CC BY
10Органический синтез и биотехнология
УДК 661.12 +
Viktor I. Krutikov, Andrey V. Erkin, Anastasiya V. Aleksandrova
5-ARYLAMINOMETHYLENE-1H-PYRIMIDINE-2,4-DIONE AS POTENTIAL ANTIFUNGAL AND ANTIMICROBIAL DRUGS
St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: kruerk@yandex.ru
A number of 6-amino-5-arylaminomethylene-1H-pyrimi-dine-2,4-diones were obtained by interaction of 6-amino-2,4-di-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-carbaldehyde with substituted anilines. Biological screening showed that the target compounds had a high antimycobacterial activity. The results of testing of the target products coincided with the prediction of their biological activity by computer programs PASS. It is shown that the level of bioactivity of the obtained compounds significantly depends on their solubility in lipids. Optimization of the structure of derivatives of 6-amino-5-arylaminomethylene-1H-pyrimidine-2,4-diones was carried out according to the Hansch method by using the software package HyperChem™ Release 8.08 for Windows Molecular Modeling System.
Keywords: 6-amino-5-arylaminomethylene-1H-pyrimi-dine-2,4-dione, optimization of structure, minimum inhibitory concentration, immunomodulatory activity, potential anti-TB drugs.
661.7: 547.7/.8
В.И. Крутиков1, А.В. Еркин2, А.В. Александрова3
5-АРИЛИМИНОМЕТИЛ-1Н-ПИРИМИДИН-2,4-ДИОНЫ -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ И ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: kruerk@yandex.ru
Взаимодействием 6-амино-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропи-римидин-5-карбальдегида с замещенными анилинами получен ряд 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов. Прогнозирование биологической активности полученных соединений с использованием компьютерной программы PASS показало достаточно высокую вероятность проявления ими противовирусной и антимикобактериальной активности. Результаты тестирования целевых продуктов совпали с прогнозом. Показано, что уровень биоактивности полученных веществ в значительной степени зависит от их растворимости в липидах. Оптимизацию структур целевых соединений осуществляли по методу Ганча с использованием пакета программ HyperChem™ Release 8.08 for Windows Molecular Modeling System.
Ключевые слова: 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пири-мидин-2,4-дионы, оптимизация свойств, минимальная ингибирующая концентрация, иммуномодулирующая активность, противотуберкулезные препараты.
Неослабевающий интерес исследователей, занятых поиском новых потенциальных лекарственных препаратов в ряду оснований Шиффа, обусловлен проявлением этими соединениями физиологической активности широкого спектра. В недавних обзорах [1, 2] отмечалось, что вещества, имеющие в своей структуре фрагмент CH=N, имеют огромное химиотерапевтическое значение в качестве противомикробных, противомалярийных, противовоспалительных, противовирусных,
антигипертензивных средств.
Ранее нами [3] отмечалось, что высокая реакционная способность азометинового фрагмента в органических соединениях, обусловленная близким соседством в молекуле нуклеофильного и электрофильного центров, особенно важна в реакциях протонирования, которые часто протекают в биогенных средах. При этом было показано, что 5-арилиденаминоурацилы 1 показали in vitro высокую активность по отношению к вирусам простого герпеса, к различным штаммам микобактериий, а также проявляли себя как индукторы интерферона, демонстрируя тем
самым способность усиливать иммунитет теплокровных. Отмечалась также существенная роль липофильных свойств молекул в проявлении азометинами биологической активности.
Представляет обоснованный интерес вопрос о влиянии структуры азометинового фрагмента в производных пиримидинонов на уровень биологической активности. В связи с этим в настоящей работе синтезированы соединения общей формулы 2.
O
O
N
H
где R = Н, алкил, галоген (конкретные значения заместителей представлены в таблице 2).
1
2
1 Крутиков Виктор Иосифович, д-р хим. наук, зав. каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: kruerk@yandex.ru Viktor I. Krutikov, Dr Sci. (Chem.), Head of Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances
2 Еркин Андрей Викторович, канд. хим. наук, доцент каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: kruerk@ yandex.ru
Andrey V. Erkin, Ph.D. (Chem.), associate Professor, Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances
3 Александрова Анастасия Валерьевна, аспирантка каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: arphei@mail.ru Anastasiya V. Aleksandrova, postgraduate student, Department of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances
Дата поступления - 25 мая 2016 года
Выбор формулы целевых соединений обусловлен несколькими факторами. Во-первых, их структура по некоторым своим физико-химическим характеристикам, как-то: липофильность, энергия гидратации, сходна с подобными параметрами 5-арилиденаминоурацилов 1. Во-вторых, введение в положение 6 пиримидинового кольца аминогруппы позволяет усилить иммуномодули-рующую активность препаратов [4].
Результаты и обсуждение
Прогноз потенциальной биологической активности 5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов 2 по программе PASS (http://www.pharmaexpert. ru/PASSOnline/) показал, что целевые соединения способны проявить противовирусную и противомикробную активность с заметной степенью вероятности. Обращает на себя внимание хорошее совпадение результатов прогноза для соединений 1 и 2 (таблица 1). При этом вероятность проявления антимикобактериальной и противотуберкулезной активности у азометинов 1 несколько выше, чем у 2. Весьма вероятным оказывается также проявление соединений 1 и 2 в качестве ингибиторов синтеза ДНК. Тем самым предполагается возможный механизм биологического действия указанных препаратов.
Таблица 1. Общие виды прогнозируемой биологической активности 5-(4-этилфенилиминометил)-6-амино-1Н-пиримидин-2,4-диона и 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден)амино-1,3-пиримидина
Вид прогнозируемой биологической активности Pa/Pi а) 2,4-диоксо-5-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензилиден) амино-1,3-пиримидин Pa/Pi 5-фенили-минометил-6-амино-1Н-пири-мидин-2,4-дион
Antiprotozoal 0.384/0.022 0.385/0.023
Antiviral (Herpes) 0.326/0.070 0.366/0.052
Antituberculosic 0.510/0.010 0.337/0.054
Antimycobac-terial 0.539/0.013 0.291/0.087
DNA synthesis inhibitor 0.244/0.083 0.257/0.078
Примечание: а) Рa и Pi вероятности проявления и непроявления определенного вида биологической активности
Целевые соединения 2 синтезировали по традиционной схеме образования азометиновой связи путем взаимодействия 6-амино-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-карбальдегида с различными анилинами:
HN'
POCl,
Применение хлористого цинка позволило получить целевые азометины 2 с невысокими выходами (таблица 2).
Таблица 2. Физико-химические параметры 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов
№ соед. R' Выход, % Т. пл., °С Rf а) Найдено, % Формула Вычислено, %
C H N С H N
2а H 31 260 (разл.) 0,65 57,2 4,48 23,9 СцНк^Л 57,4 4,38 24,3
2б 4-C2H5 48 256 (разл.) 0,78 60,7 5,36 21,8 С13НМ^02 60,5 5,46 21,7
2в 3-CH3-4-Br 27 277 (разл.) 0,16 44,4 3,48 17,8 С^НцВг^Ог 44,6 3,43 17,3
2г 4-CH3 25 262 (разл.) 0,81 59,4 5,00 22,8 СцН12^02 59,1 4,95 22,9
2д 4-F 65 >300 0,44 53,1 3,75 22,2 СцН^Л 53,2 3,65 22,6
Примечание: а) хроматографирование проводилось в системе метанол: хлороформ (9:1)
Все эти реакции проводились по аналогичной методике: 6-аминоурацил-5-карбальдегид растворяли в ДМСО, добавляли соответствующее стехиометрии количество анилина и каталитическое количество хлористого цинка, перемешивали реакционную массу при 70-80 °С (в случае 4-этиланилина и п-толуидина цвет реакционной массы изменился от желто-оранжевого до темно-коричневого) в течение 4-6 ч. Отгоняли в вакууме ДМСО, оставшийся осадок суспендировали в этаноле, отфильтровывали, кипятили в этаноле для удаления непрореагировавшего альдегида, снова отфильтровывали и высушивали в вакууме над пентаоксидом фосфора.
Полученные в ходе проведенных реакций соединения общей формулы 2 представляют собой высокоплавкие ярко-жёлтые кристаллические вещества. Данные об их физико-химических параметрах представлены в таблице 2.
Структуры всех целевых соединений были подтверждены спектрами ПМР. Характерные для 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов сигналы протонов представлены в таблице 3.
Таблица 3. Спектры ПМР 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов
■nh2 (CH3)2NCHO O'
Пиримидин-5-карбальдегиды, как правило, синтезируют по Раймеру-Тиману контролируемым окислением 5-гидроксиметилпиримидинов или методом Вильсмейера. В настоящей работе альдегид синтезировали по Вильсмейеру в условиях сохранения экзоциклических оксогрупп [5].
Взаимодействие полученного альдегида с замещенными анилинами проводили в ДМСО при нагревании реакционной массы до 120 °С. Ход реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии. Без использования катализатора из реакционной массы после многочасового нагревания удалось выделить только исходные соединения. Не привело к успеху и использование серной кислоты в качестве катализатора.
№ соед. Химический сдвиг, м.д.
NH2 (Ur) NH (кольцо) CH=N Ar
2а 7,1 8,6 10,7 10,1 7,2 - 7,4
2б 7,3 8,6 10,7 10,1 7,0 - 7,2
2в 7,1 8,7 10,7 10,1 6,9 - 7,5
2г 7,1 8,6 10,7 10,2 7,0 - 7,4
2д 7,1 8,6 10,7 10,0 7,0 - 7,2
Для инфракрасных спектров 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов характерными являются сигналы группы ^=СН- в области 16001700 см -1, групп ^Н- в пиримидиновом кольце в области 2900-3300 см-1, групп С=О в области 1700-1850 см-1, группы в области 3250-3700 см-1 и сигналы
ароматических атомов в области 1100-1600 см-1.
Оценка биологической активности целевых соединений
Синтезированные соединения в ряду производных 5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-ди-
O
O
O
2
HO
O
онов 2 были протестированы на различные виды противобактериальной и противовирусной активности по известным методикам [6, 7]. Результаты биологических испытаний представлены в таблице 4.
Таблица 4. Результаты биологического тестирования и параметры липофильности 5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов
№ Минимальная ингибирующая концентрация (мкг/мл)
соед. E. coli St. aureus C. albicans A. niger M. tuberculosis IgP
2а > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 0,53
2б > 100 > 100 > 100 100 25 1,59
2в 100 100 100 100 12,5 2,17
2г > 100 > 100 > 100 > 100 50 1,19
2д > 100 > 100 > 100 > 100 100 0,86
Обращает на себя внимание то обстоятельство, все синтезированные в ходе настоящей работы проявили заметную активность только по отношению к штамму Mycobacterium tuberculosis, и лишь 5-(3-метил-4-бромфе-нилиминометил)-6-амино-1Н-пиримидин-2,4-дион (2 в) ин-гибировал в различных концентрациях все виды микроорганизмов.
С целью оптимизации структуры соединений 2 мы рассчитали степенную зависимость Ганча для ингибирова-ния штамма Mycobacterium tuberculosis:
igi/Co = f [(ig P)n],
где ig P - параметр липофильности, характеризующий относительную растворимость веществ в липидах и воде, рассчитанный по программе Hyper MM+ QSAR Properties; Co - минимальная концентрация вещества, вызывающая 100 %-ное ингибирование роста микроорганизмов.
Выбор параметра липофильности igP в качестве независимой переменной, характеризующей свойства веществ, обусловлен тем, что по данным многочисленных исследований присутствие азометинового фрагмента в молекуле органического вещества способствует ускорению проникновения его через биологические мембраны [1]:
ig 1/Co = 3.46 - 0.990 ig P + 1.35 (ig P)2 - 0.321 (ig P)3 r 0.997 s 0.001
Обращают на себя внимание высокие корреляционные характеристики полученной зависимости.
Рисунок. Зависимость уровня противотуберкулезной активности соединений 2 от параметра липофильности
Математическая обработка полученной зависимости позволила рассчитать экстремальные значения величины 1дР:
d (lg 1/Co) / d (lg P) = -0.990 + 2.70 Ig P - 0.963 (Ig P)2 Ig Рэкстр. = 0.43 и 2.37
Полученные значения 1дРэкстр. строго определяют интервал значений параметра липофильности для проявления 5-арилиминометил-1Н-пиримидин-2,4-диона-ми противотуберкулезной активности.
Следует отметить одну интересную особенность различий в проявлении биологической активности соединениями 1 и 2. Величины энергии гидратации 5-ари-лиминометил-1Н-пиримидин-2,4-дионов практически одинаковы и лежат в области 11 кДж/моль, тогда как для
5-арилиденаминоурацилов 1 эти значения колеблются в интервале 5-21 кДж/моль, существенно влияя на уровень биологической активности [3]. Тем самым подтверждается тезис о важности ферментативного гидролиза пиримидинонов в биогенных средах.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 1Н регистрировали на спектрометре Bruker WM-400 (рабочая частота 400.13 МГц) в ДМСО-de, внутренний стандарт - сигналы остаточных протонов ДМСО.
Хроматографированию на пластинках Silufol UV-254 подвергали 0,1 %-ные диметилсульфоксидные растворы. Длина пробега подвижной фазы составляла 7,5 см. Детектирование зон абсорбции осуществляли в УФ свете при 254 нм и в йодной камере.
Индивидуальность целевых соединений 2 контролировали методом ВЭЖХ (колонка Luna C-18 4,6x250 мм, подвижная фаза А: 0.1 %-ный раствор трифторуксусной кислоты в воде; В: ацетонитрил : вода = 70 : 30, скорость подачи 1,5 мл/мин).
Элементный анализ проводили на анализаторах Leco CHNS-932.
ИК спектры записаны на спектрометрах ФСМ-1201 в таблетках KBr и SHIMADZU FTIR-8400S.
Температуры плавления определены на приборе для измерения температуры плавления ПТП.
Расчет конфигурации, распределения электронной плотности, параметра липофильности, энергии гидратации молекул и их молекулярная динамика проводились на персональном компьютере с использованием пакета программ HyperChem™ Release 8.08 for Windows Molecular Modeling System.
Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием пакета программ OriginPro 8SRO, v. 0725.
6-Аминоурацил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетра-гидропиримидин-5-карбальдегид. К суспензии 12,7 г
6-аминоурацила в 25 мл абсолютного ДМФА по каплям и при интенсивном перемешивании в течение 1 ч прибавляли 18,3 мл свежеперегнанного оксотрихлорида фосфора, поддерживая температуру реакционной массы не выше 20 °С. По окончании прибавления оксотрихлорида фосфора затвердевшую массу размельчали механически и нагревали на кипящей водяной бане 2 ч. После охлаждения массу переносили на лед и растирали до получения суспензии. Последнюю нейтрализовывали 40 %-ным водным раствором едкого натра при температуре не выше 20 °С, осадок отфильтровывали, промывали водой и суспендировали в 5%-ом водном растворе едкого натра. Нерастворившуюся часть отфильтровывали, тщательно промывали водой, суспендировали в 100 мл воды и подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН 4-5. Осадок отфильтровывали, промывали водой, последовательно кипятили со 100 мл воды и этанола и сушили в вакууме над пентаоксидом фосфора при 80 °С.
6-Амино-5-фенилиминометил-1Н-пирими-дин-2,4-дион. 1,55 г 6-аминоурацил-5-карбальдеги-да растворяли в 30 мл ДМСО, затем к нему добавляли 0,93 г анилина и 0,14 г хлористого цинка. Реакционную массу перемешивали при 70-80 °С в течение
5 ч. Отгоняли в вакууме ДМСО, оставшиеся осадки суспендировали в этаноле, отфильтровывали, кипятили в этаноле для удаления непрореагировавшего альдегида, снова отфильтровывали и высушивали в вакууме над пентаоксидом фосфора. Выход целевого продукта составил
Биологическая активность целевых соединений изучена по отношению к стандартным штаммам из коллекции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии С.-Петербургского первого государственного медицинского университета им. академика И.П. Павлова, за что авторы выражают глубокую благодарность профессору В.В. Тецу и его сотрудникам. Испытания на биологическую активность проводились в Центре «Клиническая микробиология».
Оценка фунгицидного действия. В качестве тест-микроорганизмов использовали устойчивые к дезинфицирующим средствам штаммы грибов рода Candida albicans, которые выращивали на среде Сабуро. Биологический эффект оценивали по наличию или отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах.
В результате исследования токсичности соединений 1 и 2 на непородистых белых мышах массой 18-20 г было показано, что при введении упомянутых соединений перорально (доза 300 мг/кг), внутрибрюшинно или через желудочный зонд (доза 100 мг/кг) летального исхода или характерных токсических эффектов не наблюдалось.
Биологические эксперименты проведены в полном соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других научных целей [8].
Заключение
Синтез 6-амино-5-арилиминометил-1Н-пирими-дин-2,4-дионов и оценка их активности in vitro по отношению к штаммам различных микроорганизмов показали перспективность поиска в указанном ряду потенциальных
противотуберкулезных препаратов. Основными направлениями синтеза новых соединений следует считать: введение в «анилиновый» фрагмент молекулы одновременно липофильных и электроотрицательных радикалов.
Литература
1 Jai D., Suman D. and Ashwani K. Synthesis, antibacterial evaluation and QSAR analysis of Schiff base complexes derived from [2,2'-(ethylenedioxy)bis[ethylamine)] and aromatic aldehydes // Med. Chem. Commun. 2016. V.7. P. 932-947.
2. Jai D., Suman K., Suman D., Rajesh M., Pradeep K., Balasubramanian N. Synthesis, biological evaluation, and QSAR studies of organosilicon(IV) complexes derived from tridentate ONO Schiff bases of dehydroacetic acid and aromatic hydrazides // Monatshefte für Chemie. 2015, V. 146, Is. 12, P. 1995-2005.
3. Крутиков В.И., Еркин А.В. 5-Арилиденамино-урацилы I. Синтез, влияние физико-химических параметров на уровень биологической активности // Журн. общей химии. 2009. Т. 79. Вып. 5. С. 813-818.
4. Tets V.V., Tets G.V., Krutikov V.I. Agent for Inducing Endogenous Interferon: EP 2 638 901 A1. Date of publ. 18.09.2013 Bulletin 2013/38.
5. Еркин А.В., Крутиков В.И. О формилировании 6-аминоурацила реагентом Вильсмейера // Журн. общей химии. 2004. Т. 74. Вып. 1. С. 159-160.
6. GentryA.G., Lawrence N., Lushbaugh N. Isolation and Differentiation of Herpes Simplex Virus and Trichomonas Vaginalis in Cell Culture // J. Clin. Microbiol. 1985. V. 22. N 2. Р. 199.
7. Wang S-P., Grayston J.T. Serotyping of Clamidia trachomatis by Indirect Fluorescent-Antibody Staining of Inclusions in Cell Culture with Monoclonal Antibodies // J. of Clinical Microbiology, 1991, v. 29, N 7, p. 1295-1298.
8. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (France). European Treaty Series. No 123., 18.03.1986. P. 11.
