Особенности активности над(ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у детей и подростков с инсулинзависимым сахарным диабетом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© САВЧЕНКО А.А., КРЮКОВА Е.В., МАНЧУК В Т., ПАНФИЛОВА В.Н. -УДК 616.379-008.64-053.2:616.155.32

ОСОБЕННОСТИ АКТИВНОСТИ НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ С ИНСУЛИНЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

А.А. Савченко, Е.В. Крюкова, В.Т. Манчук, В.Н. Панфилова.

(Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск; директор - д.м.н., проф. В.Т. Манчук)

Резюме. Исследовались особенности активности метаболических ферментов в лимфоцитах крови у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (ИЗСД) и среди здоровых детей и подростков. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови определяли биолюминесцентным методом. Анализ полученных результатов показал, что выявленные нарушения в метаболизме лимфоцитов связаны с ингибированием начальных стадий гликолиза и окислительных реакций пентозофосфатного цикла, а также разнонаправленными изменениями активности дегидрогеназных реакций цикла трикарбоновых кислот, активации реакций анаболизма липидов и ингибировании ряда реакций аминокислотного обмена. В лимфоцитах крови больных ИЗСД снижается уровень антиоксидантной защиты, что дополнительно ухудшает физиологическое и функциональное состояние иммунокомпетентных клеток.

Инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) является одним из наиболее распространенных эндокринных заболеваний в детском возрасте с ранним развитием осложнений. Ежегодно число больных увеличивается на 5-7%, а каждые 12-15 лет - удваивается [1]. Ситуация осложняется тем, что заместительная терапия не останавливает прогрессирования данного патологического процесса. В связи с этим повышается актуальность углубленного изучения нарушения обмена веществ в динамике развития ИЗСД.

Известно, что причиной развития ИЗСД являются аутоиммунные реакции к р-клеткам островков Лангерганса поджелудочной железы [2]. Причем, основную роль в реализации данной аутоиммунной реакции играют лимфоциты. Между тем, лимфоциты являясь основными эффекторами иммунитета, имеют богатый набор рецепторов, через которые осуществляется регуляция их функциональной активности [3,15]. Разнообразие и выраженная интенсивность метаболических реакций в иммунокомпетентных клетках, четкая зависимость синтетических и энергетических процессов от гормонального статуса организма позволяет использовать лимфоциты периферической крови в качестве объекта исследования нарушения внутриклеточного обмена веществ при ИЗСД.

Таким образом, целью данного исследования явилось изучение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у детей и подростков с ИЗСД.

Материалы и методы

Обследовано 93 детей и подростков в возрасте от 7 до 17 лет с ИЗСД, находившихся на стационарном лечении в эндокринологических отделениях Краевой детской клинической больницы и Института медицинских проблем Севера СО РАМН. Группу контроля составили 99 здоровых детей и подростков в том же возрастном диапазоне.

Все дети получали человеческий рекомбинантный инсулин в дозе от 0,32 до 1,45 Ед/кг по интенсифицированной схеме. Степень компенсации за последние 3 месяца контролировали по уровню глико-зилированного гемоглобина (от 6,4 до 15,5 независимо от длительности заболевания). Все дети были осмотрены узкими специалистами для раннего выявления осложнений и сопутствующих заболеваний (окулист, невропатолог, кардиолог, ЛОР-врач, стоматолог, ортопед).

Выделение общей фракции лимфоцитов осуществляли по общепринятому методу в градиенте плотности фиколл-верографина с последующей очисткой от прилипающих клеток [8]. Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах проводили биолюминесцентным методом [6]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидро-

геназы (Г6ФДГ), прямой и обратной реакции лак-татдегидрогеназы (ЛДГ и Обр.ЛДГ), прямой и обратной реакции малатдегидрогеназы (МДГ и Обр.МДГ), прямой и обратной реакции НАД(Ф)-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и

Обр.НАДФГДГ), прямой и обратной реакции НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и Обр.НАДГДГ), НАД- и НАД(Ф)-зависимых изоцит-ратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глу-татионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1Е= =1 мкмоль/мин [7]) на 10.000 клеток.

Для всех полученных данных определяли среднее арифметическое значение (X) и ошибку средней арифметической (/и). Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение Обнаружено, что у детей и подростков с ИЗСД значительно снижена активность Г6ФДГ, ГЗФДГ, аэробной реакции ЛДГ, НАДИЦДГ, ГР, Обр.НАДГДГ и Обр.НАДФГДГ лимфоцитов, но повышен уровень МДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ, НАДФИЦДГ, анаэробной реакции ЛДГ и Обр.МДГ (табл.1).

Таблица 1 Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ (мкЕ) лимфоцитов крови у детей и

подростков с ИЗСД (Х±ш)

Показатели Здоровые N=99 ИЗСД N=93 Р

Г6ФДГ 6,87±0.71 0,02±0,002 <0,001

ГЗФДГ 0,81±0,13 0,01±0,001 <0,001

ЛДГ 18,13±2,14 6,03±0,85 <0,001

МДГ 45.79±4,62 119,06±23,23 <0,01

НАДФМДГ 7.01 ±0.94 9,12±0,82 <0,1

НАДФГДГ 0,34±0,06 0,77±0,14 <0,01

НАДГДГ 2,17±0.36 1,98±0,29

НАДИЦДГ 1,65±0,28 1,03±0,15 <0,1

НАДФИЦДГ 12,35±1,26 162,10±42,48 <0,001

Обр.ЛДГ 13,26±2,06 50,92±9,27 <0,001

Обр.МДГ 81,41x10,21 133,09±15,38 <0,01

ГР 7,76±0,88 3,54±0,70 <0,001

Обр.НАДГДГ 79,37±9,72 52,84±7,55 <0,05

Обр.НАДФГДГ 86,90± 10,21 36,66±4,35 <0,001

Исследуемые НАД(Ф)-зависимые дегидрогеназы находятся на разных метаболических путях лимфоцитов, следовательно, по их активности можно судить об особенностях различных сторон внутриклеточного обмена веществ при данной патологии. Так, Г6ФДГ является инициализирующим и ключевым ферментом пентозофосфатного пути, конечные продукты которого (НАДФН и рибозо-5-фосфат) участвуют во многих реакциях макромолекулярного синтеза [4,14]. Снижение активности данного метаболического фермента в лимфоцитах больных ИЗСД предполагает пониженную наработку указанных интермедиатов. Естественно, что интеграционные процессы клеточного метаболизма позволяют компенсировать отдельные звенья, функционирование которых по разным причинам не достаточно для поддержания оптимального уровня жизнедеятельности клетки. В частности, активность НАДФМДГ в лимфоцитах больных детей повышена. Малик-фермент

восстанавливает НАДФ до НАДФН и является ключевым в анаболических реакциях липидного обмена [7,12]. Причем повышение активности НАДФМДГ проявляется вместе с понижением уровня ГЗФДГ-фермента, участвующего в реакциях катаболизма липидов и осуществляющего перенос продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза

[9,11]. Следовательно, в иммунокомпетентных клетках детей и подростков с ИЗСД процессы анаболизма липидов преобладают над их распадом. При снижении активности ГЗФДГ и, соответственно, стимуляции гликолиза продуктами липидного обмена, можно предположить, что имеется снижение субстратного потока по гликолизу, то есть - ингибирование анаэробного дыхания клеток. Однако выраженное увеличение активности анаэробной реакции ЛДГ и Обр.МДГ позволяет предположить существенный синтез восстановленных пиридиннуклеотидов, который в цитоплазматическом компартменте осуществляется преимущественно в реакциях гликолиза.

Следствием предположения о высокой интенсивности гликолиза является вопрос о субстратном источнике, стимулирующем анаэробные процессы в иммунокомпетентных клетках больных ИЗСД. При ИЗСД активизируется альдозоредук-тазный путь окисления глюкозы. Это приводит к ингибированию начальных реакций гликолиза, полному исключению из регуляторного контроля фосфофруктокиназы (ключевого фермента гликолиза) и активации окислительно-восстановитель-ных реакций терминального участка гликолиза [5]. Данное предположение подтверждается снижением активности Г6ФДГ (так как при ингибировании гексокиназы понижается синтез глюкозоб-фосфата) и активацией обратных реакций ЛДГ и МДГ.

Ингибирование окислительных реакций пентозофосфатного цикла в лимфоцитах больных ИЗСД может привести не только к снижению ряда пластических процессов. Известно, что глутатионовая система антиоксидантной защиты тесно взаимосвязана с Г6ФДГ [14]. Поэтому неудивительно, что в лимфоцитах крови при ИЗСД снижается не только Г6ФДГ, но и ГР. Участвует ГР не только в антиоксидантных процессах. Глутатион является одним из важнейших интермедиатов синтеза цис-теина, недостаток которого в иммунокомпетентных клетках приводит к развитию иммунодефи-цитных состояний.

В иммунокомпетентных клетках детей и подростков с ИЗСД выявляются изменения активности не только ферментов цитоплазматического, но и митохондриального компартмента. Однако изменение активности исследуемых оксидоредуктаз цикла трикарбоновых кислот не однонаправлено: повышение активности МДГ и снижение уровня НАДИЦДГ. По-видимому, активация, так же как и ингибирование, субстратного потока по циклу Кребса происходит только на отдельных его участках. Действительно, снижение активности

НАДИЦДГ, отсутствие изменения уровня НАДГДГ в лимфоцитах больных ИЗСД сочетается с активацией НАДФИЦДГ и НАДФГДГ. Данные ферменты определяется как вспомогательные дегидрогеназы лимонного цикла и активируются при снижении НАД-зависимых реакций [7]. Необходимо отметить, что активация МДГ приводит к увеличению синтеза оксалоацетата (ингибитора сукцинатдегидрогеназы), который медленно утилизируется с помощью цитрате и нтазы. В связи с этим, для ускорения регенерации инициализирующих субстратов для лимонного цикла большое значение имеют шунтирующие реакции. Как уже отмечалось, в лимфоцитах больных ИЗСД увеличена активность Обр.МДГ и НАДФМДГ. Первый фермент является ключевым в реакциях малат-аспартатного шунта и переносит синтезированный в митохондриях оксалоацетат в цитоплазму клеток [4,10]. Малик-фермент шунтирует цитратсин-тазную реакцию и окисляет малат до пирувата [7], что позволяет регенерировать начальные субстраты для цикла трикарбоновых кислот. Кроме того, стимулирующий вклад в субстратный поток по циклу Кребса вносит НАДФГДГ. Данный фермент за счет окислительного дезаминирования глутаминовой кислоты осуществляет поступление продуктов аминокислотного обмена в цикл трикарбоновых кислот [7,13].

Однако выявленные нарушения в реакциях лимонного цикла лимфоцитов детей и подростков

с ИЗСД могут привести не только к снижению энергетических процессов в клетках, но и к нарушениям в аминокислотном обмене. Так, снижение активности НАДИЦДГ и, соответственно, понижение синтеза 2-оксоглутарата, по-видимому, и определяет ингибирование Обр.НАДГДГ и Обр. НАДФГДГ, которые участвуют в обменных реакциях при синтезе ряда аминокислот [13].

Таким образом, у детей и подростков с ИЗСД выявляются выраженные нарушения в метаболизме иммунокомпетентных клеток крови, которые определяются изменениями гормонального статуса организма. Выявленные нарушения в метаболизме лимфоцитов, прежде всего, связаны с ингибированием начальных стадий гликолиза и окислительных реакций пентозофосфатного цикла, а также разнонаправленными изменениями активности дегидрогеназных реакций цикла трикарбоновых кислот. Однако, изменения активности ряда дегидрогеназных реакций митохондриального компартмента являются, вероятно, определяющими в активации реакций анаболизма липидов и ингибировании ряда реакций аминокислотного обмена. Кроме того, в лимфоцитах крови больных ИЗСД снижается, также, уровень антиоксидант-ной защиты, что дополнительно ухудшает физиологическое и, следовательно, функциональное состояние иммунокомпетентных клеток.

THE PECULARITIES OF NAD(P)-DEPENDENT DEHIDROGENASE ACTIVITIES IN BLOOD LYMPHOCYTES OF CHILDREN AND ADOLESCENTS WITH INSULIN-DEPENDENT DIABETES

MELLITUS

A.A. Savchenko, E.V. Krukova, V.T. Manchuk, V.N. Panfilova (Institute for Medical Problems of the North, Siberian Division, Russian Academy Sciences, Krasnoyarsk)

The aim of the study is to investigate the activities of metabolic enzymes in blood lymphocytes of patients with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). The studied groups included healthy children and adolescents and patients with IDDM. Activities of NAD(P)-dependent dehydrogenases in blood lymphocytes were tested using bioluminescent method. Analysis of resultants demonstrated that revealed violations in metabolism of lymphocytes are determined by inhibition of initial stages of glycolysis and oxidative reactions of pentose cycle together with opposite alterations of dehydrogenase reaction activities of tricarboxylic acid cycle, activation of anabolism lipide reactions and inhibition of some reactions of aminoacid exchange Reduction of antioxidant defence level was detected in blood lymphocytes of patients with IDDM that suggests an additional deterioration of physiological and functional state of immunocompetent cells.

Литература

1. Дедов И.И., Сунцов Ю.И., Кудрякова С.В., Рыжкова С.Г. Эпидемиология инсулинзависимого сахарного диабета Н Пробл. эндокринол. - 1998. - №2. -С.47-51.

2. Жук Е.А., Козлов В.А., Галенок В.А. Особенности синдрома вторичного иммунодефицита при инсулинзависимом сахарном диабете // Иммунология. -1999. -№1. -С.48-51.

3. Жумагалиева Г. Д., Скрябина Э.Г., Смирнов В. В. и др. Инсулинсвязывающая активность иммунокомпетентных клеток у детей с сахарным диабетом // Пробл. эндокринол. - 1997. - №1. - С.9-11.

4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. -М.: Высшая школа. 1998. - С.479.

5. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов. - М.: Медицина, 1985. - С.432.

6. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолю-минесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. -№11. - С.23-25.

7. Строев Е.А. Биологическая химия. - М.: Высш. школа. - 1986. - С.479.

8. Boyum A. Isolation of limphocytes from blood and bone marrow // Scand.J.Clin.Lab.Invest. - 1968. -Vol.21, Suppl.97. - P.77-80.

9. Fahien L.A., Laboy J.I., Din Z.Z. et al. Ability of cytosolic malate dehidrogenase and lactate dehydro-

genase to increase the ratio of NADPH to NADH oxidation by citosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase // Arch. Biochem. Biophis. - 1999. - Vol.364, N.2. - P.185-194.

10. Geek M.K., Kirsch J.F. A novel, definitive test for substrate channeling illustrated with the aspartate ami-notransferase/malate dehidrogenase system // Biochemistry. - 1999. - Vol.38, N.25. - P.8032-8037.

11. Hwang K., Jeong D.W., Lee J.W. et al. Alteration of the NAD+/NADH ratio in CHO cells by stable transfection with human cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: resistance to oxidative stress // Mol. Cells. - 1999. - Vol.9, N.4. - P.429-435.

12. Malini T., Arunacaran J., Aruldhas M.M., Govindara-julu P. Effects of piperine on the lipid composition and enzymes of the pyruvate-malate cycle in the testis

of the rat in vivo // Biochem. Mol. Biol.Int. - 1999. -Vol.47, N.3. - P.537-545.

13. Meade D., Chess C., Welburne T.C. Glutamate transport and cellular glutamine metabolism: regulation in LLC-PK1 vs. LLC-PCI-F+ cell lines//Am.J.Physiol.-1998. - Vol.274, N.6(Pt. 1). - P. 1616-1624.

14. Tian W.N., Braunsyein L.D., Pang J. et al. Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity for cell growth // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol.273, N.17. -P. 10609-10617.

15. Vorobiev D.V., Vetrova E.G., Larina I.M. et al. Energy substrates, hormone responses and glucocorticoid binding in lymphocytes during intense physical exercise in humans following phosphocreatine administration // Eur. J. Appl. Physiol. - 1996. - Vol.74, N.6. -P.534-540.

О СМИРНОВА И.П., КОНОВАЛОВА Т.Т., ГРИНШТЕЙН Ю.И., МАНЧУК В.Т., ТКАЧЕВА Л.М. -УДК 616.12-005:615.224

ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИПРОФИБРАТА У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА С ДИСЛИПИДЕМИЕЙ В ДОЛГОСРОЧНОМ ПРОСПЕКТИВНОМ НАБЛЮДЕНИИ

И.П. Смирнова, Т.Т. Коновалова, Ю.И. Гринштейн, В.Т. Манчук, Л.М. Ткачева.

(Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск, директор - д.м.н., проф. В.Т. Манчук, лаборатория этногенетических и метаболических проблем нормы и патологии, зав. - д.б.н.

В.В. Фефелова, Красноярская государственная медицинская академия, ректор - акад. АН ВШ проф.

В.И. Прохоренков, кафедра терапии ФУВ, зав. - д.м.н. проф. Ю.И. Гринштейн)

Резюме. Изучен мониторинг липидных спектров плазмы и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) у больных ишемической болезнью сердца (ИБС). Проведено сравнение показателей больных ИБС с группой здоровых лиц, через 21 день, 3,6, 12 месяцев приема ципрофибрата. Липидный статус у больных исходно: гиперлипидемия, гипертриглицеридемия, гиперхолесте-ринемия, активный липогенез, снижение процессов эстерификации холестерина в плазме и окислительной способности липидов, дестабилизация липидной структуры ядра и поверхностного слоя ЛПВП. Через 21 день лечения ципрофибратом формируется ауторегуляторный уровень липидов, близкий к здоровым лицам и остается таковым через 3, 6 и 12 месяцев. В течение 12 месяцев достигнута оптимизация в ключевых звеньях метаболизма липидов. Нормализация липидной структуры ЛПВП создает условия для увеличения обратного транспорта холестерина в печень. Результаты клинического анализа подтверждают гиполипидемическую эффективность ципрофибрата у больных ИБС.

Проблема коронарного атеросклероза остается актуальной в XXI веке в связи с неуклонным ростом заболеваемости, инвалидизации и смертности трудоспособного населения промышленно развитых стран, в том числе и России [1,5,12]. Атеросклероз - многофакторное заболевание. Однако всеобщее признание получила теория патогенеза атеросклероза, связанная с нарушением липидного обмена и развитием дислипопротеинемий

[3,12]. Липопротеидная теория базируется на дисбалансе распределения холестерина между от-

дельными классами липопротеидов (ЛП) и тканями. В этой связи изучение физиологической функции ЛП, их роли в патогенезе атеросклероза и коррекции функциональных свойств с целью снижения уровней липидов в сыворотке крови является актуальным [3,11]. Среди известных способов лечения ИБС особое значение придается коррекции дислипидемий с помощью гиполипи-демических препаратов. Воздействие на липидный профиль позволяет уменьшить проявления ИБС, отсрочить ее осложнения и увеличить про-