CC BY
138
Образование биоплёнок клиническими изолятами энтерококков
Д.В. Пошвина, аспирантка, ФГБОУ ВПО Оренбургский ГАУ
Изучение биологических свойств клинических изолятов Enterococcus sp., выделенных от животных, актуально, поскольку отмечается рост числа инфекционно-воспалительных заболеваний энте-рококковой этиологии [1,5]. В отличие от факторов вирулентности [2], персистентные характеристики энтерококков, в том числе способность к биоплён-кообразованию, только начинают изучаться. Биоплёнки — это высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества, состоящие как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся форм, заключённых в экзополимерный матрикс. Формирование биоплёнок сопровождается высоким уровнем толерантности к антителам, антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и фагоцитам, неудовлетворительными результатами антибиотикотерапии [3] и является важным фактором патогенеза энтерокок-ковых инфекций. Установлено, что в образовании биоплёнок у бактерий рода Enterococcus важную роль играют поверхностные белки (ESP), которые обеспечивают адгезию энтерококков к различным поверхностям и создают условия для последующей инвазии в ткани хозяина за счёт ряда факторов вирулентности [6]. Известны гены энтерококков, кодирующие синтез поверхностных белков. Однако данные о распространённости биоплёнкообразова-ния среди энтерококков, выделенных из клинического материала от животных, немногочисленны.
В связи с вышеизложенным очевидна необходимость изучения биоплёнкообразования у клинических изолятов Enterococcus sp., что позволит объективно оценить вклад данного свойства возбудителей в патогенез инфекционно-воспалительных заболеваний.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились 34 штамма энтерококков, выделенных от животных при инфекционно-воспалительных заболеваниях: 14 штаммов — из экскрета половых органов самок при эндометритах коров, собак и кошек, 2 из секрета молочных желез при маститах коров, 18 — из гнойного экссудата при абсцессах мягких тканей и отитах кошек и собак. Выделение микроорганизмов осуществляли путём секторного посева исследуемого материала на желчно-эскулиновый агар с азидом натрия (Hi Media, Индия). Посевы инкубировали в термостате при 37°C в течение 24 ч. При обнаружении характерного для энтерококков роста (образование коричнево-чёрного преципитата вокруг колоний) проводили пересев колоний на агар Шедлера (HiMedia, Индия).
Идентификацию культур проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием известных праймеров [7]. Синтез праймеров осуществлён компанией «СИНТОЛ» (г. Москва). Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-ЭКСПРЕСС» (Литех, Россия).
Образование биоплёнок клиническими изолятами бактерий рода Enterococcus оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетов. Коэффициент биоплёнкообразования рассчитывали как отношение А492 опыт/А492 контроль. Положительным считали значения более 1,1 [8].
Распространённость генов, кодирующих поверхностные компоненты энтерококков (ESP), изучали с помощью метода ПЦР с использованием известных праймеров [9].
Полученные результаты были обработаны статистически [4].
Результаты исследований. Использование поли-меразной цепной реакции позволило идентифици-
3%
3%^ 3%
6%
6%
■ E.faecalis
□ E.faecium
В E.casseliflavus
□ E.favescens В E.avium
ЕЗ E.hirae
□ E.durans
Рис. 1 - Видовой спектр клинических изолятов энтерококков
органов самок
Рис. 2 - Коэффициент биоплёнкообразования клинических изолятов Е^егососсш' Бр. в зависимости от источника выделения
1,6 1,4 1,2
0,8 0,6
0,4 0,2
Щ ви ИИ 11 ИИ 11 -■— lllllll
ч
Рис. 3 - Коэффициент биоплёнкообразования клинических изолятов Enterococcus sp.
ровать 7 видов энтерококков. Среди них ведущее место занимали культуры вида E. faecalis (73%). В 6% случаев (по 2 штамма) клинические изоляты были представлены видами E.faecium, E. casseliflavus и E. flavescens. В единичных случаях высевали E. avium (3%), E. hirae (3%), E. durans (3%) (рис. 1).
Способность образовывать биоплёнки была обнаружена у 71 ±9,2% культур энтерококков. Данным свойством обладали виды E. faecalis, E. avium, E. flavescens.
В зависимости от биотопа выделения наиболее высокие показатели свойства отмечены у штаммов, изолированных из гнойного экссудата: среднее значение коэффициента биоплёнкообразования (КБ) составило 1,3±0,06 (рис. 2). Клинические изоляты, выделенные из экскрета половых органов самок, характеризовались более низкими значениями признака — 1,2±0,07. Энтерококки, изолированные из секрета молочных желёз, не обладали способностью формировать биоплёнки. Вероятно, колонизация данного биотопа обеспечивается другими факторами персистенции.
Кроме того, выявлена межвидовая вариабиль-ность признака. Наиболее высокие значения коэффициента биоплёнкообразования были отмечены у культуры E. durans (рис. 3). Клинические изоляты E. faecium, E. hirae, E. casseliflavus не образовывали статические биоплёнки в лунках полистироловых планшетов.
Гены, обусловливающие синтез поверхностных белков (Esp), обнаружены только у клинических изолятов вида E. faecalis. Среди культур, выделенных из экскрета половых органов самок, данный ген встречался в 57±13,2% случаев. Ген Esp выявлен у подавляющего большинства штаммов (67±11,1%), изолированных из гнойного экссудата. Культуры энтерококков, полученные из секрета молочных желёз, не содержали генетических детерминант, кодирующих синтез поверхностных белков.
Корреляционный анализ показал наличие достоверной (р < 0,001) высокой положительной связи (r = 0,632) между наличием генов Esp и способностью энтерококков формировать биоплёнки.
Вывод. Показано, что клинические изоляты энтерококков обладают способностью образовывать биоплёнки. Выявленная высокая достоверная положительная связь между изученным свойством и наличием гена Esp подтверждает важную роль поверхностных белков в первоначальной адгезии и формировании биоплёнок энтерококками [10].
Наряду с антилизоцимной, антикарнозиновой и другими способами секреторной защиты бактерий образование биоплёнок способствует персистенции энтерококков в макроорганизме.
Литература
1. Черных О.Ю. Энтерококковая инфекция нутрий // Ветеринария. 2009. № 1. С. 22-24.
2. Бухарин О.В., Валышева И.В., Карташова О.Л., Сычёва М.В. Характеристика вирулентного потенциала клинических изолятов энтерококков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. № 3. С. 13-18.
3. Гостев В. В., Сидоренко С. В. Бактериальные биоплёнки и инфекции // Журнал инфектологии. 2010. Т. 2. № 3. С. 4-15.
4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. 180 с.
5. De Herdt P., Defoort P., Van Steelant J. et al. Enterococcus cecorum osteomyelitis and arthritis in broiler chickens // Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 2008. Vol. 78. Р. 44-48.
6. Ramadhan A.A., Hegedus E. Biofilm formation and esp gene carriage in enterococci // J Clin Pathol. 2005. Vol. 58. No. 7. P. 685-686.
7. Jackson C.R., Fedorka-Cray P.J., Barrett J.B. Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42 (8). P. 3558-3565.
8. O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Ann. Rev. Microbiol. 2000. No 54. P. 49-79.
9. Vankerckhoven V., Van Autgaerden T., Vael C. et al. Development of a Multiplex PCR for the Detection of asa1, gelE, cylA, esp, and hyl Genes in Enterococci and Survey for Virulence Determinants among European Hospital Isolates of Enterococcus faecium // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42. No 10. P. 4473-4479.
10. Heikens E., Bonten M.J., Willems R.J. Enterococcal surface protein Esp is important for biofilm formation of Enterococcus faecium E1162 // J.Bacteriol. 2007. Vol.189. No. 22. P. 8233-8240.
