CC BY
91
Воропаева Е. Н.1, Поспелова Т. И.2, Воевода М. И.1, Максимов В. Н.1
1 ФГБНУ НИИ терапии и профилактической медицины, г. Новосибирск
2 ФГБОУ ВО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России, г. Новосибирск
ЗНАЧЕНИЕ АНОМАЛИЙ ГЕНА ТР53 В ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ ДИФФУЗНОЙ
ВКРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ
Voropaeva E. N.1, Pospelova T. I.2, Voevoda M. 1.1, Maximov V. N.1
1 FGBNU Institute of Internal and Preventive Medicine, Novosibirsk
2 Novosibirsk State Medical University оf Health Ministry of Russia, Novosibirsk
THE IMPORTANCE OF THE TP53 GENE ANOMALIES IN THE TUMOR PROGRESSION
OF DIFFUSIVE LARGE BCELL LYMPHOMA
Резюме. До настоящего времени знания о механизмах формирования и значении нарушения функции гена ТР53 при ДВККЛ в значительной степени носили ограниченный характер. В ходе настоящего исследования получены данные об особенностях структуры и спектра мутаций в гене ТР53 при ДВККЛ, присущих популяции Сибирского региона России. Показана существующая в настоящее время недооценка частоты аберраций в ТР53 при ДВККЛ вследствие игнорирования синонимичных мутаций и изменений в неко-дирующих участках гена, а также отсутствия комплексного анализа возможных молеку-лярно-генетических нарушений. Результаты работы не только доказывают вовлеченность ТР53 в процессы предрасположенности к развитию, инициализации, опухолевой прогрессии ДВККЛ, но и демонстрируют конкретные механизмы его инактивации, а также «двух-ударность» нарушений в гене, возникающих на различных этапах формирования лимфо-мы.
Ключевые слова: диффузная В-крупно-клеточная лимфома, опухолевая прогрессия, ген ТР53, аберрации.
Abstract. Up to now, knowledge of the mechanisms of development and significance of the defects of the TP53 gene function in DLBCL has been largely limited. In the course of this study, data were obtained on the structural features and the spectrum of mutations in the TP53 gene in DLBCL which are characteristic of the population of the Siberian region of Russia. The current underestimation of the frequency of aberrations in TP53 in DLBCL is shown which leads to the exclusion of synonymous mutations and changes in non-coding regions of the gene, as well as the absence of a comprehensive analysis of possible molecular genetic disorders. The results of the work prove the involvement of TP53 in processes of predisposition to development, initialization, tumor progression of DLBCL, and demonstrate specific mechanisms of its inactivation, as well as "two-hit" disorders in the gene that occur at various stages of lymphoma formation.
Key words: diffuse large B-cell lymphoma, tumor progression, TP53 gene, aberrations.
Введение. Глубокая вовлеченность аномалий гена ТР53 в развитие разных типов опухолей обусловлена выполнением им широкого спектра функций, предотвращающих и/или ингибирующих опухолевый рост [6, 9, 15].
В отличие от других клеток организма, подверженных в условиях стресса остановке клеточного цикла, р53-независимому апоптозу или некрозу, В-лимфоциты склонны к р53-опосредованному апоптозу. По этой причине
нарушение процессов программированной клеточной смерти в результате нарушения функции ТР53 является основополагающим для развития и прогрессии лимфопролифе-ративных заболеваний [20]. Так у мышей при выключении функции ТР53 злокачественные лимфомы являются доминирующей формой неоплазий [35].
Кроме того, инактивация ТР53 в В-лимфо-цитах приводит к менее эффективному
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
функционированию внутриклеточных сигнальных систем, останавливающих при повреждениях клеточный цикл в фазах 01 и 02, нарушению репарации ДНК, более эффективной адаптации клеток к гипоксии и стимуляции ангиогенеза, ослаблению контроля над структурой теломер и ингибированию диф-ференцировки. Поскольку ТР53 играет центральную роль в медиации действия алкили-рующих агентов и других химиопрепаратов, дефицит его функции неминуемо приводит к формированию фенотипа множественной лекарственной резистентности лимфомных клеток [26]. Ген ТР53 (0М1М N0. 191117) расположен на 17р13.1 и состоит из 19 144 пар нуклеоти-дов (п. н.). Доминантный транскрипт мРНК имеет длину 2586 п. н., включает 11 экзонов, 5>- и 3>-нетранслируемые последовательности (НТП). Кодирующими являются экзоны 2-11 [6]. Аберрации гена ТР53 играют ключевую роль в патогенезе многих онкологических заболеваний человека [35], в том числе, в возникновении, развитии и прогрессировании ДВККЛ, однако до настоящего времени знания о конкретных механизмах формирования и значении нарушений в гене ТР53 при данном варианте неходжкинских лимфом (НХЛ) Возможные молекулярные недостаточности носят ограниченный характер. Учитывая то, что результирующее действие аномалий ТР53 во многом зависит от тканеспецифического контекста и конкретного вида клеток, в которых проявляется его активность, невозможен механический перенос общих знаний об участии ТР53 в онкогенезе на ДВККЛ [15]. Описаны различные молекулярные механизмы формирования недостаточности функции гена ТР53 на уровне ДНК (табл. 1). Наиболее изученным аспектом изменчивости ТР53 на уровне ДНК при ДВККЛ являются мутационные события в гене [17, 34, 41]. Являющаяся наиболее полной базой мутаций в гене ТР53 при опухолях человека, IARC TP53 mutation database предназначена для сбора, структурирования и аннотирования данных, которые в последующем могут позволить точно интерпретировать значимость мутации TP53 при конкретной патологии и использовать их в стандартной клинической практике [31]. Информация о российской популяции в текущей версии IARC TP53 mutation database не представлена. Вместе с тем, частота и спектр мутаций в данном гене при одном и том же типе онкологической патологии может значительно меняться в зависимости от популяционной принадлежности изучаемой выборки. Таблица 1 механизмы формирования функции гена ТР53
Тип нарушения Эффект
На уровне ДНК
Мутации в кодирующей последовательности гена Потеря опухоль-супрессорных функций или приобретение проонкогенных свойств
Мутации в интронных последовательностях гена Нарушение альтернативного сплайсинга м-РНК
Мутации в 5'- и 3'-НТП гена Снижение эффективности трансляции белка, нарушение пост-трансляционных модификаций
Потеря гетерозиготности Создание аллельного дисбаланса, фенотипическая манифестация рецессивных мутаций гена
Метилирование промотора Снижение экспрессии, вплоть до «выключения» гена
Генетический полиморфизм Дефицит функции или стабильности белка
До настоящего времени при секвениро-вании ТР53 в опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ практически все исследования были сосредоточены на поиске мутаций в 5-8-м экзонах. Однако, по мнению и е1 а1. (2013), с учетом мутаций в нетранслируемых участках и интронах гена, ТР53 является одним из самых часто мутирующих при ДВККЛ, что может свидетельствовать о недооценке частоты и функционального эффекта аберраций в ТР53 при данном заболевании [25]. Такие варианты повреждения гена ТР53 при ДВККЛ, как аллельный дисбаланс и аномальное метилирование промотора менее
освещены в литературе. Немногочисленные опубликованные исследования, посвященные изучению полиморфизмов зародышевой линии ТР53 при ДВККЛ, ограничивались анализом отдельных маркеров [17], однако с учетом современных представлений о структурной организации ТР53, очевидно, что для уточнения влияния маркеров данного гена на его функцию необходимы знания о гапло-типе [31].
Изменения в 3'-НТП также могут иметь прямое биологическое действие на созревание В-лимфоцитов и активизировать лимфомо-генез. В исследовании Li et al. [25] на примере ДНК больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ) впервые показано, что мутации в 3'-НТП гена ТР53 — распространенное явление в опухоли: их имели большинство пациентов с ДВККЛ, почти все выявленные замены были расположены в подтвержденных ранее или предполагаемых по данным анализа in silico сайтах связывания микроРНК.
В этой связи целью настоящего исследования было на основе комплексного изучения изменчивости гена ТР53, обусловленной соматическими мутациями, метилированием промотора, аллельным дисбалансом, функционально значимыми полиморфизмами и га-плотипной структурой, определить его роль в опухолевой прогрессии ДВККЛ.
Материал и методы. Группу обследованных составили 202 пациента с впервые установленным диагнозом ДВККЛ, из них 77 человек (38,1 %) — мужчины, 125 (61,9 %) — женщины. Средний возраст больных был равен 53,2 ± 18,5 годам (18-82 лет). Согласно классификации Ann Arbor, пациенты распределялись следующим образом: 63,4% имели IV, 21,3 % — III, 12,4 % — II и 2,9 % — I стадию лимфомы. К группе низкого риска, согласно МПИ, были отнесены 12,4% пациентов, низкого / промежуточного — 25,7%, промежуточного / высокого — 27,7% и высокого риска — 34,2 %.
Исследование было одобрено локальным этическим комитетом. Все пациенты подписали информированное согласие до включения в исследование. Контрольная группа состояла из относительно здоровых лиц, жителей г. Новосибирска, была сопоставима по полу и возрасту, тип выборки — случайная.
Выделение ДНК из цельной венозной крови больных ДВККЛ и лиц контрольной груп-
пы выполнялось с использованием протеина-зы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Геномную ДНК из опухолевой ткани выделяли методом фенольно-хлороформной экстракции с применением гуанидина. Для исследования брались срезы ткани из парафиновых блоков биоптатов лимфоузлов и экстранодальных очагов поражения, содержащие не менее 8090 % лимфомных клеток.
Выявление мутаций в кодирующей последовательности 5-10-го экзонов и примыкающих участков интронов гена ТР53 проводилось методом прямого секвенирования по Сэнгеру в соответствии с IARC protocol методом капиллярного электрофореза на аппарате Hitachi 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Анализ результатов секвениро-вания и выравнивание фрагментов осуществляли в программах Chromas, SeqScape v.2.7, Sequence Scanner. В качестве референсной использовалась последовательность гена ТР53 NG_017013.
Анализ биологической значимости обнаруженных мутаций выполнялся по данным литературы, с помощью баз данных и инструментов IARC TP53 mutation Database, The TP53 UMD mutation database in human cancer и Human Gene Mutation Database. Дополнительно был произведен биоинформатиче-ский анализ миссенс мутаций с помощью online программы Polyphen-2.
Оценка метилирования промотора гена ТР53 требовала предварительного проведения бисульфитной конверсии 300-500 нг ДНК каждого образца с применением наборов EZ DNA Methylation Kit ("Zymo research", США), согласно протоколу производителя. Далее выполнялась метил-специфическая ПЦР в двух пробирках [4] с праймерами, специфичными к метилированному и неметилированному аллелю.
Потеря гетерозиготности в гене ТР53 оценивалась по микросателлитному локусу D17S796 [5] методом ПЦР в парных образцах ДНК опухолевой и здоровой ткани пациентов с ДВККЛ.
Генотипирование rs78378222, rs1042522, rs17878362, rs1625895 и гаплотипирование rs17878362-rs1042522 проводилось методами ПЦР и анализа полиморфизма длин ре-стрикционных фрагментов (ПДРФ) [14, 15]. Гаплотипирование rs1042522-rs1625895 и rs1625895-rs17878362 выполнялось мето-
дом гнездовой ПЦР с аллель-специфичным праймером [14], обеспечивающим наработку одного из редких аллелей в анализируемой паре маркеров. В последующем выполнялся анализ ПДРФ для выяснения сцепленного с ним аллеля второго маркера.
Для всех изученных полиморфных вариантов генов в выборках популяционного контроля распределение аллелей и генотипов проверялось на соблюдение равновесия Хар-ди-Вайнберга (р2АА + 2рqАа + q2аа = 1).
Для оценки ассоциации между изучаемыми параметрами и риском развития анализируемого события рассчитывалось отношение шансов (ОШ) с 95 % доверительным интервалом (ДИ). При сравнении частот признаков использовался стандартный критерий х2 Пирсона и точный критерий Фишера.
Анализ структуры неравновесия по сцеплению с определением коэффициентов D/ и r2 между rs1042522, rs1625895 и rs17878362 проводился с применением программы MIDAS и онлайн-калькулятора CubeX.
Результаты исследования. Значение rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53 в определении предрасположенности к развитию ДВККЛ.
Согласно базе dbSNP, в гене ТР53 известно около 750 полиморфизмов, 50 из которых цитируются в базе Pubmed. Большинство из них редко встречается в популяции, около двух десятков однонуклеотидных полиморфизмов имеют частоту встречаемости редкого алле-ля в популяции более 5%, а три — rs1042522, rs17878362 и rs1625895 — наиболее хорошо изучены в плане функциональных характеристик, распространенности в популяции и ассоциации с риском опухолей [28, 33, 39].
В течение последних 15 лет ассоциация rs1042522, rs17878362 и rs1625895 с пред-
расположенностью к различным опухолям человека была широко изучена, однако данные расходятся и не являются окончательными [18]. Комбинации генетических особенностей (межгенных взаимодействий) и эндо-экзогенных факторов различаются у лиц в популяциях с разным этническим происхождением, что может объяснять различия в предрасположенности [30]. Крайне важно также учитывать, что конечный эффект полиморфизма на функцию р53 может меняться в зависимости от типа опухолевых клеток [13], что свидетельствует об актуальности дальнейших исследований и необходимости новых сведений, расширяющих представления о роли генетического полиморфизма ТР53 в предрасположенности к онкологическим заболеваниям.
На первом этапе данной работы было рассчитано распределение частот аллелей и генотипов трех изученных полиморфизмов гена ТР53 в группе больных ДВККЛ и контрольной выборке. Статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов гб1042522, гб1625895 и гб17878362 в группе больных ДВККЛ и контрольных выборках, как и данных об ассоциации изучаемых маркеров с риском развития ДВККЛ, получено не было (табл. 2).
Однако, поскольку предрасположенность или устойчивость к мультифакториальным заболеваниям определяется сочетанием большого числа малых эффектов отдельных факторов, потенциально наиболее продуктивной стратегией выявления генетических вариантов, лежащих в основе предрасположенности к ДВККЛ, является анализ структуры неравновесия по сцеплению маркеров гена ТР53 и обнаружение связанных с болезнью гаплотипов [11].
Таблица 2
Полиморфизм Частота (n, %) Риск ДВККЛ*
ДВККЛ контроль Х2 Р OR (95 % ДИ)
rs1042522 генотип Arg/Arg 74 (46,0) 170 (45,5) 4,44 0,11 1,02 (0,70-1,48)
Arg/Pro 77 (47,8) 159 (42,5) 1,24 (0,86-1,80)
Pro/Pro 10 (6,2) 45 (12,0) 0,48 (0,24-0,99)
аллель Arg 225 (69,9) 499 (66,7) 1,03 0,31 1,16 (0,87-1,54)
Pro 97 (30,1) 249 (33,3) 0,86 (0,65-1,15)
Распределение частот аллелей и генотипов маркеров гена ТР53 в группе больных ДВККЛ и контрольной выборке
Продолжение таблицы 2
Полиморфизм Частота (п, %) Риск ДВККЛ*
ДВККЛ контроль Х2 Р ОР (95 % ДИ)
гб17878362 генотип ш/ш 123 (76,4) 283 (75,7) 0,08 0,96 1,04 (0,67-1,61)
ш/Сир 36 (22,4) 87 (23,3) 0,95 (0,61-1,48)
с1ир/с1ир 2 (1,2) 4 (1,1) 1,16 (0,21-6,42)
аллель ш 282 (87,6) 653 (87,3) 0,02 0,90 1,03 (0,69-1,52)
<Сир 40 (12,4) 95 (12,7) 0,97 (0,66-1,45)
гб1625895 генотип в/в 120 (74,5) 294 (78,6) 0,76 0,68 0,84 (0,50-1,39)
в/Л 39 (24,2) 76 (20,3) 1,15 (0,68-1,93)
Л/Л 2 (1,3) 4 (1,1) 1,78 (0,32-9,85)
аллель в 279 (86,6) 644 (88,8) 0,97 0,32 0,82 (0,55-1,22)
Л 43 (13,4) 84 (11,2) 1,22 (0,82-1,81)
Примечание: * х2, р, и ДИ — приведены для общей модели наследования.
Оценка неравновесия по сцеплению между гб1042522, гб1625895 и гб17878362 у 106 пациентов и 374 лиц контрольной группы показала, что сцепление между гб17878362 и гб1042522, а также гб1625895 и гб17878362 в группе больных ДВККЛ имеет умеренную силу, а между гб1625895 и гб1042522 — сцепление выраженное. Вместе с тем, значения коэффициентов Б/ и г2 свидетельствуют о значительно меньшей силе сцепления между тремя изучаемыми полиморфизмами
в контрольной выборке, в сравнении с группой исследования (таблица 3).
Понятие «гаплотип» отражает аллельную структуру нескольких сцепленных локусов в пределах одной хромосомы. Анализ гаплотип-ных последовательностей дает возможность на более глубоком уровне оценить функциональное взаимодействие полиморфных локусов (по аддитивному, потенцирующему, антагонистическому типу и их результирующее влияние на биологические функции белка).
Таблица 3
Степень структурного сцепления между ге17878362, ™1042522 и ^1625895 в группе больных ДВККЛ и контрольной выборке*
Больные ДВККЛ Контрольная группа
^1042522 ГБ1625895 ^1042522 ГБ1625895
0,73 0,71 0,57 0,47
гб17878362 (0,15) (0,41) (0,09) (0,19)
<0,0001 <0,000001 <0,000001 <0,000001
0,82 0,42
гб1042522 — (0,22) — (0,04)
<0,00001 <0,0001
Примечание: * — в таблице приведены значения коэффициентов неравновесия по сцеплению й7, (г2) между изучаемыми полиморфизмами и уровень значимости р
Распределение частот гаплотипов и дипло-типов по трем изученным биаллельным полиморфизмам гена ТР53 в обследованной группе больных ДВККЛ и контрольной выборке приведено в табл. 4. Получены значимые различия в частоте трех гаплотипов: повышение частоты гаплотипа шАг§0 (р = 0,025), а также снижение частот гаплотипов шРгоС (р = 0,025) и ёирРгоО (р = 0,041) в группе больных ДВККЛ в сравнении с контрольной выборкой.
При этом протективное значение гаплоти-пов шРгоС или ёирРгоО отмечалось в сочета-
нии с любыми другими гаплотипами в составе диплотипа (ОШ = 0,55; 95% ДИ (0,34-0,90) и ОШ = 0,21; 95% ДИ (0,05-0,90), соответственно), тогда как для гаплотипа шА^О отмечено повышение риска развития ДВККЛ только в гомозиготном состоянии (ОШ = 1,66; 95 % ДИ (1,07-2,57)) (табл. 4). Ранее другими авторами также отмечалось различие в эффектах изучаемого тройного гаплотипа гена ТР53 в зависимости от гомозиготного или гетерозиготного состояния [10].
Таблица 4
Распределение частот гаплотипов и диплотипов трех исследованных полиморфизмов гена ТР53 в группе больных ДВККЛ и контрольной выборке
Частота ( %) Риск ДВККЛ Диплотип/ Частота Риск ДВККЛ
ДВККЛ контроль Значение Р ОШ (95 % ДИ) ДВККЛ контроль Значение Р ОШ (95 % ДИ)
148 (69,8) 457 (61,1) 0,025 1,47 (1,06-2,03) шА^в/любой 97 323 0,212 1,70 (0,81-3,58)
3 (1,4) 21 (2,8) 0,370 0,50 (0,18-1,77) шА^в/шА^в 51 134 0,029 1,66 (1,07-2,57)
30 (14,2) 160 (21,4) 0,025 0,61 (0,40-0,93) шА^в/любой* 46 189 0,235 0,75 (0,49-1,16)
4(1,9) 16 (2,1) 0,964 0,88 (0,33-2,75) шАг§А/любой 3 21 0,363 0,49 (0,14-1,67)
19 (9,0) 44 (5,9) 0,149 1,58 (0,92-2,78) шРгов/любой 27 143 0,021 0,55 (0,34-0,90)
6(2,8) 14 (1,9) 0,555 1,53 (0,62-4,07) с1ирАг§в/любой 4 16 0,963 0,88 (0,29-2,68)
2 (0,9) 31 (4,1) 0,041 0,22 (0,07-0,99) с1ирРгоА/любой 18 43 0,189 1,57 (0,87-2,86)
0 (0) 5 (0,7) - - шРгоА/любой 6 14 0,094 1,54 (0,58-4,12)
212 (100) 748 (100) СирРгов/любой 2 31 0,031 0,21 (0,05-0,90)
с1ирАг§А/любой - 5 - -
Примечание: * аллели в составе гаплотипа и диплотипа указаны в порядке гб17878362-гб1042522-гб1625895; * любой гаплотип, кроме шА^в
Мутации в кодирующей и интронных последовательностях гена ТР53.
В ходе анализа опухолевого материала от 74 больных ДВККЛ были выявлены 33 мутации: 21 в кодирующей, 12 в интронных последовательностях гена ТР53 (рис. 1). Распределение мутаций было следующим: 1 (3 %)
мутация, приводящая к нарушению сплайсинга молекулы РНК, 11 (33 %) — интронных с неизвестным эффектом, 12 (37%) — мис-сенс, 6 (18 %) — сеймсенс, 2 (6 %) — нонсенс типа, 1 (3%) — мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания в гене ТР53.
Рис. 1. Распределение мутаций в интронных и кодирующих участках гена ТР53: горизонтальные рамки соответствуют экзонам; черные столбики — миссенс, нонсенс мутации и мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания; серые столбики — сеймсенс мутации;
в вертикальных рамках — интронные мутации.
Все находки, за исключением A189Pfs (96,9 %), представляли собой однонуклео-тидные замены, 5 (15,6%) из которых были мутации типа GC>AT в CpG островках. Замены GC>AT составили 34,4%, GC>CG — 3,1 %, GC>TA —9,4%, AT>GC —12,5%, AT>CG — 12,5 %, AT>TA—12,5%, что значимо не отличается от данных, представленных в IARC TP53 mutation database, вместе с тем наблюдались различия в локализации горячих точек мутаций (табл. 5).
Все выявленные нами в исследуемой вы-
борке больных ДВККЛ мутации в кодирующей последовательности гена ТР53 описаны ранее в IARC TP53 mutation database при других онкологических заболеваниях и были расположены в 5-8 экзонах гена (рис. 1).
В обследованной выборке 4 (6,8 %) больных имели множественные мутации, а ряд находок встречался неоднократно (в 2 случаях каждая): в кодирующей последовательности — p.W146R, p.T155I, p.V272E, p.R213X, в интронных областях IVS7+31G>C, IVS9+12T>C и IVS8+10C>A.
Таблица 5
Результаты сравнения спектра выявленных мутации с данными IARC TP53 mutation database
«Hot-spot» мутации в группе больных ДВККЛ г. Новосибирска «Hot-spot» кодоны IARC TP53 mutation database в порядке убывания частоты мутаций при ДВККЛ
p.W146R, p.T155I, p.V272E, p.R213X 248, 273, 175, 245, 281, 244, 305, 249, 297
Анализ биологической значимости всех выявленных нами в исследуемой выборке больных ДВККЛ миссенс мутаций в гене ТР53 показал следующие данные (табл. 6). Мутации р.Ь130£ р.Т1551, р.Я1960, p.G244S, р.У272Е, р.А276У, приводящие к появлению белка, утрачивающего функциональную активность, всеми тремя прогностическими
программами были отнесены к повреждающим, вредным или с высокой/средней степенью опасности заменам.
Биологическая значимость мутаций р.Я213Х и р.А189Р1^ не вызывает сомнений, поскольку обе они приводят к появлению усеченного белка р53 с нулевой активностью.
Таблица 6
Результаты функционального анализа миссенс мутации гена ТР53
Мутация Функциональный прогноз Активность белка р53 в экспериментах in vitro
Ро!уРИеп-2 (характер мутации) SIFT (характер мутации) Mut_ass (степень патогенности)
p.L130F Возможно патогенная Опасная Высокая Не активен
p.W146R Не патогенная Нейтральная Низкая Незначительно снижена
p.T155I Возможно патогенная Опасная Средняя Не активен
p.R156C Не патогенная Нейтральная Низкая Гиперактивен
p.R196Q Возможно патогенная Опасная Высокая Не активен
p.G244S Возможно патогенная Опасная Средняя Не активен
p.V272E Возможно патогенная Опасная Высокая Не активен
p.A276V Возможно патогенная Опасная Средняя Не активен
p.G293R Не патогенная Нейтральная Средняя Незначительно снижена
p.A276V Возможно патогенная Опасная Средняя Не активен
p.G293R Не патогенная Нейтральная Средняя Незначительно снижена
Сложнее было оценить эффект сеймсенс-мутаций, выявленных в исследуемой выборке, поскольку они являются синонимическими заменами нуклеотидов, которые характеризируются сохранением смысла кодирующего кодона. Согласно прогнозу
TP53 Mutant assessor, из сеймсенс-мутаций наибольшего внимания заслуживает замена p.A307A ввиду того, что 307 кодон близок к концу экзона и потенциально может находиться в сайте сплайсинга молекулы РНК.
Функциональный эффект большинства
интронных мутаций, выявленных в группе больных ДВККЛ, точно не известен. Одна из биологически значимых мутаций гена ТР53 (IVS6-36G>C) расположена в 6-м интро-не гена. Она относится к изменениям, влияющим на сплайсинг, согласно The TP53 UMD mutation database in human cancer. В эксперименте in vitro было продемонстрировано, что данная замена, в отсутствие изменений в кодирующей последовательности гена, приводит к выживанию клеток в условиях химиотерапии и длительно ингибирует апоптоз [24].
Анализ аллельного дисбаланса и статуса метилирования гена ТР53
Частота метилирования промотора гена ТР53 в обследованной выборке из 69 больных ДВККЛ составила 4 (5,8 %) и значимо не различалась (р = 0,5663) в подгруппах с мутант-ной (4,2 %) и нормальной структурой гена (6,7 %).
Анализ потери гетерозиготности (ПГ) в гене ТР53 по микросаттелитному маркеру D17S796 был выполнен у 24 больных ДВККЛ группы исследования, из них у 13 человек обнаружены мутации, у 11 — отсутствовали изменения в последовательности гена ТР53. Были выявлены 6 (25%) случаев ПГ, из них 5 (83,3%) случаев ПГ приходились на больных, у которых в ходе секвенирования были выявлены мутации в последовательности 5-8-го экзонов и прилегающих участков интронов ТР53.
Изменения в 3>-НТП гена ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ
Маркер 3>-НТП гена ТР53 — rs78378222 по данным dbSNP — описан в полногеном-
ных исследованиях в контексте ассоциации с риском развития рака простаты, глиомы, базальноклеточной карциномы кожи, рака пищевода и колоректальной аденомы [36]. На крупной выборке пациентов (244 человека) показано наличие гб78378222 при ДВККЛ [25]. Данный маркер представляет собой од-нонуклеотидную замену в 3'-НТП гена TP53, приводящую к изменению последовательности ААТААА, которая является сигналом к по-лиаденилированию на ААТАСА, что приводит к нарушению процессинга 3>-конца мРНК гена TP53. Экспериментальные данные показывают, что редкий аллель С гб78378222, в сравнении с аллелем А, обеспечивает значительно меньший уровень экспрессии ТР53, что приводит к снижению индукции апопто-за в клетках под действием генотоксических факторов [25].
Обращает на себя внимание следующий факт. Ни в одном из опубликованных в настоящее время исследований редкий аллель С гб78378222 в здоровой ткани не встречался в гомозиготном состоянии. Считается, что данный маркер находится под действием отрицательного естественного отбора, механизмом которого, по всей видимости, являются злокачественные новообразования [24].
Генотипирование 92 образцов ДНК, выделенной из опухолевой ткани больных ДВККЛ, проведенное в рамках данной работы, показало, что частота выявления гб78378222 составила 9/92 (9,8 %). У ряда пациентов выявлен минорный аллель С в гомозиготном состоянии (рис. 2).
106 п.н.
1 2 КР 3 4 КР 5 6 7 8 9 КР
Рис. 2. Результаты генотипирования т$78378222 методом ПЦР с анализом ПДРФ образцов опухолевой ткани больных ДВККЛ, имеющих редкий аллель С: 1-9 номера случаев; КР — контроль рестрикции; 106+84 п. н. (генотип А/С); 84 п. н. (генотип А/А); 106 п. н. (генотип С/С).
С целью подтверждения результатов гено-типирования было выполнено прямое секве-нирование по Сенгеру фрагмента 3'-НТП гена
ТР53, содержащей гб78378222, всех 9 образцов ДНК из опухолевой ткани ДВККЛ, имеющих, согласно результатам ПЦР с анализом
ПДРФ, минорный аллель С. Дополнительно было выполнено секвенирование образца ДНК из опухолевой ткани, имеющего гомозиготный нормальный генотип А/А, а также образцов ДНК из не контактирующей с формалином периферической крови лиц, имеющих частый гомозиготный генотип А/А и гетерозиготный генотип А/С. Результаты секвени-рования приведены в таблице 7.
Поскольку случаи обнаружения редкого гомозиготного генотипа С/С гб78378222 в нормальной ткани не описаны, а выделение ДНК из парафинизированных блоков проводилось из срезов с содержанием опухолевой ткани не менее 70-80 %, полученные результаты свидетельствуют о потере гетерози-готности в локусе расположения гб78378222 в опухолевой ткани больных ДВККЛ, гетерозиготных по гб78378222 (случаи под номерами 1, 2, 4, 5 и 9 на рис. 2 и в табл. 7).
Комплексный анализ аномалий гена ТР53 при ДВККЛ
Анализ мировой литературы показывает, что вопросы частоты мутационных событий в кодирующей последовательности ТР53 и его аллельного дисбаланса являются наиболее изученными аспектами статуса данного гена при ДВККЛ. Работы, анализирующие метилирование промотора и 3'-НТП ТР53, представлены единичными сообщениями. Ин-тронные последовательности, потенциально несущие сайты сплайсинга мРНК, не изучены вовсе. Анализ всего перечисленного спектра функционально-значимых изменений в гене ТР53 на единой выборке пациентов с ДВККЛ ранее не проводился. В связи с этим нами был проведен комплексный анализ молекулярно-генетических нарушений, затрагивающих ген ТР53 в опухолевой ткани ДВККЛ, результаты которого представлены в таблице 8.
Таблица 7
Результаты секвенирования сиквенса 3'-НТП гена ТР53, содержащей п78378222
Проба Генотип Фрагмент сиквенса
по данным метода ПЦР с анализом ПДРФ по данным секвенирования по Сенгеру
К1 А/А А/А
К2 А/А А/А
К3 А/С А/С
С1 С/С С/С
С2 С/С С/С ОсллЛзгЛ^
Продолжение таблицы 7
Генотип
Проба по данным метода ПЦР с анализом ПДРФ по данным секвенирования по Сенгеру Фрагмент сиквенса
СЗ А/С А/С ЛЛ/ЛМЛЛЛ/^
С4 А/С с преобладанием аллеля С А/С с преобладанием аллеля С (■'УУУУУУ^7
С5 А/С с преобладанием аллеля С С/С
С6 А/С А/С ЛЛуУУУ
С7 А/С А/С ХЛлАяАллГ^
С8 А/С А/С
С9 А/С с преобладанием аллеля С С/С кЛУШ^ДА/
Примечание: К1 — ДНК опухолевой ткани с частым генотипом А/А гб78378222 по данным ПДРФ анализа;
К2 — ДНК крови контрольной группы с генотипом А/А гб78378222 по данным ПДРФ анализа; КЗ — ДНК крови контрольной группы с гетерозиготным генотипом А/С гб78378222 по данным ПДРФ анализа;
С1-С9 — случаи выявления редкого аллеля гб78378222.
Таблица 8
Данные о сочетанных нарушениях в гене ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ
Номер пациента Мутация 017Б796 Генотип гэ78378222 Метилирование
1. р.1_130Р ПГ А/А Норма
р.К156С
2. рт4бк — А/А Метилирование
3. рт4бк — А/А Норма
4. р.Т1551 ПГ А/А Норма
p.A189Pfs
!УБ5 + 43в > Т
!УБ4 - 30Т > С
5. р.Т155! Норма А/А Норма
6. р.Д307Д — А/С Норма
р.V157V
!УБ4-30Т > С
!УБ8 + 20А > в
7. р.Н179Н — А/С Норма
8. р^196Ц ПГ С/С Норма
9. р.К213Х Норма А/А Норма
10. р.К213Х Норма А/А Норма
11. р.в244Б Норма А/А Норма
12. р.1_2521_ — С/С Норма
!УБ6 - 36в > С
13. р^272Е Норма А/А Норма
14. р^272Е Норма А/А Норма
15. р^272У Норма А/А Норма
16. р.А276У — А/А Норма
17. р.в293К ПГ А/А Норма
18. р.в302в — А/А Норма
!УБ8 + 10С > А
19. !УБ5 - 17Т > С — А/А Норма
!УБ7 + 31в > С
20. !УБ8 + 37А > в ПГ А/А Норма
21. !УБ9 + 12Т > С Норма А/А Норма
22. !УБ9 + 12Т > С — А/А Норма
23. !УБ8 + 10С > А — А/А Норма
24. !УБ7 + 31в > С — А/А Норма
25. Норма Норма А/А Норма
26. Норма Норма А/А Метилирование
29. Норма ПГ А/А Метилирование
32. Норма Норма А/С Норма
36. Норма — А/А Метилирование
50. Норма — А/С Норма
51. Норма — С/С Норма
64. Норма — С/С Норма
67. Норма — С/С Норма
Примечание: Красный цвет — доказанный патогенный эффект, зеленый — непатогенные изменения, голубой — не приводят к потере функции белка р53, желтый — функциональный эффект не возможно оценить.
Было показано, что как минимум треть (32,4%) больных ДВККЛ имеют нарушения в гене с доказанным онкогенным потенциалом, которые в половине случаев носят сочетанный характер. Множественные мутации имеют 6,8 % больных. Частота ПГ в гене с учетом микросателлитного маркера D17S796 и полиморфизма rs78378222 составила 13,5 %, что соответствует данным, полученным в крупном многоцентровом исследовании Международного консорциума по изучению ДВККЛ [42]. Наконец, все случаи ПГ сочетались с соматическими мутациями, метилированием промотора ТР53 либо маркером 3-НТП, эффект которого равен эффекту мутации с выключением функции р53.
Обсуждение результатов. Анализ данных мировой литературы показывает, что вопрос о значении полиморфизма гена ТР53 в предрасположенности к неходжкинским лимфомам (НХЛ) в настоящее время остается не решенным. Weng et al. (2012) в проведенном мета-анализе литературы попытались суммировать данные относительно связи rs1042522 гена ТР53 с предрасположенностью к НХЛ [38]. Его данные вполне согласуются с полученными нами в пилотном исследовании результатами на группе из 100 пациентов с НХЛ о том, что именно аллель Pro данного маркера может являться «рисковым» в отношении лимфом [7, 8]. Однако, помимо того, что в отличие от rs1042522, ассоциация rs17878362 и rs1625895 с риском НХЛ практически не изучена [1, 8], высокое разнообразие НХЛ требует анализа данных маркеров при отдельных гистологических вариантах заболевания, а малый эффект каждого из полиморфизмов в отдельности на риск развития заболевания — оценки их в составе гаплотипных групп.
Нами проводился анализ частоты rs1042522, rs1625895 и rs17878362, их тройного гаплотипа и неравновесия по сцеплению у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой и лиц контрольной группы — жителей г. Новосибирска и Новосибирской области.
Были получены результаты об отсутствии статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов rs1042522, rs1625895 и rs17878362 в группе больных ДВККЛ и контрольной выборке.
Также был изучен характер неравновесия по сцеплению (LD) между изучаемыми по-
лиморфизмами в группе пациентов с ДВККЛ и контрольной выборке. Полученные результаты, во-первых, свидетельствуют об умеренной силе сцепления между тремя изучаемыми полиморфизмами в контрольной выборке.
Хотя ранее рядом зарубежных авторов и была отмечена высокая степень структурного сцепления между гб17878362, гб1042522 и гб1625895 [32], при сравнении частот гапло-типов ТР53 у лиц различной этнической принадлежности было показано, что не только сила ЬЭ между полиморфизмами, но и состав блоков сцепления в гене ТР53 может значительно варьировать в различных популяциях [16]. Полученные нами результаты об отсутствии жесткого сцепления между гб1042522, гб1625895 и гб17878362 в популяции Сибирского региона России подтверждаются данными СЬегёуМБеуа N. V. et а1. о наличии ЬЭ лишь умеренной силы между изучаемыми полиморфизмами у жителей Томской области [14].
Во-вторых, коэффициенты Э/ и г2 свидетельствуют, что сила неравновесия по сцеплению между изучаемыми полиморфизмами в группе больных ДВККЛ выше, чем в группе контроля и имеет умеренную силу между гб17878362 и гб1042522, а также гб1625895 и гб17878362, а между гб1625895 и гб1042522—неравновесие по сцеплению выраженное. Более выраженная структура неравновесия по сцеплению (ЬЭ) у больных по сравнению с контрольными или популя-ционными выборками подтверждает, что ген-кандидат играет определенную роль в подверженности болезни.
Полученные нами данные о наибольшей частоте встречаемости гаплотипа шА^О как в контрольной выборке, так и группе больных ДВККЛ согласуются с результатами работы КЬгишпА.М et а1. [22]. Частота гаплотипа ёирРгоА в нашем исследовании составила 9 % и 5,9 % в группах больных ДВККЛ и контрольной выборке, соответственно. КЬгишпА.М et а1. изучали тройные гаплотипы ТР53 у жителей различных регионов России и Белоруссии, и гаплотип шА^О был наиболее частым во всех исследованных популяциях. Частота гаплотипа ёирРгоА снижалась с запада на восток (от 17.9 % у белорусов до 0.7 % в Якутске и Верхоянске) и коррелировала с долготой.
В проведенном нами исследовании было показано, что для гаплотипа шА^О отмечена ассоциация с риском развития ДВККЛ только
в гомозиготном состоянии (OR1,66; 95 % CI (1,07-2,57)), в отличие от гаплотипов wProG или dupProG, имеющих протективный эффект в сочетании с любыми другими гапло-типами в составе диплотипа (OR0,55; 95 % CI (0,34-0,90) и OR0,21; 95 %CI (0,05-0,90), соответственно). Ранее другими авторами также отмечалось различие в эффектах изучаемого тройного гаплотипа ТР53 в зависимости от гомозиготного или гетерозиготного состояния [10].
Таким образом, эффект полиморфизмов гена ТР53 на формирование предрасположенности к опухолям, по всей видимости, обладает влиянием, результат которого определяется как этнической принадлежностью, взаимодействиями со средой и другими генетическими факторами, гистологической принадлежностью опухоли, так и уровнем гете-розиготности по изучаемым полиморфизмам и гаплотипной структурой гена ТР53.
Спектр однонуклеотидных замен, выявленных в ходе секвенирования гена ТР53 в опухолевой ткани больных ДВККЛ группы обследования, значимо не различался с данными, представленными в IARC TP53 mutation database. Локализация «горячих точек» мутаций, в отличие от спектра одно-нуклеотидных замен, в обследованной выборке больных диффузной В-ККЛ отличается от данных, представленных в IARC TP53 mutation database. В ходе исследования, за исключением 244-го кодона, не выявлено мутаций в большей части кодонов (248, 273, 175, 245, 281, 305, 249 и 297), для которых в IARC TP53 mutation database описано наибольшее количество мутаций в гене ТР53 при ДВККЛ. В анализируемой выборке больных кодоны 275, 155, 272 и 212 являлись «горячими точками» мутаций.
Преобладали (95 %) мутации в участках гена TP53, кодирующих ДНК-связывающий регион. Мутация p.G293R — единственная из выявленных миссенс-замен, которая не затрагивает функционально-значимого ДНК-связывающего домена р53.
Анализ базы данных IARC TP53 mutation database показал, что все функционально значимые мутации, выявленные нами в группе обследования, были описаны ранее при широком круге новообразований человека. Кодоны 196 и 213 при всех опухолях и кодон 244 при гемобластозах вообще и ДВККЛ в частности являются «горячими точками» мутаций
в гене ТР53 [21]. Более того, описаны случаи синдрома Li-Fraumeni [21], для которого характерно развитие первично-множественных злокачественных новообразований, вызванных герминогенными мутациями p.R213X, р.G244S, p.L130F и p.T155I, аналогичными описанным нами.
Каждая из мутантных форм белка является уникальным продуктом мутации и может сочетать в себе как усиление или снижение определенных видов активности р53, так и нарушение его структуры или приобретение белком новых свойств. К появлению функционально неактивного белка р53 в обследованной выборке больных ДВККЛ приводили миссенс-мутации p.L130F, p.T155I, p.R196Q, p.G244S, p.V272E и p.A276V наряду с мутацией p.A189Pfs, приводящей к сдвигу рамки считывания, нонсенс заменой p.R213X и сплайс-мутацией IVS6-36G>C. Все описанные выше события в кодирующей части гена приходятся на регионы, несущие информацию о высоко консервативных участках ДНК-связывающего домена белка, закрепленных эволюционно в филогенезе, и встречающихся в большинстве изоформ р53, а также структуре белков-гомологов р63 и р73.
Мутации p.R213X и р.G244S, а также p.V272E ранее уже были описаны при ДВККЛ [21], а выявленная нами р.Т1551 ранее была зарегистрирована у нескольких больных ХЛЛ и ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и низкой эффективностью его терапии [21]. Среди случаев с гемобластозами p.V272E ранее была описана при лимфоме Беркитта, болезни Ходжкина и В-клеточных НХЛ [21].
Все эти данные свидетельствуют о селекции p.L130F, p.T155I, p.R196Q, p.G244S, p.V272E, p.A276V, p.R213X и p.A189Pfs на этапах опухолевой прогрессии и не случайном их обнаружении у больных ДВККЛ.
В ходе исследования впервые было показано наличие при ДВККЛ патогенетически значимых интронных и сеймсенс-замен, что свидетельствует о важности как анализа прилетающих к экзонам некодирующих участков гена, так и биоинформационного анализа выявленных синонимичных замен. Из выявленных нами в группе больных ДВККЛ мутаций две могут влиять на сплайсинг молекулы РНК. К ним относятся сеймсенс-замена р.А307А и IVS6-36G>C. Функциональная значимость IVS6-36G>C была доказана в эксперименте in vitro [24]. Согласно прогнозу TP53 Mutant
assessor (release 1.00, 2012), p.A307A также находится в сайте сплайсинга молекулы РНК. Несмотря на то, что при сеймсенс-мутациях вновь образующийся кодон продолжает кодировать ту же аминокислоту, что обусловлено вырожденностью генетического кода, считается, что мутации данного типа могут менять сплайсинг, транскрипцию и стабильность РНК.
Функциональный эффект незатронутых в обсуждении интронных и сеймсенс-мута-ций, выявленных в группе больных ДВККЛ, остается неизвестным. Вместе с тем, они потенциально могут влиять не только на сплайсинг мРНК, но и на экспрессию гена, нарушая авторегуляцию процессинга.
Имеющиеся в литературе единичные сообщения о низкой частоте метилирования промотора гена ТР53 при ДВККЛ [12] были проверены на исследуемой группе больных г. Новосибирска. Частота метилирования промотора гена ТР53 в обследованной выборке больных ДВККЛ составила 5,8 % и значимо не различалась в подгруппах с мутант-ной (4,2 %) и нормальной (6,7 %) структурой гена, а также с результатами K. Amara и соавт. [12] (3,7 %).
Анализ ПГ в гене ТР53 был выполнен у 24 больных ДВККЛ группы исследования, из них 13 человек имели мутации и 11 — отсутствие изменений в последовательности гена ТР53. По данным анализа микросателлитного маркера D17S796, расположенного рядом с ТР53, выявлены 6 (25%) случаев ПГ, что соответствовало данным литературы [40].
В 2011 г. в ходе проекта по полногеномному секвенированию впервые был описан наследуемый полиморфизм rs78378222 3-НТП TP53, приводящий к нарушению процессинга 3'-конца м-РНК [19]. Он затрагивает сигнал полиаденилирования ТР53, приводя к изменению канонической последовательности AATAAA на AATACA. Данный сигнал необходим для распознавания аппаратом полиаде-нилирования, последующего расщепления, полиаденилирования, и экспорта зрелых мРНК в цитоплазму [25]. Функциональный анализ показал, что rs78378222 приводит к снижению как экспрессии р53, так и уровня апоптоза в клетках [27].
Строгое эволюционное закрепление сигнала полиаденилирования гена ТР53 было показано при исследовании генома 63 видов млекопитающих, а также древней ДНК
неандертальцев и образцов Денисова [27]. Ни один из исследованных образцов ДНК не имел изменений в локусе rs78378222.
Однако в 2013 году Li et al. впервые сообщили о прогностическом значении аберраций в 3'-НТП гена ТР53 при ДВККЛ, а также об обнаружении rs78378222 в опухолевой ткани больных ДВККЛ [25]. Учитывая наличие таких данных, нами был выполнен анализ распространенности данного маркера в опухолевой ткани пациентов с ДВККЛ г. Новосибирска.
Генотипирование 92 образцов ДНК показало, что 9 (9,8%) из них имели rs78378222. Наличие редкого аллеля С данного маркера подтверждалось методом секвенирования по Сэнгеру.
Wang et al. (2016) провели первый мета-анализ ассоциации маркера с риском развития опухолей. В исследование были включены 34 работы с общей численностью 36 599 случаев и 91 272 контролей. Результаты показали, что rs78378222 гена TP53 был значимо связан с повышенным риском развития онкологических заболеваний в целом (AC vs. AA: OR = 1,5, 95 % CI = 1,3-1,8). Таким образом, было доказано, что аллель C rs78378222 является важным фактором риска развития опухолей у человека [36]. Из миллионов полиморфизмов в геноме человека rs78378222 имеет самую сильную ассоциацию с базаль-ноклеточной карциномой.
Обращает на себя внимание следующий факт. Ни в одном из опубликованных в настоящее время исследований, описанных в литературе, редкий аллель C rs78378222 в здоровой ткани не встречался в гомозиготном состоянии [25]. Вместе с тем, часть проанализированных нами образцов опухолевой ткани ДВККЛ имели генотип С/С rs78378222. Все они представляют собой случаи потери гетерозиготности в гене ТР53 у носителей гетерозиготного генотипа А/С rs78378222 в опухолевой ткани ДВККЛ.
Биологический смысл потери гетрозигот-ности в гене ТР53, имеющем редкий аллель С rs78378222, при ДВККЛ может быть в следующем. В клетках, имеющих rs78378222, было подтверждено снижение уровня м-РНК в сравнении с клетками без данного полиморфизма и наличием другого рядом расположенного маркера rs114831472. В случае обнаружения редкого аллеля С данного маркера уровень клеточного апоптоза был ниже, в сравнении с клетками с диким типом гена
ТР53. Эти данные показывают, что TP53 полиморфизм rs78378222 нарушает экспрессию p53 и угнетает апоптоз [36].
Также предполагается, что rs78378222 может нарушать связывание mir-545 с 3'-НТП TP53 [43]. Поскольку сайты связывания микро-РНК расположены преимущественно на 3'-НТП генов, наследуемые варианты 3'-НТП ТР53 могут значительно влиять на экспрессию гена путем отмены, ослабления или создания нового сайта связывания.
Таким образом, rs78378222 представляет собой уникальный аллельный вариант TP53 со снижением функции р53. Потеря нормального аллеля А способствует значительному приросту злокачественного потенциала клеток [25,32]. Интересно, что описанное в настоящем исследовании наблюдение не является уникальным. В работе Li et al. было показано, что 1/7 случаев выявления rs78378222 в опухолевой ткани ДВККЛ также имел гомозиготный генотип С/С [25].
Еще одна исследовательская группа Wang et al. (2015) провела интегративный анализ данных Cancer Genome Atlas для двух опухолевых нозологий: глиобластомы и адено-карциномы легкого [37]. Используя данные секвенирования мРНК ТР53, авторы установили, что транскрипты гена, имеющие редкий аллель С rs78378222, на ~ 3 кЬ длиннее, чем транскрипты гена с аллелем А, что препятствовало трансляции полноценного белка р53 [37].
Биоинформационный анализ данных сек-венирования экзома опухолевой ткани показал, что при глиобластомах, в отличие от аденокарциномы легкого, происходит потеря гаплотипа, несущего защитный аллель
А. Авторы предположили, что потеря области генома, несущего частый защитный аллель А, происходит во время инициации опухоли или прогрессии глиомы [37].
Таким образом, эффект гб78378222 на про-цессинг 3'-конца представляет собой еще один механизм онкогенеза, подтвержденный на опухолях различного происхождения, который способствует формированию дефицита ТР53 при опухолевой прогрессии ДВККЛ.
Комплексный анализ изменчивости гена показывает, что недостаточность функции ТР53 при ДВККЛ может формироваться по «двух-ударному» принципу. Согласно нему, для перехода нормальной В-клетки в опухолевую при возникновении, по меньшей мере, части случаев ДВККЛ могут быть необходимы два последовательных события (рис. 4). Первое событие — это мутация или метилирование промотора ТР53, приводящие к образованию клетки с повышенным риском злокачественной трансформации. Для реализации опухолевого потенциала в клетке должно случиться второе событие — потеря неповрежденного алле-ля гена.
Явление потери гетерозиготности в гене ТР53 у носителей гетерозиготного генотипа А/С гб78378222 в опухолевой ткани ДВККЛ также является ни чем иным, как примером классического «двух-ударного» механизма канцерогенеза, описанного А. Кнудсоном в 1971 г. [23]. Согласно ему, для развития опухоли необходимы последовательные изменения обоих аллелей антионкогена, одного в зародышевой линии, а второго — за счет соматических аберраций.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Воропаева Е. Н., ВоеводаМ. И., Поспелова Т. И., Максимов В. Н. Интронные полиморфизмы антионкогена ТР53 у пациентов старшей возрастной группы с индолентными вариантами неходжкинских злокачественных лимфом. Успехи геронтологии 2013; 26(2): 258-262.
2. Воропаева Е. Н., ВоеводаМ. И., Поспелова Т. И., Максимов В. Н. Неравновесие по сцеплению полиморфных маркеров гб1042522, гб1625895 и гб17878362 и гаплотипы гена ТР53 у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Молекулярная биология 2014; 48(5): 763-770.
3. Воропаева Е. Н., Поспелова Т. И., Воевода М. И., Максимов В. Н. Обнаружение полиморфизма гб78378222 гена ТР53 в опухолевой ткани больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Сибирский научный медицинский журнал 2016; 36(5): 20-27.
4. Воропаева Е. Н., Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Максимов В. Н. Результаты комплексного анализа статуса гена ТР53 у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Гематология и трансфузиология 2016; 61(3): 138-143.
5. Воропаева Е. Н., Поспелова Т. И., ВоеводаМ. И., Максимов В. Н. Сравнительный анализ мутаций в гене ТР53 у больных ДВККЛ г. Новосибирска с данными, представленными в IARC TP53 mutation database. Медицинская генетика 2016; 15(4): 17-20.
6. Копнин Б. П., КопнинП.Б., Хромова Н. В., Агапова Л. С. Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опухольсупрессирующих и онкогенных активностей. Клиническая онко-гематология 2008; 1(1): 2-9.
7. ПоспеловаТ.И., ВоеводаМ.И., ВоропаеваЕ.Н., БелявскаяВ.А. и др. Функциональный полиморфизм гена р53 у больных неходжкинскими лимфомами. Вестник гематологии 2008; 4(4): 23-28.
8. ПоспеловаТ.И., ВоропаеваЕ.Н., ВоеводаМ.И., Березина О. В. Полиморфизм гена р53 как потенциальный маркер предрасположенности к развитию неходжкинских злокачественных лимфом. Гематология и трансфузиология 2010; 55(1): 11-17.
9. Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б., Агеева Т. А. и др. Основы опухолевой прогрессии гемобластозов. Сибирский научный медицинский журнал 2004; 24(2): 71-73.
10. Сметанникова Н. А., Максимов В. Н., Устинов С. Н., Степанова Т. В. и др. Генотипы и гаплоти-пы гена-онкосупрессора р53: ассоциация с продолжительностью жизни у русских Новосибирской области. Сибирский онкологический журнал 2006; 2: 37-41.
11. ТрифноваЕ.А., СпиридоноваМ.Г., ГабидулинаТ.В., УрновФ. Д. и др. Анализ структуры неравновесия по сцеплению и ассоциации полиморфных вариантов гена MTHFR с коронарным атеросклерозом. Генетика 2012; 48(10): 1207-1220.
12. AmaraK., TrimecheM., ZiadiS., LaatiriA. et al. Presence of simian virus 40 DNA sequences in diffuse large B-cell lymphomas in Tunisia correlates with aberrant promoter hypermethylation of multiple tumor suppressor genes. Int J Cancer 2007; 121(12): 2693-702.
13. AzzamG.A., Frank A. K., HollsteinM., Murphy M. E. Tissue-specific apoptotic effects of the p53 codon 72 polymorphism in a mouse model. Cell Cycle 2011; 10(9): 1352-1355.
14. Cherdyntseva N. V., DenisovE. V., Litviakov N. V., Maksimov V. N., et al. Crosstalk between the FGFR2 and TP53 genes in breast cancer: data from an association study and epistatic interaction analysis. DNA and cell biology 2011; 00(00): 1-12.
15. Chumakov P.M.Versatile functions of p53 protein in multicellular organisms. // Biochemistry 2007; 72(13): 1399-1421.
16. Conrad D. F., Jakobsson M., Coop G., Wen X. et al. A worldwide survey of haplotype variation and linkage disequilibrium in the human genome. Nat Genet 2006; 38: 1251-1260.
17. Diederichs S., Bartsch L., BerkmannJ.C., Frose K. et al. The dark matter of the cancer genome: aberrations in regulatory elements, untranslated regions, splice sites, non-coding RNA and synonymous mutations. EMBO Mol. Med. 2016; 8(5): 442-457.
18. Economopoulos K. P., Sergentanis T. N. Methodological remarks concerning the recent meta-analysis on p53 codon 72 polymorphism and colorectal cancer risk. Eur J Surg Oncol 2010; 36(12): 1225-1226.
19. Enciso-MoraV., HoskingF.J., Di StefanoA.L., ZelenikaD. et al. Low penetrance susceptibility to glioma is caused by the TP53 variant rs78378222. // Br J Cancer. 2013; 108: 2178-2185.
20. GudkovA.V., Komarova E.A. The role of p53 in determining sensitivity to radiotherapy. Nat Rev Cancer 2003; 3(2): 117-129.
21. http://p53.iarc.fr/DownloadDataset.aspx
22. Khrunin A. V., Tarskaia L. A., Spitsyn V. A., Lylova O. I., Bebyakova N. A., Mikulich A. I., Limborska S. A. 2005. p53 polymorphisms in Russia and Belarus: correlation of the 2-1-1 haplotype frequency with longitude. Mol Genet Genomics. 272(6), 666-72.
23. KnudsonA. G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1971. 68. 820-823.
24. 24. Lehman T.A., Haffty B. G., Carbone C.J., Bishop L. R. et al. Elevated frequency and functional activity of a specific germ-line p53 intron mutation in familial breast cancer. Cancer Res 2000; 60(4): 1062-9.
25. LiY., Gordon M.W., Xu-Monette Z.Y., Visco C. et al. Single nucleotide variation in the TP53 39 untranslated region in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab-CHOP: a report from the International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program. Blood 2013; 121(22): 4529-40.
26. Liang Y., LinS.Y., Brunicardi F. C.. DNA damage response pathways in tumor suppression and cancer treatment. World J Surg 2009; 33: 661-666.
27. MacedoG. S., Araujo Vieira I., Brandalize A. P., Giacomazzi J et al. Rare germline variant (rs78378222) in the TP53 3'UTR: Evidence for a new mechanism of cancer predisposition in Li-Fraumeni syndrome. Cancer Genetics 2016; 209: 97-106.
28. Ozeki C., Sawai Y., Shibata T., Kohno T. et al. Cancer susceptibility polymorphism of p53 at codon 72 affects phosphorylation and degradation of p53 protein. J Biol Chem 2011; 286(20): 1825118260.
29. Paskulin D. D., Cunha-Filho J.S.L., SouzaC.A.B., Bortolini M. C. et al. TP53 PIN3 and PEX4 polymorphisms and infertility associated with endometriosis or with post-in vitro fertilization implantation failure. Cell Death and Disease 2012; 3: e392.
30. Perez-Losada J., Castellanos-Martin A., Mao J. H. Cancer evolution and individual susceptibility. Integr Biol (Camb) 2011; 3(4): 316-328.
31. PetitjeanA., Achatz M. I., Borresen-Dale A.L., Hainaut P. et al. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes. Oncogene 2007; 26: 21572165.
32. Stacey S. N., Sulem P., Jonasdottir A., Masson G. et al. A germline variant in the TP53 polyadenylation signal confers cancer susceptibility. Nat Genet 2011; 43(11): 1098-1103.
33. Sun Y., Keshava C., Sharp D. S., Weston A. et al. DNA Sequence Variants of p53: Cancer and Aging. Am J Hum Genet 1999; 65(6): 1779-1782.
34. Tamimi Y., Al-Harthy S., Al-Haddabi I., Al-Kindi M. et al. The p53 mutation/deletion profle in a small cohort of the Omani population with Diffuse Large B-Cell Lymphoma. Sultan Qaboos University Med J 2014; 14(1): 50-58.
35. Ventura A., Kirsch D. G., McLaughlin M. E. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature 2007; 445(7128): 661-665.
36. Wang Y., Wu X. S., He J., Ma T., et al. A novel TP53 variant (rs78378222 A > C) in the polyadenylation signal is associated with increased cancersusceptibility: Evidence from a meta-analysis. Oncotarget 2016. doi: 10.18632/oncotarget.9056. [Epub ahead of print]
37. Wang Z., Rajaraman P., Melin B. S., Chung C. C., Zhang W., McKean-Cowdin R., Michaud D., Yeager M., Ahlbom A., Albanes D. et al. Further Confirmation of Germline Glioma Risk Variant rs78378222 in TP53 and Its Implication in Tumor Tissues via Integrative Analysis of TCGA Data. // Hum Mutat. 2015. 36(7). 684-688.
38. Weng Y., Lu L., Yuan G., Guo J. et al. p53 codon 72 polymorphism and hematological cancer risk: an update meta-analysis. PLoS One. 7(9), e45820.
39. WuX., ZhaoH., Amos C. I., Shete S., Makan N., HongW.K., Kadlubar F. F., Spitz M.R. 2002. P53 genotypes and haplotypes associated with lung cancer susceptibility and ethnicity. J Nat Cancer Inst 2012; 94: 681-690.
40. Xu-Monette Z.Y., Wu L., Visco C., TaiY. C. et al. Mutational profile and prognostic significance of TP53 in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with R-CHOP: report from an International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program Study. Blood 2012; 120(19): 3986-96.
41. Xu-Monette Z.Y., Medeiros L. J., Li Y., Orlowski R. Z. et al. Dysfunction of the TP53 tumor suppressor gene in lymphoid malignancies. Blood 2012; 119(16): 3668-3683.
42. Young K. H. Clinical Impact of TP53 gene mutations in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL): an international DLBCL Rituxan-CHOP Consortium Program Study. Blood 2009; 114: 399-400.
