinones. Biochim Biophys Acta. 2010; Vol. 1797 (9): 1587-605.
Pieczenik S.R., Neustadt J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp Mol Pathol. 2007; Vol. 83: 84-92. Pumphrey A.M., Redfearn E.R. A method for determining the concentration of ubiquinone in mitochondrial preparations .Biochem J. 1960; Vol. 76: 61-4.
Quinzii C.M., Hirano M. Coenzyme Q and mitochondrial disease. Res Rev. 2010; Vol. 16: 183-8.
Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr. 1993; Vol. 123 (11): 1939-51.
Turunena M., Olsson J., Dallner G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochim Biophys Acta. 2004; Vol. 1660: 171-199. Voloshchuk O.N., Marchenko M.M. Effects of low-dose radiation on glutamate dehydrogenase activity in tissues of rats with transplanted Guerin's carcinoma. Bull Experim Biol Med. 2013; Vol. 156 (1): 91-3.
Wangand Y., Hekimi S. Molecular genetics of ubiquinone biosynthesis in animals. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2013; Vol. 48 (1): 69-88.
87
3.
5
7
8
9
