Научная статья на тему 'Скрининг штаммов энтерококков с целью разработки на их основе препаратов-пробиотиков'

Скрининг штаммов энтерококков с целью разработки на их основе препаратов-пробиотиков Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
552
98
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ENTEROCOCCUS SРP / АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ / ANTAGONISTIC ACTIVITY / БАКТЕРИОЦИНОГЕНИЯ / ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ / FACTORS OF VIRULENCE / ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИНФЕКЦИЯ / EXPERIMENTAL INFECTION / ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ / POLYMERASE CHAIN REACTION / ENTEROCOCCUS SPP / BACTERIOCIN PRODUCTION

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Щепитова Наталья Евгеньевна, Сычёва Мария Викторовна, Карташова Ольга Львовна

В условиях борьбы с антибиотикорезистентностью микроорганизмов особое значение приобретает поиск альтернативных традиционным антибиотикам противомикробных средств. Основой для новых антимикробных препаратов могут служить бактериоцины энтерококков. В связи с этим скрининг новых безопасных штаммов-продуцентов энтерококков для получения бактериоцинов является актуальным и перспективным направлением современной микробиологии. Проведён сравнительный анализ видового разнообразия бактерий рода Enterococcus, выделенных из кишечника здоровых животных разных видов. В популяции фекальных энтерококков установлена широкая распространённость антагонистической активности в отношении бактерий родов Listeria и Enterococcus, напрямую коррелирующая с наличием генов бактериоциногении. На модели экспериментальной инфекции показана возможность использования антагонистически активных энтерококков кишечного происхождения в качестве эффективного средства защиты от листериоза. На основании комплексной оценки фенотипических и генетических характеристик энтерококков, выделенных из кишечника здоровых животных, отобран штамм Enterococcus faecium, обладающий генетическими детерминантами бактериоциногении, выраженным антагонистическим эффектом в отношении листерий и не имеющий факторов вирулентности.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Щепитова Наталья Евгеньевна, Сычёва Мария Викторовна, Карташова Ольга Львовна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

SCRINNING OF ENTEROCOCCUS CULTURE TO CREATE PREPORATION OF PROBIOTIC ACTION

In the conditions of fight against an antibiotic resistance of microorganisms search of antimicrobic means alternative to traditional antibiotics is of particular importance. Bacteriocins of enterococci can form a basis for new antimicrobic preparations. In this regard screening of new safe strains producers of enterococci for receiving bacteriocins is the actual and perspective direction of modern microbiology. In the specific analysis of bacteria of the genus Enterococcus, defined from intestines of different animals species. In population of faecal enterococci the wide popularity of antagonistic activity regarding bacterias Listeria spp. and Enterococcus spp. which is correlative to the genes of bacteriocinogenia. On the model of experimental infection shows the use the protection effect of listerios defence by antoganistically active enterococci of intestines nature. On the basis of a complex assessment of phenotypic and genetic characteristics of enterococci isolated from intestines of healthy animals is selected strain Enterococcus faecium which is possessing genetic determinants of bacteriocinogenia, the expressed antagonistic effect against Listeria and not having virulence factors.

Текст научной работы на тему «Скрининг штаммов энтерококков с целью разработки на их основе препаратов-пробиотиков»

УДК 619:579

щепитова Н.Е.1, Сычёва м.В.12, Карташова о.Л.2

1Оренбургский государственный аграрный университет 2Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН E-mail: nschepitova@mail.ru

скрининг штаммов энтерококков с целью разработки на их основе препаратов-пробиотиков

в условиях борьбы с антибиотикорезистентностью микроорганизмов особое значение приобретает поиск альтернативных традиционным антибиотикам противомикробных средств. основой для новых антимикробных препаратов могут служить бактериоцины энтерококков. В связи с этим скрининг новых безопасных штаммов-продуцентов энтерококков для получения бактериоцинов является актуальным и перспективным направлением современной микробиологии.

Проведён сравнительный анализ видового разнообразия бактерий рода Enterococcus, выделенных из кишечника здоровых животных разных видов. В популяции фекальных энтерококков установлена широкая распространённость антагонистической активности в отношении бактерий родов Listeria и Enterococcus, напрямую коррелирующая с наличием генов бактериоциногении. На модели экспериментальной инфекции показана возможность использования антагонистически активных энтерококков кишечного происхождения в качестве эффективного средства защиты от листериоза.

На основании комплексной оценки фенотипических и генетических характеристик энтерококков, выделенных из кишечника здоровых животных, отобран штамм Enterococcus faecium, обладающий генетическими детерминантами бактериоциногении, выраженным антагонистическим эффектом в отношении листерий и не имеющий факторов вирулентности.

Ключевые слова: Enterococcusspp., антагонистическая активность, бактериоциногения, факторы вирулентности, экспериментальная инфекция, полимеразная цепная реакция

В поисках решения задачи по изысканию альтернативных традиционным антибиотикам средств, способных обеспечить борьбу с инфекционными агентами, возрос интерес к антимикробным субстанциям бактериального происхождения. Среди них особое место занимают бактериоцины - экскретируемые за пределы бактериальной клетки антимикробные пептиды, чаще всего катионной природы [6], [12], [23].

Явление бактериоциногении широко распространено среди представителей разных видов рода ЕШвгососсш [3]. Перспективным направлением является использование энтеро-цинов для терапии и профилактики инфекционной патологии, а также для биотехнологических целей в пищевой промышленности [25].

Учитывая вышеизложенное, поиск микроорганизмов-продуцентов бактериоцинов и изучение их биологических свойств представляется актуальным, что и определило цель настоящего исследования - скрининг антагонистически активных штаммов энтерококков и изучение их биологических свойств с целью разработки на их основе препаратов-пробиотиков.

Материалы и методы. В исследовании были изучены 162 штамма бактерий рода ЕМвго-соссш, выделенных из фекалий клинически здоровых сельскохозяйственных животных, в том числе 54 - из фекалий крупного рогатого скота;

21 штамм - из фекалий коз; 51 - из фекалий свиней и 36 культур - из фекалий лошадей.

Микроорганизмы выделяли с использованием классических бактериологических методик. Посев исследуемого материала осуществляли на жёлчно-эскулиновый агар с азидом натрия (HiMedia, Индия). При обнаружении характерного для энтерококков роста (образование коричнево-чёрного преципитата вокруг колоний) проводили пересев колоний на агар Шедлера (HiMedia, Индия).

Штаммы идентифицировали с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием известных прай-меров по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы [15]. Синтез праймеров осуществлен компанией «СИНТОЛ» (г. Москва). Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС» («Литех», Россия).

Факторы вирулентности - гемолитическую и желатиназную активности культур Enterococcus spp. определяли по методам М.О. Биргера (1982) [7].

Генетические детерминанты известных факторов вирулентности: цитолизины - cylA, cylB, cylM, желатиназа - gelE, сериновая про-теаза - sprE, гиалуронидаза - hyl, поверхностные белки, участвующие в адгезии - asa,

белки-иммуносупрессоры - esp, определяли с помощью ПЦР [11], [27], [29].

Наличие антагонистической активности у бактерий рода Enterococcus определяли чашечным методом по принципу отсроченного антагонизма [4]. В качестве тест-культур использовали патогенные и условно-патогенные бактерии: Listeria monocytogenes (n=8), L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, Staphylococcus aureus (n=5), Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis (n=5), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxitoca, Enterobacter cloacae, Moraxella mor-ganii и грибы рода Candida (n=5).

Гены, кодирующие синтез известных эн-тероцинов: энтероцин А - entA, энтероцин B -entB, энтероцин P - entP, энтероцин AS-48 - en-tAS-48, энтероцин L50A - entL50A, энтероцин L50B - entL50B, бактериоцин 31 - bac31, цитолизины - cylLs, cylLl, выявляли у энтерококков при помощи гнездовой ПЦР [14].

Изучение in vivo антагонистической активности энтерококков проводили на модели экспериментального листериоза. Для воспроизведения экспериментальной листериозной инфекции использовали беспородных морских свинок обоих полов массой 200-250 г. Все эксперименты с животными выполнены в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF), и декларацией о гуманном отношении к животным.

Животные были разделены на две равные группы: опытную (n=9) и контрольную (n=9). Животным опытной группы в течение 7 дней до заражения задавали один раз в сутки per os по 1 мл взвеси суточной культуры энтерококков в изотоническом растворе NaCl, содержащей 1-109 микробных клеток.

Для заражения животных обеих групп использовали экспоненциальную культуру L. monocytogenes VIMHA 004, отмытую фосфатным буфером и замороженную при -70 °С в 10%-ном глицерине. Концентрацию колони-еобразующих единиц (КОЕ) в замороженной культуре определяли предварительно по высевам последовательных разведений. Заражение осуществляли введением per os штамма в дозе 1-1010 бактерий на морскую свинку.

Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 24 ч, 3 и

5 суток инфекции. Для оценки обсемененности органов L. monocytogenes в асептических условиях морских свинок вскрывали и стерильно отбирали внутренние органы: печень с желчным пузырем, целиком селезенку, участок тонкого кишечника длиной 20 мм.

Для бактериологического исследования образцы органов взвешивали, гомогенизировали в фарфоровых ступках со стерильным песком в PBS-буфере (Хеликон, Россия) в соотношении 1:2. Суспензию органов вносили в количестве 1 мл на чашки с агаром для идентификации ли-стерий (PALCAM) (HiMedia, Индия), растирали шпателем Дригальского и инкубировали при 30 °С в течение 48 ч. При обнаружении характерного для листерий роста (серо-зелёные колонии с тёмным центром и тёмным ореолом) проводили микроскопию, подсчитывали число выросших колоний, рассчитывали содержание листерий в 1 г органа.

Полученные в ходе исследований данные были обработаны статистически [1].

Результаты и обсуждение

С использованием метода полимеразной цепной реакции были идентифицированы культуры энтерококков, выделенные из фекалий сельскохозяйственных животных. Так, 45 выделенных штаммов (27,8%) были отнесены к виду Enterococcusfaecium, 39 культур (24,1%) - к виду Enterococcus hirae, 36 изолятов (22,2%) - к виду Enterococcus durans, 21 штамм (12,9%) - к виду Enterococcus faecalis, 15 штаммов (9,3%) - к виду Enterococcusflavescens, 6 культур (3,7%) - к виду Enterococcus casseliflavus (рис. 1).

Видовой состав энтерококков, выделенных из фекалий свиней, характеризовался большим разнообразием (рис. 2). В 53,0% случаев выделялись штаммы E. faecium, в 35,4% случаев -штаммы E. hirae. По три культуры энтерококков было идентифицировано как E. durans (5,8%) и E. casseliflavus (5,8%). Энтерококки микрофлоры фекалий лошадей были представлены видами E. faecium (50,0%), E. hirae (25,0%), E. flavescens (16,7%) и E. casseliflavus (8,3%). Среди культур, изолированных из фекалий крупного рогатого скота, большинство штаммов относились к видам E. durans (61,1%) и E. faecalis (33,4%). В трёх случаях был выделен штамм E. flavescens (5,5%). Изоляты энтерококков из

фекалий коз в 71,4% случаев принадлежали к виду E. hirae, по три изолята (14,3%) - к видам Е. flavescens и E. faecalis.

На следующем этапе работы были изучены некоторые факторы патогенности энтерококков кишечной микрофлоры животных. В результате проведённых исследований нами было установлено, что на фенотипическом уровне Enterococcus spp. не обладали гемолитической и желатиназной активностями.

Молекулярно-генетический анализ не выявил в популяции фекальных изолятов энтерококков генетических детерминант известных факторов вирулентности: cylA, cylB, cylM- цитолизинов, gelE - желатиназы, sprE - сериновой протеазы, hyl - гиалуронидазы, asa - поверхностных белков, участвующих в адгезии.

При исследовании антагонистической активности энтерококков установлено, что 37,0±3,79% выделенных культур подавляли рост вирулентных штаммов Enterococcus faecalis и бактерий рода Listeria. В отношении остальных культур коллекции микроорганизмов антагонистическая активность бактерий рода Enterococcus не выявлена.

Антагонистически активные изоляты энтерококков принадлежали к видам E. faecium (30 штаммов), E. durans (24 штамма) и E. flavescens (6 штаммов). Среди культур вида E. faecium доля антагонистически активных штаммов составила 66,6±7,03%, среди E. durans - 66,6±7,86%, среди E. flavescens - 40,0±12,64%.

Коэффициент антагонистической активности культур E. faecium в отношении бактерий Listeria monocytogenes составил 7,0±0,42, штаммов E. durans - 6,8±0,41, изолятов E. flavescens - 6,7±1,55 (рис. 3). Рост L. innocua более эффективно подавляли штаммы E. faecium, чем культуры E. durans (р<0,05). Среднее значение коэффициента антагонистической активности для изолятов вида E. faecium составило 7,8±0,36, для E. durans - 6,5±0,34, для E. flavescens - 7,4±2,22.

По отношению к L. ivanovii максимальный антимикробный эффект проявляли штаммы E. faecium (р<0,001). Коэффициент антагонистической активности энтерококков варьировал от 5,0±1,57 у культур E. flavescens и 5,2±0,45 у штаммов E. durans до 8,5±0,17 у изолятов E. faecium.

9,3 %

3,7 %

12,9 %

22,2 %

27,8 %

24,1 %

RE. faecium ME. hirae UE.durans üE.faecalis ■ E. flavescens UE. casseliflavus

Рисунок 1. Видовой состав фекальных изолятов энтерококков

Рисунок 2. Видовой состав фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных разных видов

Примечание: * - достоверность различий выраженности антагонистической активности культур E. faecium по сравнению с культурами E. durans - (р<0,05); *** - достоверность различий выраженности антагонистической активности культур E. faecium по сравнению с культурами видов E. durans и E. flavescens (р<0,001).

Рисунок 3. Выраженность антагонистической активности культур энтерококков в отношении Listeria spp. и Enterococcus faecalis

Наибольшей антилистериозной активностью по отношению к I. зее^еп обладали штаммы Е. йытаж (коэффициент активности 7,1±0,44), в меньшей степени ингибировали рост листерий изоляты Е. /аесшт (коэффициент активности 6,9±0,35). Минимальным значением коэффициента антагонистической активности (5,2±1,37) характеризовались штаммы Е. flavescens.

В отношении вирулентных штаммов Еп-1егососсж /аесаШ энтерококки обладали менее выраженным антагонизмом, чем к листериям, со средним значением коэффициента антагонистической активности: 6,2±0,37 для Е. /аесшт, 5,1±0,35 для Е. йигат и 5,4±0,82 для Е. /1ауе-зсет. Активность штаммов Е. /аесшт была достоверно выше по сравнению с культурами Е. йитаж (р<0,05).

Изучение изолятов энтерококков на наличие генетических детерминант бактериоцино-гении показало, что 69 культур (42,5±3,88%) обладали тем или иным геном, кодирующим синтез энтероцинов. При этом наблюдалась прямая корреляция (г=0,891) между наличием генов бактериоциногении и проявлением антагонистической активности (р<0,001).

Генетические детерминанты бактериоциногении были обнаружены у штаммов энтерококков трёх видов: Е./аес1ит, Е. durans и Е.

Аауезоет (рис. 4).

%

1

1

1

**

- I

1 1 1

1 7 ' 1 j i

й, 1 ■ 1 1

£ 9 # £ ** £ $ ^ £ £ & f

ПЕ./аеаит ЯЕ.йигат ШЕ-Дауевеет

Примечание: гены кодируют: еПА - энтероцин А, еПВ -энтероцин В, еПР - энтероцин Р, Ьас31- бактериоцин 31, еп1Ь50А - энтероцин L50A, еп1Ь50В - энтероцин L50B, entAS-48 - энтероцин AS-48, cylLs и суЮ - литические компоненты цитолизина. *** - достоверность различий частоты встречаемости генов энтероцинов среди культур Е. faecium, по сравнению с культурами Е. ёигаш - (р<0,001).

Рисунок 4. Распространённость генов бактериоциногении в популяции фекальных изолятов энтерококков

Наиболее разнообразный спектр генов бактериоциногении представлен у штаммов E. faecium. Энтерококки, содержащие в геноме несколько генов бактериоциногении (три и более), принадлежали к видам E. faecium и Е. fla-vescens. В геноме двух штаммов E. faecium и Е. flavescens были выявлены комплексы генов продукции энтероцинов (entA, entP, entL50A, entL50B). Штамм E. faecium, изолированный из фекалий лошади, обладал набором из пяти генов энтероцинов (entA, entP, bac31, entL50A, entL50B).

На следующем этапе работы нами была предпринята попытка изучения антагонистической активности энтерококков in vivo на модели экспериментальной листериозной инфекции.

В качестве штамма-антагониста была выбрана культура Enterococcus faecium E/79OSAU, изолированная из кишечника свиньи, обладающая выраженным антагонистическим эффектом в отношении бактерий рода Listeria in vitro и не имеющая факторов патогенности на фено- и генотипическом уровне.

В ходе проведённых исследований установлено, что заражение морских свинок культурой L. monocytogenes VIMHA 004 вызывает развитие инфекции, сопровождающейся гибелью 33,3% животных контрольной группы. Через сутки после инфицирования погибли две морские свинки, через пять суток пало еще одно животное контрольной группы. В опытной группе гибель животных от листериозной инфекции не наблюдали.

Этим данным соответствовали и результаты определения показателя микробной обсеменён-ности (КОЕ/г) внутренних органов у животных исследуемых групп. Количество листерий в органах морских свинок, получавших культуру энтерококков, на третьи и пятые сутки инфекции было достоверно меньше, чем в органах животных контрольной группы (рис. 5).

В обсеменённости листериями селезёнки морских свинок опытной и контрольной групп наблюдалась тенденция к первоначальному увеличению числа бактерий в органе к третьим суткам инфекции с последующим уменьшением количества листерий к последнему дню эксперимента. Спустя 24 часа, бактерии рода Listeria из селезёнки животных обеих групп не выделялись. Через трое суток после инфициро-

вания, концентрация листерий в селезёнке животных опытной группы достигала 244,0±20,72 КОЕ/г, что в среднем в 1,3 раза меньше таковой в контрольной группе (р<0,05). В опытной группе морских свинок количество листерий в селезёнке на пятые сутки течения инфекции было достоверно ниже (26,0±7,42 КОЕ/г), чем в контрольной группе (184,0±16,04 КОЕ/г) (р<0,001).

Аналогичную тенденцию наблюдали при изучении результатов посевов ткани печени: через сутки после инфицирования концентрация листерий в органе животных контрольной группы достигала 2,0±0,50 КОЕ/г, обсеменён-ность L. monocytogenes VIMHA 004 печени животных опытной группы к третьим суткам инфекции составила 236,0±17,45 КОЕ/г против 279,0±12,16 КОЕ/г в контрольной группе. На пятые сутки от момента заражения в опытной группе животных отмечалось достоверное снижение количества листерий в печени (9,0±1,83 КОЕ/г) по сравнению с контролем (1305,0±21,67 КОЕ/г) (р<0,001).

Концентрация листерий в кишечнике и его содержимом у животных обеих групп возрастала с течением времени. При этом степень обсеменённости листериями кишечника и его содержимого у морских свинок на третьи и пятые сутки инфекции была ниже в опытной группе животных (р<0,05). Количество L. monocytogenes VIMHA 004 в кишечнике и

его содержимом у животных опытной группы через 24 часа от момента инфицирования достигало 140,0±11,50 КОЕ/г (в контрольной группе - 180,0±20,05 КОЕ/г). На третьи сутки инфекционного процесса в кишечнике и его содержимом у животных, получавших культуру энтерококков, число листерий составило 377,0±7,24 КОЕ/г, в контрольной группе -407,0±8,71 КОЕ/г; на пятые сутки аналогичные показатели для опытной и контрольной групп составили 1600,0±54,80 и 1796,0±39,76 КОЕ/г, соответственно.

Таким образом, в результате проведённого исследования выявлена способность штамма Enterococcus faecium Ef79OSAU снижать летальность и микробную обсеменённость внутренних органов при экспериментальной листери-озной инфекции у морских свинок.

Заключение. Анализ результатов проведённых исследований позволил выявить различия видового состава энтерококков фекальной микрофлоры продуктивных животных: энтерококки фекалий моногастричных животных характеризовались большим разнообразием видов, чем у жвачных. Доминирующим видом у полигастричных животных являлся E. durans, у лошадей и свиней - E. faecium. Изоляты вида E. faecalis были обнаружены только в кишечном биотопе жвачных животных.

В настоящее время отсутствует единое мнение относительно доминирования опреде-

Примечание: * - достоверность различий уровня обсеменённости листериями внутренних органов морских свинок в опытной и контрольной группе животных - (р<0,05); *** - (р<0,001).

Рисунок 5. Показатели микробной обсеменённости L. monocytogenes VIMHA 004 внутренних органов морских свинок опытной и контрольной групп: А - селезёнка, Б - печень, В - кишечник и его содержимое

лённых видов энтерококков в кишечном биотопе животных. Некоторые авторы указывают, что основными представителями энтерококков в кишечнике крупного рогатого скота, свиней и лошадей являются E. faecium [9], другие - E. faecalis [24], третьи - E. hirae [17]. Предположительно, данные различия могут быть связаны с особенностями рациона и содержания животных в различных регионах. Кроме того, в более ранних работах идентификация энтерококков проводилась на основании биохимических тестов, которые не всегда дают верный результат при исследовании близкородственных видов Enterococcus spp. [2], в то время как используемый в нашей работе молекулярно-генетический метод позволяет говорить о более высокой точности результатов идентификации.

Одним из важнейших этапов изучения выделенных культур энтерококков стало выявление возможных факторов патогенности. Известно, что наличие факторов вирулентности у представителей группы потенциально-патогенных микроорганизмов играет ведущую роль в развитии инфекционного процесса [5]. В ходе проведённых исследований нами установлено, что культуры Enterococcus spp. не обладали гемолитической и желатиназной активностями на фенотипическом уровне.

В результате молекулярно-генетического исследования в популяции фекальных изолятов энтерококков нами не обнаружено генетических детерминант известных факторов вирулентности (cylA, cylB, cylM - цитолизинов, gelE -желатиназы, sprE - сериновой протеазы, hyl -гиалуронидазы, asa - поверхностных белков, участвующих в адгезии).

Данные об отсутствии в геноме фекальных энтерококков, выделенных от животных, генетических детерминант факторов вирулентности отличаются от имеющихся в литературе. Так, Qin X. et al. (2001) обнаружили в геноме штаммов Enterococcus faecalis OG1RF гены gelE и sprE, кодирующие желатиназу и сериновую протеазу [8]. В исследованиях C. Sabia et. al. (2007) и F. Biavasco (2007) установлено, что ген, обуславливающий протеолитическую активность (gelE) содержат 50% культур Enterococcus spp., выделенных из кишечника животных, причём 11% штаммов обладают желатиназной активностью на уровне фенотипа

[10, 28]. По данным Poeta P. et al. (2006), культуры Enterococcus spp. фекальной микрофлоры птиц характеризуются наличием генов cyl-оперона (cylA, cylB, cylM) и проявляют ß-гемолитическую активность [22].

Отсутствие факторов вирулентности у изученных фекальных культур энтерококков предполагает безопасность их использования в качестве основы пробиотических препаратов и заквасок прямого внесения.

Важным этапом исследования биологических свойств энтерококков микрофлоры фекалий животных является изучение антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

В популяции фекальных энтерококков установлена широкая распространённость генов бактериоциногении (что согласуется с данными K. Nigütova et al. (2005), V. Strompfova et al. (2008)), напрямую коррелирующая с наличием антилистериозной активности и активностью в отношении вирулентных изолятов вида E. faecalis. Выявленная закономерность находит подтверждение в работах W. Theppangna et al. (2007) и G.B. Özdemir et al. (2011), которые охарактеризовали спектр антимикробной активности наиболее часто встречающихся у штаммов Enterococcus spp. бактериоцинов А и Р. Названные энтероцины ингибируют рост Listeria spp., Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Enterococcus spp., Carnobacterium spp., Leuconostoc spp, Lactococcus spp., Clostridium spp. и выявляются практически в одинаковом проценте случаев.

На следующем этапе работы на основании комплексной оценки фенотипических и генетических характеристик энтерококков, выделенных из кишечника здоровых животных, мы отобрали из коллекции культур штамм Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий генетическими детерминантами бактериоциногении (entP, entL50A, entL50B), выраженным антагонистическим эффектом в отношении листерий и не имеющий факторов вирулентности, и попытались оценить, как модифицируется его биологическая активность в условиях макроорганизма на модели экспериментальной листериозной инфекции морских свинок. В ходе аналитической работы с полученными данными была установ-

лена способность штамма E. faecium Ef79O-SAU снижать летальность и микробную обсеменённость внутренних органов при экспериментальном листериозе морских свинок, причём энтерококки не столько препятствовали колонизации кишечника и проникновению листерий во внутренние органы, сколько способствовали более быстрой элиминации L. monocytogenes VIMHA 004 из внутренних органов. Возможным объяснением эффективной элиминации возбудителя является индуцирование молочнокислыми бактериями экспрессии генов хемокинов макрофагами, что способствует привлечению в инфицированный

орган иммунокомпетентных клеток (моноцитов, NK-клеток, ТЫ-клеток) [16], [18]. Кроме того, показано, что энтерококки повышают концентрацию в сыворотке крови оксида азота (II) и воспалительных цитокинов (ИЛ-ф, ФНО-а), что также приводит к быстрой элиминации возбудителя из внутренних органов [13].

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования штамма E. faecium Ef79OSAU в качестве эффективного средства защиты от листериоза. На культуру E. faecium Ef79OSAU получен патент РФ на изобретение № 2571852.

18.09.2015

Список литературы:

1. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологии / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьёв. - Л.: Гос. изд. мед. лит. - 1962. -

177 с.

2. Гармашева, И.Л. Идентификация и таксономия энтерококков / И.Л. Гармашева, Н.К. Коваленко // Мжробюл. журн. - 2010. -

Т. 72. - № 5. - С. 49-58.

3. Ермоленко, Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы. Обзор литературы / Е.И. Ермоленко // Вестн.С.-

Петерб. ун-та. - 2009. - Сер. 11. - Вып. 3. - С. 184-201.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4. Кудлай, Д.Г. Бактериоциногения / Д.Г. Кудлай, В.Г. Лиходед. - М.: Медицина, 1966. - 203 с.

5. Литвин, В.Ю. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде / В.Ю. Литвин, В.Н. Пушкарева // Журнал

микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1994. - Приложение. - С. 83-87.

6. Похиленко, В.Д. Бактериоцины, их биологическая роль и тенденции применения / В.Д. Похиленко, В.В. Перелыгин // Электрон-

ный научный журнал «Исследовано в России». - 2011. - С. 164-198. URL: http://zhurnal.ape.relam.ru/articles/2011/016.pdf.

7. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. - М.: Медицина,

1982. - 464 с.

8. Characterization of fsr, a regulator controlling expression of gelatinase and serine protease in Enterococcus faecalis OG1RF / X. Qin,

K.V. Singh, G.M. Weinstock [et al.] // J. Bacteriol. - 2001. - Vol. 183. - No. 11. - P. 3372-3382.

9. Contamination of milk by enterococci and coliforms from bovine faeces / D.M. Kagkli, M. Vancanneyt, P. Vandamme [et al.] // J.

Appl. Microbiol. - 2007. - Vol. 103. - No. 5. - P. 1393-1405.

10. Detection of bacteriocin production and virulence traits in vancomycin-resistant enterococci of different sources / C. Sabia, S. de

Niederhausern, E. Guerrieri [et al.] // Journal of Applied Microbiology. - 2008. - No. 104. - P. 970-979.

11. Development of Multiplex PCR for the detection of asa1, gelE, cylA, esp, and hyl genes in Enterococci and survey for virulence

determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium / V. Vankerckhoven, T. Van Autgaerden, C. Vael [et al.] // Journal of Clinical Microbiology. - 2004. - No. 42. - P. 4473-4479.

12. Identification, characterization, and three-dimensional structure of the novel circular bacteriocin, enterocin NKR-5-3B, from Entero-

coccus faecium / K. Himeno, K.J. Rosengren, T. Inoue [et al.] // Biochemistry. - 2015. - Vol. 54. - No. 31. - P. 4863-4876.

13. Immunomodulatory properties of Enterococcus faecium JWS 833 isolated from duck intestinal tract and suppression of Listeria

monocytogenes infection / H.J. Choi, M.S. Shin, S.M. Lee [et al.] // Microbiology and Immunology. - 2012. - Vol. 56. - No. 9. - P. 613-620.

14. Isolation and biochemical characterisation of enterocins produced by enterococci from different sources / M.R. Foulquie Moreno, R.

Callewaert, B. Devreese [et al.] // Journal of Applied Microbiology. - 2003. - No. 94. - P. 214-229.

15. Jackson, C.R. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci / C.R. Jackson, P.J. Fedorka-Cray,

J.B. Barrett // Journal of Clinical Microbiology. - 2004. - Vol. 42. - No. 8. - P. 3558-3565.

16. Lactobacilli and streptococci induce inflammatory chemokine production in human macrophages that stimulates Th1 cell chemotaxis /

V. Veckman, M. Miettinen, S. Matikainen [et al.] // J. Leukoc. Biol. - 2003. - Vol. 74. - P. 395-402.

17. Molecular characterization and antibiotic resistance of Enterococcus species from gut microbiota of Chilean Altiplano camelids / K.

Guerrero-Olmos, J. Baez, N. Valenzuela et al. // Infect. Ecol. Epidemiol. [electronic journal]. - 2014. - Vol. 4.

18. Monoassociation with probiotic Lactobacillus delbrueckii UFV-H2b20 stimulates the immune system and protects germfree mice

against Listeria monocytogenes infection / L.M. dos Santos, M.M. Santos, H.P. de Souza Silva [et al.] // Med. Microbiol. Immunol. - 2011. - Vol. 200. - No. 1. - P. 29-38.

19. Nigütova, K. Bacteriocin-like activity production and resistance in selected enterococci and streptococci of animal origin / K. Nigü-

tova, P. Pristas, P. Javorsky // Archives Animal Nutrition. - 2005. - Vol. 59. - No. 3. - P. 205-211.

20. Occurrence of the structural enterocin A, P, B, L50B genes in enterococci of different origin / V. Strompfova, A. Laukova, M. Si-

monova [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2008. - Vol. 132. - No. 3. - Р. 293-301.

21. Özdemir, G.B. Phenotypic and genotypic characterization of bacteriocins in enterococcal isolates of different sources / G.B. Özdemir,

E. Oryajin, H.H. Biyik [et al.] // Indian Journal of Microbiology. - 2011. - Vol. 51. - No. 2. - P. 182-187.

22. Phenotypic and genotypic study of gelatinase and beta-haemolysis activities in faecal enterococci of poultry in Portugal / P. Poeta,

D. Costa, N. Klibi [et al.] // J. Vet. Med. - 2006. - Vol. 53. - No. 5. - P. 203-208.

23. Popaganni, M. Ribosomally synthezed peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications /

M. Popaganni // Biotechnol. Adv. - 2003. - Vol. 21. - No. 6. - P. 465-499.

24. Resolution of phenotypically distinct strains of Enterococcus spp. in a complex microbial community using cpn60 universal target

sequencing / C.J. Vermette, A.H. Russell, A.R. Desai [et al.] // Microb. Ecol. - 2010. - Vol. 59. - No. 1. - P. 14-24.

25. Safety and technological properties of bacteriocinogenic enterococci isolates from Tunisia / I. Jaouani, M.S. Abbassi, S.C. Ribeiro

[et al.] // J. Appl. Microbiol. - 2015. - Vol. 119. - No. 4. - P. 1089-1100.

26. Screening of the enterocin genes and antimicrobial activity against pathogenic bacteria in Enterococcus strains obtained from different

origins / W. Theppangna, T. Murase, N. Tokumaru [et al.] // J. Vet. Med. Sci. - 2007. - Vol. 69. - No. 12. - P. 1235-1239.

27. Screening of virulence determinants in Enterococcus faecium strains isolated from breast milk / C. Reviriego, T. Eaton, R. Martin

[et al.] // Journal of Human Lactation. - 2005. - No. 21. - P. 131-137.

28. VanA-type enterococci from humans, animals, and food: species distribution, population structure, Tn1546 typing and location,

and virulence determinants / F. Biavasco, G. Foglia, C. Paoletti [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2007. - Vol. 73. - No. 10. - P. 3307-3319.

29. Virulence factors in food, clinical and reference enterococci: a common trait in the genus? / T. Semedo, M.A. Santos, M.F. Lopes

[et al.] // Systematic and Applied Microbiology. - 2003. - No. 26. - P. 13-22.

Сведения об авторах:

Щепитова Наталья Евгеньевна, заведующая лабораторией молекулярно-генетических и бактериологических исследований кафедры микробиологии и заразных болезней факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета 460014 г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18, e-mail: nschepitova@mail.ru

Сычёва Мария Викторовна, заведующая кафедрой микробиологии и заразных болезней факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета,

кандидат биологических наук, доцент, 460014 г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18, e-mail: sycheva_maria@mail.ru

Карташова Ольга Львовна, заведующая лабораторией по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН,

доктор биологических наук, доцент 460795 г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, e-mail: labpersist@mail.ru

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.