CC BY
67
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Волощук Оксана Николаевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича
Адрес: 58000, Украина, г. Черновцы, ул. М. Коцюбинского, д. 2 Телефон: (0373) 58-48-38 E-mail: [email protected]
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук, Т.Г. Кадайская
Состояние системы энергообеспечения митохондрий печени крыс при алиментарной белковой недостаточности
#
State of the energy-supply system of the liver mitochondria under the conditions of alimentary deficiency of protein
O.N. Voloshchuk, G.P. Kopylchuk, T.G. Kadayskaya
Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича, Украина Institute of Biology, Chemistry and Bioresources of Chernovtsi national university named after Yu. Fedkovych, Ukraine
В работе исследована ЫАБИ-дегидрогеназная и сукцинатдегидрогеназ-ная активность митохондрий печени крыс в условиях алиментарной белковой недостаточности. Исследования проведены на 65 белых нелинейных крысах, разделенных в зависимости от количества белка в рационе на 3 группы: 1-я - крысы, содержащиеся на низкобелковой диете (7% белка в виде казеина, 10% жиров и 83% углеводов; п=26); 2-я - крысы, содержащиеся на безбелковой диете (п=26); 3-я - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе (14% белка, 10% жиров, 76% углеводов, п=13). ЫАБИ-дегидрогеназную активность определяли спектрофотометрически, сукцинатдегидрогеназную активность -по интенсивности восстановления феррицианида калия. Установлено, что в условиях безбелкового рациона снижение ЫАБИ-дегидрогеназной активности митохондрий печени крыс наблюдается на 14-е сутки, при этом 4-недельное содержание крыс в указанных условиях приводит к снижению исследуемой ферментативной активности в 5,5раза по сравнению с показателями контрольной группы животных (0,506±0,040 нм ЫАБИ/мин на 1 мг белка) и в 3 раза по сравнению с показателями, полученными на предыдущей стадии эксперимента. В то же время при частичной белковой недостаточности снижение активности ЫАБИ-дегидрогеназы митохондрий печени в 2 раза наблюдается только на 28-е сутки эксперимента. Показано, что в условиях 2-недель-ного содержания крыс на безбелковой диете активность сукцинатде-гидрогеназы по сравнению с контролем (3,880 нмоль сукцината/мин на 1 мг белка) достоверно не изменяется, при этом 4-недельное содержание животных как на безбелковом, так и на низкобелковом рационе приводит к снижению сукцинатдегидрогеназной активности. При этом если в условиях низкопротеиновой диеты сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий печени снижается вдвое, то в условиях отсутствия белка в рационе - втрое. Сделан вывод, что в реализации изменений в системе биотрансформации энергии в митохондриях
12
#
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук, Т.Г. Кадайская
в условиях алиментарной белковой недостаточности в первую очередь лежат нарушения на уровне Комплекса I дыхательной цепи. Ключевые слова: NADH-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, алиментарная белковая недостаточность, печень
The NADH-dehydrogenase and succinate dehydrogenase activity of the rats' liver mitochondria under the conditions of alimentary deprivation of protein has been studied. Research was carried out on 65 white non-linear rats divided according to the diet protein content into three groups: 1 - rats fed a hypoprotein diet (7% of protein, 10% of fat и 83% of carbphydrates; n=26); 2 - rats fed a protein-free diet (n=26); 3 - rats fed a complete semi-synthetic ration (14% of protein, 10% of fat и 76% of carbphydrates; n=13). The NADH-dehy-drogenase activity was estimated by spectrophotometry method, succinate dehydrogenase activity - by the intensity of reduction of the potassium fer-ricyanide. It has been estimated that the decrease of NADH-dehydrogenase activity of mitochondria occurred on the 14th day of feeding rats with protein-free diet, and four-week feeding of rats under these conditions lead to the decrease of enzyme activity by 5,5 fold compared with the control group (0,506±0,040 nmol NADH/min/mg of protein) and by 3,0 fold compared with the previous stage of the experiment. At the same time a hypoprotein diet caused 2-fold decrease of NADH-dehydrogenase activity of liver mitochondria only on the 28th day. It has been shown that the succinate dehydrogenase activity didn't change significantly after two-week maintenance of rats on a protein-free diet as compared with control, while the four-week maintenance on both hypoprotein and protein-free diet lead to the decrease of the succinate dehydrogenase activity. Specifically, under the conditions of the hypoprotein diet succinate dehydrogenase activity of liver mitochondria decreased twofold and under the conditions of the protein free diet - threefold. Probably, the disorders at the level of Complex I of respiratory chain underlie the realization of the changes in the system of energy biotransformation in mitochondria under the conditions of alimentary protein deficiency.
Key words: NADH-dehydrogenase, succinate dehydrogenase, alimentary protein deprivation, liver
В условиях ограниченного поступления белка метаболическая адаптация направлена на обеспечение органов и тканей организма структурными субстратами и энергией за счет утилизации собственных запасов [5]. При этом алиментарная белковая недостаточность сопровождается дисрегуляторными изменениями в системе «анаболизм-катаболизм», развитием патологической толерантности тканей к нутриентам и одновременным ростом энергозатрат [1, 2]. Состояние энергообеспечения клеток в первую очередь определяется эффективностью работы дыхательной цепи митохондрий, трансформирующей энергию окисления субстратов дыхания кислородом в форму трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране [11].
В литературе показано, что в условиях низкобелкового питания наблюдается снижение эффективности окислительного фосфорилирования [13], однако причины не рассматриваются. Предполагается, что уменьшение активности ферментов
дыхательной цепи может быть связано с нарушением синтеза восстановленных эквивалентов в цикле Кребса [15]. Снижение эффективности окислительного фосфорилирования у потомков самок, содержавшихся в условиях низкобелкового рациона, связывают с изменениями на уровне мтДНК, кодирующей субъединицы ферментов дыхательной цепи [7, 14]. В то же время в литературе нет систематизированных данных о биохимических механизмах нарушения клеточной энергетики при белковой недостаточности. Для рассмотрения причин изменений в системе энергообеспечения клеток в условиях алиментарной депривации протеина актуально определение звеньев, лимитирующих ее возможности. Учитывая, что сукцинатдегидрогеназа и NADH-дегидрогеназа являются маркерными ферментами эффективности функционирования системы биотрансформации энергии [6], целью нашей работы было изучение NADH-дегидрогена-зной и сукцинатдегидрогеназной активности митохондрий печени крыс в условиях алиментарной белковой недостаточности.
13
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ
#
Материал и методы
Исследования проводили на белых нелинейных крысах (n=65) с массой тела 90-100 г в возрасте 2-2,5 мес. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Крыс содержали по одной в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.
В зависимости от количества белка в рационе были сформированы 3 группы животных: 1-я -крысы, содержащиеся на низкопротеиновой диете (1/2К); 2-я - крысы, содержащиеся на безбелковой диете (-К); 3-я - крысы, содержащиеся на полноценном полусинтетическом рационе (К). Животные 1-й группы (n=26) получали рацион, включающий 7% белка (в виде казеина), 10% жиров и 83% углеводов. Животные 2-й группы (n=26) получали полусинтетический безбелковый рацион. Животные 3-й, контрольной, группы (n=13) получали рацион, содержащий 14% белка, 10% жиров, 76% углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [10]. Энергетическая ценность рациона составляла 3601,0 ккал/кг.
Длительность эксперимента составляла 28 сут. Цервикальную дислокацию крыс (по 13 животных каждой опытной группы) под легким эфирным наркозом осуществляли на 14-е и 28-е сутки эксперимента.
Выделение митохондриальной фракции из гомогената печени проводили с помощью метода дифференциального центрифугирования при 0-3 °С [4]. NADH-дегидрогеназную активность определяли спектрофотометрически [12] (коэф-ициент молярной экстинкции 6,22х103 М-1хсм-1). Сукцинатдегидрогеназную активность выявляли по интенсивности восстановления феррицианида калия [4]. Содержание белка определяли по методу Лоури [8].
Статистическую значимость полученных результатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы обработки статистических данных Statistics 6.0.
Результаты и обсуждение
Результаты исследований показали, что в группе животных, содержавшихся на безбелковом рационе, уже на 14-е сутки эксперимента достоверно снижалась NADH-дегидрогеназная активность в митохондриальной фракции печени по сравнению с показателями контрольной группы (рис. 1). 4-недельное содержание крыс на безбелковом
рационе приводило к снижению исследуемой ферментативной активности в 5,5 раза по сравнению с показателями контрольной группы и в 3 раза по сравнению с показателями, полученными на предыдущей стадии эксперимента. Таким образом, в условиях безбелкового рациона торможение активности NADH-дегидрогена-зы митохондрий печени крыс наблюдается уже на начальных этапах эксперимента. Причиной установленного факта, с одной стороны, может быть снижение поступления восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь, а с другой -ингибирование ферментативной активности Комплекса I электронтранспортной цепи митохондрий в данных экспериментальных условиях. В то же время в группе животных, содержавшихся на низкобелковой диете, на 14-е сутки эксперимента наблюдалась активация NADH-дегидроге-назы с тенденцией к торможению на 28-е сутки (см. рис. 1). Вероятно, в условиях 2-недельной белковой недостаточности наблюдается усиление потоков электронов и протонов через Комплекс I дыхательной цепи как следствие интенсификации катаболических процессов в организме экспериментальных животных, направленных на удовлетворение энергетических и пластических потребностей организма [3].
Итак, если в условиях безбелкового питания торможение NADH-дегидрогеназной активности наблюдалась уже на 14-е сутки эксперимента, то белковая недостаточность сопровождается нарушением функционирования NADH-дегидро-геназы митохондрий печени только на 28-е сутки исследований. Снижение NADH-дегидрогеназной активности может свидетельствовать о нарушении окисления NADH-зависимых субстратов в дыхательной цепи митохондрий с последующим дисбалансом работы системы биотрансформации энергии.
Посредником между FAD-зависимыми субстратами и дыхательной цепью является Комплекс II, ключевой фермент которого сукцинатдегидро-геназа [9]. Результаты исследования показали, что в обеих экспериментальных группах животных на 14-е сутки эксперимента активность сукцинатдегидрогеназы по сравнению с контролем достоверно не изменялась (рис. 2). Вероятно, в условиях установленного нами снижения NADH-дегидрогеназной активности в указанный экспериментальный период в группе животных, содержащихся на безбелковом рационе, сохранение сукцинатдегидрогеназной активности на уровне контрольных значений определяет поддержку энергообеспечения митохондрий клеток печени. В то же время 4-недельное содержание животных на экспериментальной диете приводило к достоверному снижению сукцинатдегидрогеназной активнос-
14
#
О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук, Т.Г. Кадайская
ти в обеих группах животных. При этом если в условиях низкобелковой диеты сукцинатде-гидрогеназная активность митохондрий печени снижается вдвое, то в митохондриальной фракции печени крыс в условиях отсутствия белка в рационе наблюдается снижение активности сукцинатдегидрогеназы в 3 раза. Снижение сукцинатдегидрогеназной активности только в условиях длительной алиментарной деприва-ции протеина можно рассматривать как компенсаторный механизм, направленный на поддержку энергообеспечения в условиях повышенной потребности в энергии.
Таким образом, в условиях 4-недельной недостаточности или отсутствия белка в рационе наблюдается снижение как NADH-дегидрогеназной, так и сукцинатдегидрогеназной активности, что может приводить к нарушению энергозависимых процессов в клетках печени. В то же время полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в реализации изменений в системе биотрансформации энергии в митохондриях в условиях алиментарной белковой недостаточности в первую очередь, по-видимому, лежат нарушения на уровне Комплекса I дыхательной цепи, что открывает новые перспективы для поиска критических участков в его работе. Результаты исследований могут стать базовыми для понимания биохимических механизмов метаболического ответа клеток на алиментарную белковую недостаточность и биохимического обоснования терапевтических подходов к коррекции и устранению последствий нарушения энергетического обмена при белковой недостаточности.
я 0,6
а 0,3
5 0,1
14
Сутки
28
Рис. 1. МЭН-дегидрогеназная активность митохондрий печени крыс, получавших разное количество белка с рационом
Здесь и на рис. 2: * - достоверное различие по сравнению с предыдущей стадией эксперимента; ** - достоверное различие по сравнению с контрольной группой.
4,5 4
3,5 3
2,5 2
1,5 1
0,5 0
14
Сутки
28
Рис. 2. Сукцинатдегидрогеназная активность митохондрий печени крыс в условиях алиментарной депривации протеина
Сведения об авторах
Волощук Оксана Николаевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича (Украина) E-mail: [email protected]
Копыльчук Галина Петровна - доктор биологических наук, професор, заведующая кафедрой биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича (Украина) E-mail: [email protected]
Кадайская Татьяна Геннадиевна - студентка 5-го курса кафедры биохимии и биотехнологии Института биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича (Украина) E-mail: [email protected]
Литература
Антонов А.Р., Баталова ЕЮ, Новоселов Я.Б., Начаров Ю.В. Особенности течения катаболического синдрома у лиц с пониженной массой тела на фоне функционального питания // Пат. физиол. - 2006. - Т. 7. - С. 427-434. Дундаров З.А, Майоров В.М. Основные проблемы проведения нутритивной поддержки у пациентов в критических состояниях // Новости хирургии. - 2009. - Т. 17, № 2. - С. 119-123.
Запорожченко Б.С., Муравйов П.Т., Горбунов А.А. Корек-фя бтково-енергетично! недостатност в комплексному хфурпчному лкуванш ускладненого гострого деструктивного панкреатиту // Xipypm. - 2011. - Т. 2, № 41. -С. 81-84.
Марченко М.М., Копильчук Г.П., Волощук О.М. Актив-шсть ферменлв енергозабезпечення карциноми Герена,
15
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ
#
10.
трансплантованоТ на фонi попереднього оnромiнення малими дозами // Допов^ НАН УкраТни. - 2011. - № 1. -С. 153-156.
Моцарь В.В., Никитина Н.В., Трофимова И.А. и др. Опыт 11. применения препарата "Иммунофлазид" при белково-энергетической недостаточности у детей раннего возраста // Совр. педиатрия. - 2011. - № 6(40). - С. 63-64. 12. Finel M, Skehel J.M., Albracht S.P.J. et al. Resolution of NADH:ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria into two subcomplexes, one of which contains the redox centers of the enzyme // Biochemistry. - 2000 - 13. Vol. 31, N 46. - P. 11425-11434.
Jia Y., Li R., Cong R. et al. Maternal low-protein diet affects epigenetic regulation of hepatic mitochondrial DNA transcription in a sex-specific manner in newborn piglets associated 14. with GR binding to its promoter // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, N 5. - P. e63855.
Lowry O.H., Rosenbrough M.J., Farr A.L., Rendal R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. - Vol. 193, N 1. - P. 265-275. 15.
Miles B. The electron Transport Chain // LSM. - 2003. -Vol. 2. - Р. 1-11.
Reeves P., Nielsen F., Fahey G. AIN-93 Purified Diets for Laboratory Rodents: Final Report of the American Institute
of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the Reformulation of the AIN-76A Rodent Diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. - P. 1939-1951.
Sangar V., Eddy A., Price N.D., Simeonidis E. Mechanistic modeling of aberrant energy metabolism in human disease // Front. Physiol. - 2012. - Vol. 3. - P. 404. Sharova I.V., Vekshin N.L. Rotenone-insensitive NADH oxydation in mitochondrial suspension occurs by NADH dehydrogenase of respiratory chain fragments // Biophysic. -2004. - Vol. 49, N 5. - P. 814-821. Tanakaa M., Ishibashia T., Toyomizua M. Time course of oxidative phosphorylation in liver mitochondria of chickens fed on high - protein diet // Br. Poult. Sci. - 1995. - Vol. 36, N 1. - P. 143-154.
Theys N., Bouckenooghe T., Ahn M.T. et al. Maternal low-protein diet alters pancreatic islet mitochondrial function in a sex-specific manner in the adult rat // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2009. - Vol. 297. -P. 1516-1525.
Tyzbir R.S., Kunin A.S., Sims N.M., Danforth E.Jr. Influence of diet composition on serum triiodothyronine concentration, hepatic mitochondrial metabolism and shuttle system activity in rats // J. Nutr. - 1981. - Vol. 111 (2). -P. 252-259.
16
