CC BY
131
Биоплёнкообразование энтерококками кишечной микрофлоры животных
Н.Е. Щепитова, аспирантка, ФГБОУ ВПО Оренбургский ГАУ
Микроорганизмы рода ЕМегососсш входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта млекопитающих и характеризуются невысокой патогенностью. Они обеспечивают колонизационную резистентность слизистых оболочек макроорганизма, стимулируют местный гуморальный и клеточный иммунитет, а также участвуют в метаболических реакциях (гидролиз сахаров, синтез витаминов, деконъюгирование жёлчных кислот) [1]. Однако при снижении активности факторов врождённого иммунитета кишечник может стать основным источником транслокации бактерий при эндогенной энтеро-кокковой инфекции.
Одной из основных стратегий длительного сохранения и выживания бактерий в экотопе является формирование биоплёночных структур, представляющих собой скопление микроорганизмов, ассоциированных с полисахаридным внеклеточным матриксом и фиксированных на биотических или абиотических поверхностях [4]. Образование энтерококками биоплёнок в большинстве случаев рассматривается как важный фактор их патоген-ности при развитии энтерококковых инфекций. В то же время способность формировать биоплёнки обеспечивает микроорганизмам определённые преимущества при колонизации биотопа, поэтому данный признак может быть использован как один из критериев при отборе штаммов для биопрепаратов пробиотической направленности [2].
Накоплен значительный материал по способности патогенных микроорганизмов образовывать биоплёнки. Между тем сведения об этом свойстве у представителей нормальной микрофлоры, в том числе энтерококков кишечной микробиоты животных, практически отсутствуют. Цель настоящего исследования — определение возможности образования биоплёнок бактериями рода ЕМегососст, выделенными из кишечника животных.
Материалы и методы исследования. Материалом для исследования явился 51 штамм энтерококков, выделенных из фекалий клинически здоровых сельскохозяйственных животных. Из них 18 штаммов выделены из фекалий крупного рогатого скота, 16 — из фекалий свиней, 10 — из фекалий лошадей, 7 — из фекалий коз.
Бактерии выделяли путём посева испражнений в разведениях 10-3—10-6 на жёлчно-эскулиновый агар с азидом натрия (Ы1Меё1а, Индия). При обнаружении роста, характерного для энтерококков (образование коричнево-чёрного преципитата вокруг колоний), проводили пересев колоний на БсИаеШег-агар (ШМе&а, Индия).
Видовую идентификацию, а также определение наличия гена еър, кодирующего синтез поверхностного белка энтерококков, осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением известных праймеров (табл.) [5, 6]. Синтез праймеров осуществлён компанией «СИН-ТОЛ» (г. Москва).
Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС» («Литех», Россия). ПЦР проводили в термоциклере
Праймеры, использованные для обнаружения генов энтерококков
Продукт Ген Последовательность 5'-3' Размер продукта реакции, п. о.
Супероксиддисмутаза Е. casseliflavus 8оад СА ТССТОААТТАООТОААААААС ОСТАОТТТАССОТСТТТААСО 288
Супероксиддисмутаза Е. durans 8оад БИ ССТАСТОАТАТТААОАСАОСО ТААТССТААОАТАООТОТТТО 295
Супероксиддисмутаза Е./аесаШ 8оаА ЕЬ АСТТАТОТОАСТААСТТААСС ТААТООТОААТСТТООТТТОО 360
Супероксиддисмутаза Е./аестт 8оаА ЕМ ОААААААСААТАОААОААТТАТ ТОСТТТТТТОААТТСТТСТТТА 215
Супероксиддисмутаза Е. flavescens 8оаА еу ОААТТАООТОААААААААОТТ ОСТАОТТТАССОТСТТТААСО 284
Супероксиддисмутаза Е. gallinarum 8оаА ОА ТТАСТТОСТОАТТТТОАТТСО ТОААТТСТТСТТТОАААТСАО 173
Супероксиддисмутаза Е. Ыте 8оаА Н1 СТТТСТОАТАТООАТОСТОТС ТАААТТСТТССТТАААТОТТО 187
Супероксиддисмутаза Е. malodoratus 8о<!А МА ОТААСОААСТТОААТОААОТО ТТОАТСОСАССТОТТООТТТТ 134
Поверхностный белок Езр е8р АОАТТТСАТСТТТОАТТСТТАО ААТТОАТТСТТТАОСАТСТОО 510
«Терцик» (ДНК-технология, Россия). Реакционная смесь включала бактериальный лизат (1 мкл), специфические праймеры (по 1 мкл), дезокси-рибонуклеозидтрифосфаты, буфер, фермент Taq-полимеразу, хлорид магния. Реакционную смесь доводили до 25 мкл водой без нуклеаз.
Для обнаружения видоспецифических генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы, в смесь для мультиплексной ПЦР добавляли 1 мкл каждого праймера, осуществляли амплификацию фрагмента ДНК по протоколу: 1 цикл — 92°C, 4 мин.; 30 циклов — 92°C в течение 30 с, 1 мин. при 55°C (для групп 1,2) или 60°C (для группы 3), 1 мин. при 72°C; 1 цикл элонгации при 72°C в течение 7 мин. Протокол амплификации гена esp содержал: 1 цикл при t 92°С, 3 мин.; 5 циклов — 92°С, 5 с, 59°С, 5 с, 72°С, 5 с; 25 циклов — 1 мин. при 92°С, 1 мин. при 59°С, 1 мин. при 72°С; последний цикл включал 20 с при 92°С, 1 мин. — 59°С и элонгацию в течение 10 мин. при 72°С.
Продукты амплификации генов анализировали путём электрофоретического разделения в горизонтальном агарозном геле (1—2%), окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров применяли GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Плотность агарозного геля и маркеры молекулярного веса подбирали в зависимости от молекулярной массы продуктов амплификации. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определённой массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс.
Образование биоплёнок микроорганизмами оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луноч-ных полистироловых планшетах [7]. Оптическую плотность (А) измеряли при длине волны 492 нм. Коэффициент биоплёнкообразования (КБ) рассчитывали как отношение А492опыт/А492контроль, положительными считали значения более 1,1.
Полученные в ходе исследований данные были обработаны статистически [3].
Результаты исследований. В результате проведённой идентификации 13 выделенных штаммов были отнесены к виду Enterococcus hirae, по 12 изо-лятов — к видам E. faecium и E. durans, 7 культур —
к виду Е. /авеаШ, 5 штаммов — к виду Е. Ааувяевт и 2 штамма — к виду Е. еаззвНАаут (рис. 1).
Среди культур, изолированных из фекалий свиней, большинство штаммов относились к видам Е. /авсшш (50,0%) и Е. Мгав (37,4%) (рис. 2). В единичных случаях выделялись штаммы Е. саз-8вН/1аут (6,3%) и Е. йыгат (6,3%).
Видовой состав энтерококков микрофлоры фекалий лошадей был представлен в 40,0% случаев видом Е. /авсшш, в 30,0% — Е. /¡аувзсвт, в 20,0% — Е. Ыгав, в 10,0% — Е. саззвИ/1ауыз. Изоляты энтерококков из фекалий крупного рогатого скота принадлежали к видам Е. йыгат (61,1%), Е./авсаШ (33,4%) и Е. /¡аувзсвт (5,5%). Доминирующим видом энтерококков, выделенных из фекалий коз, был Е. Ыгав (71,4%), по одному штамму идентифицировано как Е. /¡аувзсвт (14,3%) и Е. /авсаШ (14,3%).
На следующем этапе работы была охарактеризована способность энтерококков кишечной микрофлоры животных образовывать биоплёнки.
Установлено, что 21,5+5,75% штаммов формировали плёнки на абиотической поверхности. Культуры Е./авсшш обладали данной способностью в 50% случаев, штаммы Е. Ыгав и Е. йыгат — в 15,3+9,98 и 16,6+10,74% случаев соответственно. Количество биоплёнкоформирующих штаммов Е. /¡аувзсвт составило 20,0+17,88% (рис. 3).
Коэффициент биоплёнкообразования изолятов энтерококков варьировал от 1,2 до 1,4. Для штаммов Е./авсшш средний КБ составил 1,3+0,04, а для культур пвп-/авсшш видов — 1,2+0,02.
Наибольший процент штаммов, формирующих биоплёнки, был выделен от лошадей (36,4+14,50%) и свиней (27,2 + 13,41%). В одинаковом проценте случаев биоплёнкообразующие культуры изолированы от крупного рогатого скота и коз (18,2+11,63%).
Известно, что поверхностный белок энтерококков, кодируемый геном взр, участвует в образовании
Рис. 1 - Видовой состав энтерококков кишечной микрофлоры животных
Рис. 2 - Видовой состав фекальных энтерококков животных
Рис. 3 - Способность к биоплёнкообразованию Enterococcus sp.
биоплёнок на абиотических поверхностях [8]. Ни у одного из изученных штаммов ген esp не обнаружен.
Вывод. Выявлено, что Enterococcus sp. фекальной микрофлоры обладают способностью образовывать биоплёнки, причём это свойство характерно для разных представителей данного рода.
Полученные данные расширяют представления об арсенале биологических свойств энтерококков, способствующих длительному переживанию последних в кишечном биотопе.
Литература
1. Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Симбиотические энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистческой инфекции. М.: Медицина, 2007. 30 с.
2. Хмель И.А. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов: фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 457-464.
3. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. 180 с.
4. Flemming H.C., Wingender J. The biofilm matrix // Nature Reviews Microbiology. 2010. No 8. P. 623-633.
5. Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus-and species-specific multiplex PCR for identification of entero-cocci // Journal of Clinical Microbiology. 2004. Vol. 42. No. 8. P. 3558-3565.
6. Vankerckhoven V., Van Autgaerden T., Vael C. et al. Development of Multiplex PCR for the detection of asal, gelE, cylA, esp, and hyl genes in Enterococci and survey for virulence determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium // Journal of Clinical Microbiology. 2004. No. 42. P. 4473-4479.
7. O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Annual Review of Microbiology. 2000. No. 54. P. 49-79.
8. Heikens E., Bonten M.J., Willems R.J. Enterococcal surface protein Esp is important for biofilm formation of Enterococcus faecium E1162 // Journal of Bacteriology. 2007. No. 189 (22). P. 8233-8240.
