CC BY
54
УДК 619:579
Кочкина Е.Е.2, Пашкова Т.М.12, Сычева М.В.12, Карташова О.Л.12
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г Оренбург, Россия 2Оренбургский государственный аграрный университет, г Оренбург, Россия
E-mail: sycheva_maria@mail.ru
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОПРОФИЛЕЙ БАКТЕРИЙ РОДА Enterococcus,
ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЖИВОТНЫХ
Возросшее клиническое значение энтерококков актуализирует вопрос о безопасности их использования в качестве противоинфекционных биопрепаратов пробиотической направленности и диктует необходимость поиска алгоритма для эффективной дифференциации клинически значимых штаммов от представителей мутуалистической микробиоты.
Изучены биологические свойства бактерий рода Enterococcus, изолированных из фекалий клинически здоровых продуктивных животных и от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями. Определены биопрофили, характеризующие патогенные и непатогенные изоляты. Помимо генетических детерминант факторов вирулентности у штаммов, выделенных при патологии, обнаружены гемолитическая, желатиназная активности и факторы персистенции (АЛА, АКрА) с более высокими значениями признаков, чем у фекальных культур. Штаммы, изолированные из кишечника здоровых животных, характеризовались высокой активностью протеаз и не обладали способностью формировать биоплёнки.
Полученные результаты могут быть использованы для дифференциации патогенных вариантов Enterococcus spp. от симбиотических культур, входящих в состав кишечной нормобиоты.
Ключевые слова: Enterococcus spp., дифференциация, факторы вирулентности, факторы персистенции, полимеразная цепная реакция.
Бактерии рода ЕШвгососсш относятся к группе потенциально-патогенных микроорганизмов [25] и выступают в роли этиологического фактора инфекционно-воспалительных заболеваний животных [15], [18], [21]. Способность вызывать инфекционный процесс связана с наличием у энтерококков набора факторов па-тогенности: поверхностных белков, участвующих в процессах адгезии и инвазии [17], цитолизина [12], ферментов агрессии (протеаза [7], желатиназа [14], гиалуронидаза [5]).
С другой стороны, энтерококки, являясь представителями мутуалистической микро-биоты кишечника млекопитающих и птиц [16], принимают участие в элиминации патогенных бактерий и обеспечивают колонизационную резистентность слизистых оболочек [2]. Как представителям нормобиоты энтерококкам также необходимы адгезины и бактериоцины, в том числе цитолизин.
В настоящее время клиническое значение бактерий рода ЕШвгососсш существенно возросло, что актуализирует проблему дифференциации представителей мутуалистической микробиоты и этиологически значимых штаммов. Однако, до настоящего времени биологические свойства энтерококков - возбудителей
инфекционно-воспалительных заболеваний и резидентов кишечной микробиоты животных остаются мало изученными, что и предопределило цель настоящего исследования - изучить биопрофили бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных в норме и при патологии, и выявить наиболее информативные характеристики, позволяющие дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы энтерококков.
Материалы и методы
В работе изучено 85 штаммов энтерококков, из них - 42 изолята видов Enterococcus faecium, E. hirae, E. durans, E. faecalis, E. flavescens, E. casseliflavus, выделенные из фекалий клинически здоровых продуктивных животных, сформировали первую группу.
Во вторую группу были отнесены штаммы E. faecalis, E. faecium, E. casseliflavus, E. flavescens, E. hirae, E. avium, E. durans, изолированные от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями (15 штаммов - из экскрета половых органов самок при эндометритах, 2 - из секрета молочных желёз при маститах, 26 - из гнойного экссудата при
абсцессах мягких тканей и отитах) - всего 43 культуры.
Определение антилизоцимной (АЛА) и антикарнозиновой (АКрА) активностей энтерококков осуществляли фотометрическим методом по О.В. Бухарину с соавт. [4], [3]. За высокий уровень АКрА принимали значения признака более 2 мг/мл; за средний - от 1 до 2 мг/мл, за низкий - менее 1 мг/мл.
Образование биоплёнок бактериями оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в лунках стерильного 96-луночного полистиролового планшета [19].
Факторы вирулентности: гемолитическую и желатиназную активности культур Enterococcus spp. изучали по методам М.О. Биргера (1982) [8]. Активность протеаз (ПА) определяли биуретовым методом по убыли альбумина после инкубации с исследуемыми культурами микроорганизмов [6].
Генетические детерминанты факторов вирулентности: цитолизины - cylA, cylB, cylM, желатиназа - gelE, сериновая протеа-за - sprE, гиалуронидаза - hyl, поверхностные белки, участвующие в адгезии - asa, белки-иммуносупрессоры - esp определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [13], [22], [23].
Полученные в ходе исследований численные данные были статистически обработаны [1].
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований был охарактеризован персистентный потенциал энтерококков. Установлено, что способностью деградировать лизоцим обладали 100% культур в обеих группах, однако уровень выраженности изучаемого показателя характеризовался межвидовой вариабельностью.
Так, средние значения антилизоцимного признака у подавляющего числа фекальных культур были значимо ниже, чем у клинически значимых штаммов энтерококков, составив для Е. faecalis - 1,2±0,22 против 1,6±0,03 мкг/мл (р<0,001); для E. faecium 1,6±0,02 против 1,7±0,001 мкг/мл; для E. durans -1,6±0,02 против 1,9±0,11 мкг/мл (р<0,001); для Е. cas-seliflavus - 1,3±0,09 против 1,7±0,001 мкг/мл (р<0,001). Исключением явились культуры Е.
flavescens^. значения антилизоцимного признака у клинических изолятов данного вида были недостоверно ниже, чем у фекальных штаммов (1,3±0,02 и 1,5±0,15 мкг/мл, соответственно). Выраженность АЛА у изолятов E. hirae не зависела от источника выделения и составила в среднем 1,6±0,02 мкг/мл.
В целом, средние значения антилизоцимно-го признака были значимо выше у энтерококков, выделенных из клинического материала (1,6±0,02 мкг/мл, (р<0,05)), чем у бактерий этого рода, изолированных из кишечного биотопа животных (1,5±0,04 мкг/мл).
Определённый вклад в длительное переживание бактерий в макроорганизме вносит анти-карнозиновая активность. Нами установлено, что способностью деградировать карнозин обладали все фекальные и клинические изоляты Enterococcus sрp.
Максимальные значения АКрА были выявлены у клинических изолятов E. faecium -2,4±0,18 мг/мл, E. casseliflavus - 2,4±0,01 мг/мл, E. hirae - 2,3±0,12 мг/мл и фекальных культур Е. faecalis - 2,2±0,31 мг/мл, E. durans -2,6±0,13 мг/мл. Высокий и средний уровни антикарно-зинового признака чаще встречались у клинически значимых культур энтерококков, чем у симбиотических изолятов Enterococcus sрp, выделенных из кишечного биотопа сельскохозяйственных животных.
Следует отметить, что выраженность изучаемого признака у энтерококков - резидентов кишечной микробиоты животных (1,8±0,02 мг/ мл) была достоверно ниже, чем у клинических изолятов (2,1±0,02 мг/мл, (р<0,001)).
Способность образовывать биоплёнки на абиотической поверхности была характерна для 69,8±3,5% этиологически значимых культур энтерококков, и только для 3,1±1,36% фекальных изолятов (р<0,001), при равных средних значениях признака. 1,3±0,02 и 1,3±0,04, соответственно. Биоплёнкообразование было обнаружено у 66,7±6,08% культур энтерококков, выделенных из экскрета половых органов самок (коэффициент биоплёнкообразования (КБ) 1,2±0,07) и у 77±4,13% штаммов, изолированных из гнойного экссудата (КБ 1,3±0,06). Энтерококки, выделенные из секрета молочных желез, не обладали рассматриваемым фактором персистенции.
Комплексный подход к изучению вирулентного потенциала энтерококков, включающий как микробиологическую, так и генетическую характеристику представителей данного рода, позволил выявить, что 11,6±2,44% клинических изолятов продуцировали желатиназу. Все штаммы, обладающие данным протеолитическим ферментом, принадлежали к виду E. faecalis. Желатиназная активность у фекальных культур энтерококков не обнаружена.
ПЦР с лизатами фекальных и клинических изолятов энтерококков позволила выявить ген, кодирующий синтез желатиназы (gelE), только у клинически значимых культур E. faecalis, в 41,9±3,76% случаев (рис. 1).
Количественная оценка протеолитиче-ской активности фекальных и клинических изолятов Enterococcus spp. показала, что 100% штаммов обеих групп обладали анализируемым свойством. Более высокими значениями ПА характеризовались фекальные изоляты энтерококков - 0,52±0,028мгмл/мин по сравнению с клиническими (0,23±0,011мг-мл/мин, (р<0,001)). Ген sprE, обусловливающий протео-литическую активность, выявлен у 48,8±3,81% клинически значимых культур E. faecalis и не зарегистрирован у энтерококков - резидентов кишечной микробиоты животных.
Генетическая детерминанта, кодирующая синтез гиалуронидазы, у энтерококков, выделенных из клинического материала и фекалий животных, не обнаружена.
Анализ цитолитической активности бактерий показал, что способность разрушать эритроциты была характерна для 18,6±2,97%
этиологически значимых культур E. faecalis. Штаммы Enterococcus spp., выделенные из кишечного биотопа, гемолитической активностью не обладали.
В популяции клинических изолятов энтерококков комплекс генов, кодирующих синтез цитолизина, обнаружен у штаммов E. faecalis, выделенных из экскрета половых органов самок и гнойного экссудата. Гены cylB и cylM, ответственные за транспорт и посттрансляционную модификацию цитолизина, и cylL¡ - структурная субъединица цитолизина, обнаружены в геноме 37,2±3,69% культур. Реже, в 30,2±3,50% случаев, встречалась генетическая детерминанта cylA, обеспечивающая активацию цитолизина. У восьми штаммов E. faecalis (4,7±1,61%), выделенных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, обнаружен ген cylL Полный комплекс генов cyl-оперона выявлен у двух штаммов E. faecalis, изолированных из экскрета половых органов самок при эндометритах.
Среди мутуалистических энтерококков фекальной микробиоты животных генетические детерминанты, кодирующие синтез большой и малой субъединиц цитолизина (cylL¡ и cylL), зарегистрированы в 5,6±1,81% и 14,8±2,79% случаев, соответственно. Гены цитолизинов (cylA, cylB, cylM) в популяции фекальных изолятов энтерококков не выявлены.
Генетические детерминанты, кодирующие белки клеточной стенки, ответственные за уклонение от иммунных сил макроорганизма (esp), и белки-адгезины (asa), обнаружены в геноме 44,2±3,79% и 41,9±3,76% клинически значи-
I Клинические изоляты □ Фекальные изоляты
Рисунок 1 - Генетическая характеристика вирулентного потенциала энтерококков
мых изолятов энтерококков, соответственно. У фекальных культур коллекции гены esp и asa не выявлены.
Анализ полученных данных позволил выявить биологические свойства, представленные в таблице, по которым изученные группы штаммов существенно различались между собой (табл. 1).
Так, в геноме культур Enterococcus spp, выделенных из клинического материала, обнаружены генетические детерминанты, кодирующие синтез факторов вирулентности. Кроме того, этиологически значимые культуры энтерококков обладали факторами вирулентности на уровне фенотипа: гемолитической, желати-назной активностями и изученными факторами персистенции (АЛА, АКрА) с более высокими значениями признаков, чем у фекальных изоля-тов. Симбиотические штаммы энтерококков из кишечника здоровых животных характеризовались высокой активностью протеаз и не обладали способностью формировать биоплёнки.
Заключение
Бактерии рода Enterococcus представляют особый научный и практический интерес, так как, с одной стороны, являются представителями мутуалистической микробиоты желудочно-кишечного тракта млекопитающих, и, обладая рядом полезных свойств, активно используются в качестве компонентов биопрепаратов про-биотической направленности. С другой сторо-
ны, энтерококки - потенциально-патогенные микроорганизмы, выступающие в роли этиологических агентов экзогенных и эндогенных инфекционных процессов у животных.
Двойственная природа Enterococcus spp. диктует необходимость поиска алгоритма для эффективной дифференциации патогенных штаммов от изолятов, входящих в состав нор-мобиоты.
При анализе распространённости и выраженности секретируемых факторов перси-стенции было установлено, что способностью инактивировать такие факторы врождённого иммунитета как карнозин и лизоцим обладали энтерококки обеих групп сравнения, причём значения анализируемых персистентных характеристик были выше у клинических изолятов Enterococcus spp. Указанная закономерность была использована нами при разработке нового способа дифференциации энтерококков кишечной микробиоты животных [9].
Помимо секретируемых факторов перси-стенции у энтерококков была обнаружена способность к биоплёнкообразованию. Данным свойством обладали преимущественно этиологически значимые изоляты Enterococcus spp. Поскольку разница между средними значениями коэффициентов биоплёнкообразования у возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний и фекальных штаммов энтерококков была в пределах ошибки средней арифметической, приходится говорить только о тенденции.
Таблица 1 - Характеристика биопрофилей бактерий рода Enterococcus
Биологические свойства ЕиЬетососсж Клинические изоляты Фекальные изоляты
Распространённость, % Выраженность Распространённость, % Выраженность
Генетические детерминанты вирулентности 100 - 23,8±13,47 -
Протеолитическая активность, мг-мл/мин 100 0,23±0,011 100 0,52±0,028
Желатиназая активность 11,6±2,44 - 0 -
Гемолитическая активность 18,6±2,97 - 0 -
Антилизоцимная активность, мкг/мл 100 1,62±0,020 100 1,51±0,039
Антикарнозиновая активность, мг/мл 100 2,05±0,016 100 1,8±0,022
Биоплёнкообразование, усл.ед. 69,8±3,5 1,3±0,02 3,1±1,36 1,3±0,04
В ходе сравнительного анализа вирулентного потенциала клинически значимых и симбио-тических энтерококков выявлены существенные различия у штаммов обеих групп. В геноме энтерококков - возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний были широко распространены факторы патогенности на фено- и генотипическом уровнях. Единственные генетические детерминанты вирулентности, которые удалось обнаружить у фекальных энтерококков, были гены су1Ь1 и су1Ькодирующие субъединицы литического компонента цитолизина, являющегося бактериоцином.
Если, по данным ряда авторов, для этиологически значимых энтерококков характерен богатый набор факторов патогенности [24], то информация о вирулентном потенциале фекальных культур ЕШеюсоссш spp. весьма противоречива. Результаты исследований, полученные Н.Е. Щепитовой с соавт. (2014), подтверждают авирулентность штаммов энтерококков - резидентов кишечного биотопа сельскохозяйственных животных. В то же время согласно Я. 1верр1
et al. (2015), у 62% симбиотических изолятов Enterococcus spp. выявлена генетическая детерминанта gelE, кодирующая синтез желатиназы (кокколиназы). P. Poeta et al. (2006), исследовав геном энтерококков, выделенных из помёта птиц, установили, что часть штаммов обладала Р-гемолитической активностью и содержала гененетические детерминанты cyl-оперона (cylA, cylB, cylM).
Высокий уровень протеолитической активности, зарегистрированный нами у энтерококков кишечного биотопа животных, мы расцениваем не как фактор патогенности, а как одну из важнейших характеристик молочнокислых микроорганизмов, обеспечивающую потребность бактерий в аминокислотах.
Таким образом, охарактеризованы биопрофили фекальных и клинических изолятов энтерококков, что позволило определить ведущие информативные признаки для эффективной дифференциации клинически значимых культур энтерококков от представителей нормальной микробиоты животных.
04.10.2017
Список литературы:
1. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологии / И.П. Ашмарин, А. А. Воробьёв. - Л.: Гос. изд. мед. лит. - 1962. -177 с.
2. Бондаренко, В.М. Симбиотические энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистической инфекции / В.М. Бонда-ренко, А.Н. Суворов. - М.: Медицина, 2007. - 30 с.
3. Бухарин, О.В. Способ определения антикарнозиновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, О.Л. Чернова, С.Б. Матюшина // Патент РФ № 2132879. - 1999. - № 19.
4. Бухарин, О.В. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, А.В. Валышев, Н.Н. Елагина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1997. - № 4. - С. 117-120.
5. Валышева, И.В. Генетическая характеристика вирулентного потенциала энтерококков кишечной микробиоты человека / И.В. Валышева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 4. - С. 44-47.
6. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов. - М.: Академия, 2005. - 608 с.
7. Пошвина, Д.В. Видовая характеристика и протеолитическая активность энтерококков / Д.В. Пошвина, М.В. Сычева // Вестник ветеринарии. - 2014. - № 2(69). - С. 40-43.
8. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.
9. Сычева, М.В. Способ дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных / М.В. Сычева, Н.Е. Щепитова, О.Л. Карташова [и др.] // Патент РФ № 2612141. - 2017. - Бюл. № 7.
10. Щепитова, Н.Е. Биологические свойства антагонистически активных энтерококков кишечной микрофлоры животных / Н.Е. Щепитова, М.В. Сычёва, О.Л. Карташова // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2014. - № 13. - С. 134-138.
11. Antimicrobial resistance and virulence traits in Enterococcus strains isolated from dogs and cats / R. Iseppi, P. Messi, I. Anacarso [et al.] // New Microbiol. - 2015. - Vol. 38(3). -P. 369-378.
12. Coburn, P.S. The Enterococcus faecalis cytolysin: a novel toxin active against eukaryotic and prokaryotic cells / P.S. Coburn, M.S. Gilmore // Cell Microbiol. - 2003. - Vol. 5 - No.10. - P. 661-669.
13. Development of Multiplex PCR for the detection of asa1, gelE, cylA, esp, and hyl genes in Enterococci and survey for virulence determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium / V. Vankerckhoven, T. Van Autgaerden, C. Vael [et al.] // Journal of Clinical Microbiology. - 2004. - No. 42. - P. 4473-4479.
14. Effects of Enterococcus faecalis for genes on production of gelatinase and a serine protease and virulence / X. Qin, K.V. Singh, G.M. Weinstock [et al.] // Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68. - P. 2579-2586.
15. Enterococcus faecalis clones in poultry and in humans with urinary tract infections, Vietnam / L.L. Poulsen, M. Bisgaard, N. Son [et al.] // Emerging Infectious Diseases. - 2012. - Vol. 18. - No. 7. - P. 1096-1100.
16. Gaggi'a, F. Probiotics and prebiotics in animal feeding for safe food production / F. Gaggi'a, P. Mattarelli, B. Biavati // Int. J. Food Microbiol. - 2010. - Vol. 141. - P. 15-28.
17. Kafil, H.S. Spread of Enterococcal Surface Protein in Antibiotic Resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis isolates from Urinary Tract Infections / H.S. Kafil, A.M. Mobarez // Open Microbiol. J. - 2015. - Vol. 26. - No. 9. - P. 14-17.
18. Keis, S. Characterization of a vancomycinresistant Enterococcus faecalis (VREF) isolate from a dog with mastitis: further evidence of a clonal lineage of VREF in New Zealand / S. Keis, J.M. Smith, G.M. Cook // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 13. - P. 3331-3333.
19. O'Toole, G.A. Biofilm formation as microbial development / G.A. O'Toole, H.B. Kaplan, R. Kolter // Annual Review of Microbiology. -2000. - No. 54. - P. 49-79.
20. Phenotypic and genotypic study of gelatinase and beta-haemolysis activities in faecal enterococci of poultry in Portugal / P. Poeta, D. Costa, N. Klibi [et al.] // J. Vet. Med. - 2006. - Vol. 53. - No. 5. - P. 203-208.
21. Pomba, C. Treatment of a lower urinary tract infection in a cat caused by a multi-drug methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius and Enterococcus faecalis / C. Pomba, N. Couto, A.J. Moodley // Feline Med. Surg. - 2010. - Vol. 12 - No. 10. - P. 802-806.
22. Screening of virulence determinants in Enterococcus faecium strains isolated from breast milk / C. Reviriego, T. Eaton, R. Martín [et al.] // Journal of Human Lactation. - 2005. - No. 21. - P. 131-137.
23. Virulence factors in food, clinical and reference enterococci: a common trait in the genus? / T. Semedo, M.A. Santos, M.F. Lopes [et al.] // Systematic and Applied Microbiology. - 2003. - No. 26. - P. 13-22.
24. Virulence traits and antibiotic resistance among enterococci isolated from Eurasian otter (Lutralutra) / T. Semedo-Lemsaddek, C.S. Nóbrega, T. Ribeiro [et al.] // Vet. Microbiol. - 2013. - Vol. 163. - No. 3-4. - P. 378-382.
25. Yuen, G.J. Enterococcus infection biology: Lessons from invertebrate host models / G.J. Yuen, F.M. Ausubel // J. Microbiol. -2014. - Vol. 52. - No. 3. - P. 200-210.
Сведения об авторах:
Кочкина Елена Евгеньевна, заведующий лабораторией молекулярно-генетических и бактериологических исследований кафедры микробиологии и заразных болезней факультета ветеринарной медицины Оренбургского государственного аграрного университета 460014 г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18, e-mail: alena-200838@mail.ru
Пашкова Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, кандидат биологических наук 460000 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, e-mail: pashkova070782@mail.ru
Сычёва Мария Викторовна, заведующий кафедрой микробиологии и заразных болезней факультета ветеринарной медицины Оренбургского государственного аграрного университета, доктор биологических наук, доцент 460014 г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18, e-mail: sycheva_maria@mail.ru
Карташова Ольга Львовна, заведующий лабораторией по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, доктор биологических наук, доцент 460000 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, e-mail: labpersist@mail.ru
