CC BY
68
Скрининг антагонистической активности и детерминант вирулентности у фекальных штаммов энтерококков
М. В. Сычёва, к.б.н., Оренбургский ГАУ; И. В. Валышева, к.б.н., Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург
В связи с широким применением химиотерапевтических препаратов, усилившейся экологической нагрузкой на организмы животных и человека происходит увеличение числа патологий, связанных с изменением биологических свойств нормальной микрофлоры.
Длительное время применение антибиотиков решало проблему инфекционных осложнений, вызванных условно-патогенными, патогенными бактериями и грибами. Однако в последние годы эффективность антибиотиков существенно снизилась за счёт широкого распространения резистентности к ним среди микроорганизмов [1]. Кроме того, выросло количество людей, страдающих аллергическими реакциями на применение антибиотиков, вплоть до их полной непереносимости.
Эффективную альтернативу антибиотикоте-рапии составляет применение биопрепаратов на основе культур живых молочнокислых микроорганизмов, оказывающих благоприятное воздействие на макроорганизм за счёт антагонизма к патогенной микрофлоре, а также детоксицирующего и иммуномодулирующего эффекта [5]. Одним из важных требований при отборе перспективных пробиотических штаммов является отсутствие у них генов, кодирующих факторы вирулентности.
ЕШегососсш /аесшт — представитель нор-мофлоры пищеварительного тракта млекопитающих относится к типичным молочнокислым микроогранизмам. Энтерококки, проявляющие антагонистическую активность в отношении ряда патогенов и не имеющие факторов вирулентности, могут быть использованы в качестве компонента биопрепаратов. Поиск новых перспективных пробиотических культур на территории РФ является актуальной задачей, поскольку установлено, что ряд известных зарубежных пробиотических штаммов энтерококков обладает низким уровнем антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам, выделенным на территории России [2].
Всё вышеизложенное и предопределило цель настоящего исследования — поиск штаммов ЕМегососсш /аесшт, обладающих широким спектром антагонистической активности и не имеющих генов, кодирующих синтез факторов вирулентности.
Материалы и методы. Материалом для исследования стали 30 штаммов энтерококков, выделенных из кишечника животных и человека. Микроорганизмы выделяли классическим бактериологическим методом. Посев исследуемого материала осуществляли на дифференциальнодиагностическую среду — Enterococcosel-Agar. При обнаружении характерного для энтерококков роста (образование коричнево-чёрного преципитата вокруг колоний) проводили пересев на агар Шедлера. Штаммы идентифицировали
1. Праймеры, использованные для идентификации энтерококков
Вид энтерококка Ген Праймер Последовательность 5'-З' Размер продукта реакции, п.о.
E. durans sodA DU1 CCTACTGATATTAAGACAGCG 295
DU2 TAATCCTAAGATAGGTGTTTG
E. faecalis sodA FL1 ACTTATGTGACTAACTTAACC З60
FL2 TAATGGTGAATCTTGGTTTGG
E. faecium sodA FM1 GAAAAAACAATAGAAGAATTAT 215
FM2 TGCTTTTTTGAATTCTTCTTTA
E. malodoratus sodA MA1 GTAACGAACTTGAATGAAGTG 1З4
MA2 TTGATCGCACCTGTTGGTTTT
до вида с помощью мультиплексной ПЦР с использованием известных праймеров (табл. 1) по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы [6].
Синтез праймеров осуществлён компанией «СИНТОЛ» (г. Москва). Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-экспресс» («Литех», Россия).
Антагонистическую активность изучали чашечным методом (принцип отсроченного антагонизма). В качестве индикаторных штаммов использовали патогенные и условно-патогенные микроорганизмы: Staphylococcus aureus (3 штамма), Listeria monocytogenes (5 штаммов), L. seeligeri (3 штамма), Salmonella enteritidis (2 штамма), Klebsiella pneumoniae (3 штамма), грибы рода Candida (3 штамма).
Диаметр зон задержки роста чувствительной культуры и диаметр роста штамма-продуцента
измеряли с помощью штангенциркуля. Коэффициент антагонистической активности рассчитывали по формуле: отношение диаметра зоны задержки роста патогенного или условнопатогенного микроорганизма к диаметру зоны роста культуры-продуцента [3].
Для выявления гемолитической активности осуществляли посев суточных культур энтерококков пятачками на 5-процентный кровяной агар. После инкубации при 37° С в течение 24 час. определяли наличие зоны гемолиза вокруг выросших штаммов.
Желатиназную активность определяли посевом суточной агаровой культуры микроорганизмов с помощью укола в столбик питательного бульона, содержащего 12% желатины. Инкубировали в течение 24 час. при температуре +37° С. Учёт результатов осуществляли после охлаждения пробирок с ростом микроорга-
2. Праймеры, использованные для обнаружения детерминант вирулентности энтерококков
Ген Праймер Последовательность 5-3 Размер продукта реакции, п.о.
HYL HYL n1 ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG 276
HYL n2 GACTGACGTCCAAGTTTCCAA
ASA ASA 11 GCACGCTATTACGAACTATGA 375
ASA 12 TAAGAAAGAACATCACCACGA
ESP ESP 14 F AGATTTCATCTTTGATTCTTA-G 510
ESP 12 R AATTGATTCTTTAGCATCTGG
cylLL cylLL 1 GATGGAGGGTAAGAATTATGG 253
cylLL 2 GCTTCACCTCACTAAGTTTTATAG
gelE TE9 ACCCCGTATCATTGGTTT 419
TE10 ACGCATTGCTTTTCCATC
cylM TE13 CTGATGGAAAGAAGATAGTAT 742
TE14 TGAGTTGGTCTGATTACATTT
cylB TE15 ATTCCTACCTATGTTCTGTTA 843
TE16 AATAAACTCTTCTTTTCCAAC
cylA TE17 TGGATGATAGTGATAGGAAGT 517
TE18 TCTACAGTAAATCTTTCGTCA
espfm ТЕ 104 TTGCTAATGCAAGTCACGTCC 955
ТЕ 105 GCATCAACACTTGCATTACCGAA
низмов при температуре +4° С в течение 2 час. и по «текучести» желатины делали заключение о наличии фермента [4].
При помощи ПЦР-анализа у энтерококков определяли гены, кодирующие синтез известных факторов патогенности: цитолизины — Cyl A, Cyl B, Cyl M, cylLL; желатиназа — GelE; сери-новая протеаза — sprE; гиалуронидаза — HYL; поверхностные белки, участвующие в адгезии и инвазии — Esp, а также поверхностный бе-лок—адгезин (ASA) (табл. 2) [7—9].
Продукты амплификации генов анализировали путём электрофоретического разделения в горизонтальном 1- или 2-процентном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определённой массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс. В качестве маркеров молекулярных масс использовали Gene Ruler 100 bp и 1 kbp DNA Ladder (Fermentas, Литва).
Результаты исследований. В результате идентификации, проведённой с помощью мультиплексной ПЦР, 18 выделенных штаммов (60%) были отнесены к виду Enterococcus faecium, остальные 12 (40%) — к виду Enterococcus faecalis.
Для дальнейшей работы были отобраны штаммы Enterococcus faecium.
Изучение антагонистической активности E. faecium в отношении тест-культур микроорганизмов показало, что 33,3% исследованных штаммов подавляли рост S. aureus (рис.). Активность в отношении L. monocytogenes проявляли 50,0 % культур, L. seeligeri — 66,7%, при этом высокий уровень антагонистической активности (>5) по отношению к L. monocytogenes и L. seeligeri зарегистрирован у 16,7 и 33,3% штаммов энтерококков соответственно. Два штамма E. faecium обладали антагонизмом к K. pneumoniae. Установлено, что из 18 исследуемых культур энтерококков рост S. enteritidis подавлял один штамм (5,6%). Антагонизм к дрожжеподобным грибам рода Candida проявляли 16,7% фекальных штаммов энтерококков.
При фенотипической характеристике патогенных свойств кишечных изолятов энтерококков гемолитическая и желатиназная активности не выявлены.
На следующем этапе изучили распространённость генетических детерминант вирулентности среди шести штаммов E. faecium, обладающих наиболее выраженной антагонистической активностью. Комплекс генов, кодирующих синтез цитолизина (cylA, cylB, cylM, cylLL), у анализируемых штаммов не обнаружен. Также фекальные изоляты E. faecium не содержали гены, кодирующие синтез сериновой протеазы, желати-
назы и белков, способствующих уклонению от иммунного ответа (Ер). У трёх антагонистически активных штаммов E. faecium обнаружили ген, кодирующий продукцию гиалуронидазы.
J4HJ
но
80
V
Рис. - Распространённость антагонистической активности среди фекальных штаммов Е. Еаеешт
Выявлено, что ген, отвечающий за синтез поверхностного белка-адгезина (ASA), содержал 83,3% антагонистически активных штаммов энтерококков (пять культур из шести). Наличие поверхностного белка-адгезина указывает на возможную способность к адгезии к эпителию слизистой оболочки кишечника. Поскольку предпочтительной является элиминация из макроорганизма пробиотической культуры после окончания использования препарата, адгезию следует рассматривать как отрицательное для пробиотического штамма свойство.
Таким образом, в результате проведённых исследований отобрана одна культура En-terococcus faecium, обладающая антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и не имеющая факторов вирулентности.
Отобранную культуру энтерококков после оценки эффективности, специфической активности и стабильности in vitro и in vivo можно использовать в качестве перспективного производственного штамма для создания пробиотического препарата.
Литература
1. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Рациональная антимикробная фармакотерапия. М.: Мир, 2008. 1001 с.
2. Зианбетова Л.Х., Валышева И.В. Антимикробная активность энтерококков, выделенных из различных источников // Вестник РГМУ. 2009. №3. С. 28.
3. Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. М.: Медицина, 1966. 203 с.
4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. 464 с.
5. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993. Vol. 12. Р. 39-86.
6. Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci 11 J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42. No. 8. P. 3558-3565.
7. Reviriego C., Eaton T., Martin R. et al. Screening of virulence determinants in Enterococcus faecium strains isolated from breast milk // J. Hum. Lact. 2005. Vol. 21. No. 2. P. 131-137.
8. SemedoT., Santos M.A., Martins P. et al. Comparative study using type strains and clinical and food isolates to examine hemolytic
activity and occurrence of the cyl operon in enterococci. // J. C-lin. Microbiol. 2003. Vol. 41. No. 6. P. 2569-2576.
9. Vankercklioven V., Van AutgaerdenT., Vael C. et al. Development of a Multiplex PCR for the Detection of asal, gelE, cylA, esp, and hyl Genes in Enterococci and Survey for Virulence Determinants among European Hospital Isolates of Enterococcus faecium // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42. No. 10. P. 4473-4479.
