CC BY
93
УДК 619:579
Щепитова Н.Е.1, Сычёва М.В.12, Карташова О.Л.2
1Оренбургский государственный аграрный университет 2Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения
Росскийской академии наук E-mail: nschepitova@mail.ru
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЭНТЕРОКОККОВ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЖИВОТНЫХ
Определен видовой состав энтерококков кишечной микрофлоры продуктивных животных. Выявлено наличие внутриродовой и антилистериозной антагонистической активностей у штаммов Enterococcus sp. В популяции фекальных энтерококков установлена широкая распространенность генов бактериоциногении и отсутствие генетических детерминант вирулентности.
Ключевые слова: Enterococcus sp., антагонистическая активность, бактериоциногения, факторы вирулентности, полимеразная цепная реакция.
Введение
Бактерии рода Enterococcus являются представителями нормальной микрофлоры пищеварительного тракта млекопитающих, участвующими в поддержании колонизационной резистентности биотопа. Для выживания в этой сложной экосистеме они продуцируют ряд биологически активных веществ, в том числе бак-териоцины (энтероцины) [18], с успехом конкурируя с другими микроорганизмами.
Интерес учёных к микроорганизмам-продуцентам бактериоцинов определяется свойствами данной группы соединений: широким спектром антимикробного действия [10]; активностью в отношении бактериальных патогенов в наномолярных концентрациях [16]; медленным развитием резистентности к бактериоци-нам у микроорганизмов [19]; индукцией иммунных реакций макроорганизма, повышающих его неспецифическую резистентность к инфекционным агентам [6]. Учитывая вышеизложенное, поиск микроорганизмов-продуцентов бак-териоцинов и изучение их биологических свойств представляется актуальным, что и определило цель настоящего исследования - изучить биологические свойства антагонистически активных энтерококков фекальной микрофлоры животных.
Материалы и методы
В исследовании использована 51 культура энтерококков, выделенных из фекалий клинически здоровых сельскохозяйственных животных. Из них - 18 штаммов из фекалий крупного рогатого скота, 16 штаммов - из фекалий свиней, 10 штаммов - из фекалий лошадей и 7 штаммов - из фекалий коз.
Выделение микроорганизмов проводили классическим бактериологическим методом. Посев исследуемого материала осуществляли на жёлчно-эскулиновый агар с азидом натрия (HiMedia, Индия). При обнаружении характерного для энтерококков роста (образование коричнево-черного преципитата вокруг колоний) проводили пересев колоний на агар Шедлера (HiMedia, Индия).
Штаммы идентифицировали с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием известных праймеров по видоспецифическим генам, кодирующим синтез супероксиддисмутазы [13]. Синтез праймеров осуществлен компанией «СИНТОЛ» (г. Москва). Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС» («Литех», Россия).
Антагонистическую активность изучали чашечным методом (принцип отсроченного антагонизма) [3]. В качестве тест-культур использовали патогенные и условно-патогенные микроорганизмы: Listeria monocytogenes (n=8), L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, Staphylococcus aureus (n=5), вирулентные штаммы Enterococcus faecalis (n=5), Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter cloacae, Moraxella morganii и грибы рода Candida (n=5).
Факторы вирулентности определяли бактериологическими методами: гемолитическую активность - чашечным методом, желатиназ-ную - по разжижению столбика желатины [4].
При помощи ПЦР-анализа у энтерококков определяли гены, кодирующие синтез известных энтероцинов: энтероцин А - entA, энтеро-цин B - entB, энтероцин P - entP, энтероцин
AS-48 - entAS-48, энтероцин L50A - entL50A, эн-тероцин L50B - entL50B, бактериоцин 31 - bac31, цитолизин - Cyl [12], а также факторов вирулентности: цитолизины - CylA, CylB, CylM, CylLl, CylLs, желатиназа - GelE, сериновая про-теаза - sprE, гиалуронидаза - HYL, поверхностные белки, участвующие в адгезии - ASA, бел-ки-иммуносупрессоры - Esp [8], [17], [21].
Полученные в ходе исследований данные были обработаны статисти-чески [1].
Результаты и обсуждение
В результате идентификации, проведенной с помощью мультиплексной ПЦР, 13 выделенных штаммов (25,5%) были отнесены к виду Enterococcus hirae, по 12 штаммов (23,5%) -к видам E. faecium и E. durans, 7 штаммов (13,8%) -к виду Е. faecalis, 5 штаммов (9,8%) - к виду Е. flavescens, 2 культуры (3,9%) - к виду Е. casseliflavus (рис. 1).
Видовой состав энтерококков, выделенных из фекалий свиней, характеризовался большим разнообразием. В 50,0% случаев выделялись штаммы E. faecium, в 37,4% случаев - штаммы E. hirae. По одной культуре энтерококков было идентифицировано как E. casseliflavus (6,3%) и E. durans (6,3%). Среди культур, изолированных из фекалий крупного рогатого скота, большинство штаммов относились к видам E. durans (61,1%) и E. faecalis (33,4%). В единичном случае был выделен штамм E. flavescens (5,5%). Видовой состав энтерококков микрофлоры фекалий лошадей был представлен видами E. faecium (40,0%), E. flavescens (30,0%), E. hirae (20,0%) и E. casseliflavus (10,0%). Изоляты энтерококков из фекалий коз в 71,4% случаев принадлежали к виду E. hirae, по одному изоляту (14,3%) - к видам Е. flavescens и E. faecalis (14,3%).
При исследовании антагонистической активности энтерококков установлено, что 39,2±6,83% выделенных культур подавляли рост вирулентных штаммов Enterococcus sp. и бактерий рода Listeria, из них 50,0% относились к виду E. faecium, 40,0% - Е. durans и 10,0% - Е. flavescens (рис. 2).
Среди штаммов вида E. faecium 10 культур (83,0%) проявили антимикробную активность, среди изолятов Е. durans - 8 (66,6%); среди штаммов Е. flavescens - 2 (40%).
Антагонистическая активность в отношении остальных культур коллекции не выявлена.
Культуры энтерококков-антагонистов были изолированы в одинаковом проценте случаев из фекалий свиней и крупного рогатого скота (13,7±4,81%), в меньшем проценте случаев (11,7±4,50%) - из фекалий лошадей, в то время как штаммы Enterococcus sp. фекальной микрофлоры коз антагонистической активностью не обладали.
Коэффициент антагонистической активности культур E. faecium в отношении патогенных бактерий рода Listeria составил 7,19±0,20, штаммов Е. durans - 5,12±0,33, изолятов Е. flavescens -8,3±1,10. В отношении вирулентных штаммов E. faecalis энтерококки проявляли менее выраженный антагонизм, чем к листериям, со средним значением коэффициента антагонистической активности: 6,2±0,33 для E. faecium, 5,0±0,27 для Е. durans и 6,9±0,91 для Е. flavescens.
Высокий уровень антагонистической активности (>7) зарегистрирован у энтерококков по отношению к тест-штаммам L. innocua, L. ivanovii и вирулентным изолятам вида E. faecalis.
На следующем этапе работы были охарактеризованы некоторые факторы вирулентности энтерококков кишечной микрофлоры живот-
3.90 o
>lTl №вН \ 25.5"«
□ Е Iraní \ OF/ш'/iiini
i ПЕ (Imam Я dEJiwcaln 1 ШЕ. flm'escens
casseUflwns
23.5» о
Рисунок 1. Видовой состав фекальных изолятов энтерококков
неактивные Е. faecium
штаммы 50,0%
10,0%
Рисунок 2. Распространенность и видовой состав антагонистически активных штаммов в популяции фекальных энтерококков
ных. В результате проведенных исследований установлено, что на фенотипическом уровне ЕпЬвтососст Бр. не обладали гемолитической и желатиназной активностями.
При проведении молекулярно-генетичес-ких исследований гены, кодирующие синтез известных факторов вирулентности, в популяции антагонистически активных энтерококков также выявлены не были.
Исследование изолятов энтерококков на наличие генов бактериоциногении показало, что 20 культур (39,2±6,83%) обладали тем или иным геном, кодирующим синтез энтероцинов. При этом наблюдалась прямая корреляция (г=0,9) между наличием генов бактериоциноге-нии и проявлением антагонистической активности (р<0,001).
Установлено, что наиболее распространенным геном бактериоциногении в геноме антагонистически активных энтерококков являлся ген впЬА (рис. 3). Данной генетической детерми-нантой обладали 70,0±14,49% штаммов Е. /австш, 75,0±15,30% изолятов Е. йитт и 50,0±35,35% культур Е. /¡аьвзсвт (1 штамм).
Гены, кодирующие синтез энтероцинов В и Р встречались в примерно одинаковом проценте случаев - в 45,0±11,12% и 50,0±11,18%, соответственно. Среди культур вида Е. faвcium гены впЬВ и впЬР зарегистрированы у 6 штаммов (60,0±15,49%). В геноме штаммов Е. йитат данные гены обнаружены у 37,5±17,11% изолятов.
Ген, ответственный за синтез энтероцина Р выявлен у одной культуры Е. Ааьвэсвт.
Наиболее редко встречающимися генетическими детерминантами бактериоциногении являлись гены Ьас31, вМЬ50А и вМЬ50Б. Частота их обнаружения в популяции энтерококков-антагонистов, по сравнению с геном впА, была в 3,5-7 раз ниже (р<0,001). Геном Ьас31 обладали 2 штамма Е^азсшт (20,0±12,64%). У 30,0±14,49% изолятов Е. faвcium и 50,0±35,35% культур Е. Ааувзсвт зарегистрированы гены вп1Ь50А и вп1Ь50Б.
Гены, кодирующие синтез энтероцина АБ-48 и Су1, не были обнаружены.
Энтерококки, содержащие в геноме несколько генов бактериоциногении (3 и более), принадлежали к видам Е. faвcium и Е. /Наувзсвт. В геноме одного штамма Е. Ааьвзсвт был выявлен комплекс генов продукции энтероцинов (впА, впР, вМЬ50А, вп&50Б). Штамм Е. faвcium, изолированный из фекалий лошади, обладал набором из пяти генов энтероцинов (впА вп£Р, Ьас31, вМЬ50А, пЬ50Б) и проявлял максимальный антагонизм в отношении тест-культур.
Заключение
Анализ полученных данных позволил выявить различия видового состава энтерококков фекальной микрофлоры продуктивных животных: энтерококки фекалий моногастричных животных характеризовались большим разнообразием видов, чем у жвачных. Доминирую-
Примечание. * - достоверность различий частоты встречаемости генов в популяции антагонистически активных энтерококков (р<0,001)
Рисунок 3. Распространность генов бактериоциногении в популяции антагонистически
активных энтерококков
щим видом у полигастричных животных являлся E. durans, у лошадей и свиней - E. faecium. Изоляты вида E. faecalis были обнаружены только в кишечном биотопе жвачных животных, в то время как некоторые авторы указывают, что данный вид энтерококков, наряду с E. faecium и E. hirae, часто встречается в кишечнике не только крупного рогатого скота, коз, а также свиней и лошадей [9]. Предположительно, данные различия могут быть связаны с особенностями рациона и содержания животных в различных регионах. Возможно, в более ранних работах допущены ошибки в идентификации энтерококков на основании биохимических тестов, которые не всегда дают верный результат при исследовании близкородственных видов Enterococcus sp. [2].
В популяции фекальных энтерококков выявлена широкая распространенность антилис-териозной и внутриродовой (в отношении вирулентных штаммов E. faecalis) активностей, напрямую коррелирующие с наличием генов бактериоциногении, что согласуется с литературными данными [14]. Выявленная закономерность находит подтверждение в работах L.M. Cintas et al. (1997) и S. Ennahar, N. Deschamps (2000), охарактеризовавших спектр антимикробной активности энтероцинов
А и Р [5, 11]. Названные энтероцины ингибирую рост Listeria sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Enterococcus sp., Carnobacterium sp., Leuconostoc sp., Lactococcus sp., Clostridium sp. и выявляются практически в одинаковом проценте случаев [15].
Проведённые исследования не выявили у культур Enterococcus sp. факторов вирулентности на уровне фено- и генотипа. Данные об отсутствии в геноме фекальных энтерококков, выделенных от животных, генетических детерминант факторов вирулентности отличаются от имеющихся в литературе. Так, в работах C. Sabina et al. (2007) и F. Biavasco (2007) показано, что ген, обуславливающий протеолитическую активность (GelE) содержат 50% культур Enterococcus sp., выделенных из кишечника животных, причём 11% штаммов обладают желатиназной активностью на уровне фенотипа [7], [20].
Полученные данные о широкой распространённости генов бактериоциногении и высоком уровне антагонистической активности среди фекальных изолятов энтерококков открывают перспективу для дальнейшего изучения биологических свойств Enterococcus sp., выделенных от животных, с целью их использования в качестве компонентов пробиотических препаратов.
10.09.2014
Список литературы:
1. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. - 180 с.
2. Гармашева, И.Л. Идентификация и таксономия энтерококков / И.Л. Гармашева, Н.К. Коваленко // Мшробюл. журн. -2010. - №5 (72). - С. 49-58.
3. Кудлай, Д.Г. Бактериоциногения / Д.Г. Кудлай, В.Г. Лиходед. - М.: Медицина, 1966. - 203 с.
4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.
5. Biochemical and genetic characterization of enterocin P, a novel sec-dependent bacteriocin from Enterococcus faecium P13 with a broad antimicrobial spectrum / L.M. Cintas [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 1997. - Vol. 63. - №11. -P. 4321-4330.
6. Characterization of Bacillus probiotics available for human use / H. Duc le [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. -2004. - Vol. 70. - №4. - P. 2161-2171.
7. Detection of bacteriocin production and virulence traits in vancomycin-resistant enterococci of different sources / C. Sabia [et al.] // Journal of Applied Microbiology. - 2008. - №104. - P. 970-979.
8. Development of Multiplex PCR for the detection of asa1, gelE, cylA, esp, and hyl genes in Enterococci and survey for virulence determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium / V. Vankerckhoven [et al.] // Journal of Clinical Microbiology. - 2004. - №42. - P. 4473-4479.
9. Devriese, L.A. Characterization and identification of Enterococcus species isolated from the intestines of animals / L.A. Devriese, A. Van de Kerckhove, R. Kilpper-Balz // International Journal of Systematic Bacteriology. - 1987. - Vol. 37. - №3. - P. 257-259.
10. Diverse antimicrobial killing by Enterococcus faecium E 50-52 bacteriocin / E. Svetoch [et al.] //J. Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56. - №6. - P. 1942-1948.
11. Ennahar, S. Anti-Listeria effect of enterocin A, produced by cheese-isolated Enterococcus faecium EFM01, relative to other bacteriocins from lactic acid bacteria / S. Ennahar, N. Deschamps //Journal of Applied Microbiology. - 2000. - №88. - P. 449-457.
12. Isolation and biochemical characterisation of enterocins produced by enterococci from different sources / M.R. Foulquie Moreno [et al.] // Journal of Applied Microbiology. - 2003. - №94. - P. 214-229.
13. Jackson, C.R. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci / C.R. Jackson, P.J. Fedorka-Cray, J.B. Barrett // Journal of Clinical Microbiology. - 2004. - Vol. 42. - №8. - P. 3558-3565.
14. Nigutova, K. Bacteriocin-like activity production and resistance in selected enterococci and streptococci of animal origin / K. Nigutova, P. Pristas, P. Javorsky // Archives Animal Nutrition. - 2005. - Vol. 59. - №3. - P. 205-211.
15. Occurrence of the structural enterocin A, P, B, L50B genes in enterococci of different origin / V. Strompfova [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2008. - Vol. 132. - №3. - P. 293-301.
16. Sang, Y. Antimicrobial peptides and bacteriocins: alternatives to traditional antibiotics / Y. Sang, F. Blecha // Anim. Health. Res. Rev. - 2008. - Vol. 9. - №2. - P. 227-235.
17. Screening of virulence determinants in Enterococcus faecium strains isolated from breast milk / C. Reviriego [et al.] // Journal of Human Lactation. - 2005. - №21. - P. 131-137.
18. The role and application of enterococci in food and health / M.R. Foulquie Moreno [et al.] // International Journal of Systematic Bacteriology. - 2006. - №106. - P. 1-24.
19. Two-peptide lantibiotics: a medical perspective / E.M. Lawton [et al.] // Mini. Rev. Med. Chem. - 2007. - Vol. 7. - №12. -P. 1236—1247.
20. VanA-type enterococci from humans, animals, and food: species distribution, population structure, Tn1546 typing and location, and virulence determinants / F. Biavasco [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 2007. - Vol. 73. - №10. - P. 3307-3319.
21. Virulence factors in food, clinical and reference enterococci: a common trait in the genus? / T. Semedo [et al.] // Systematic and Applied Microbiology. - 2003. - №26. - P. 13-22.
Сведения об авторах:
Щепитова Наталья Евгеньевна, аспирант кафедры микробиологии и заразных болезней факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета, e-mail: nschepitova@mail.ru
Сычёва Мария Викторовна, заведующая кафедрой микробиологии и заразных болезней факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Оренбургского государственного аграрного университета, кандидат биологических наук, доцент
460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18, e-mail: sycheva_maria@mail.ru
Карташова Ольга Львовна, заведующая лабораторией по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук, доктор биологических наук, доцент
460795, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, e-mail: labpersist@mail.ru
