CC BY
66
Оригинальная статья
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616-006.441:575.08
Воропаева Е.Н.1, Поспелова Т.И.2, Воевода М.И.1, Максимов В.Н.1
РЕЗУЛЬТАТЫ КОМПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА СТАТУСА ГЕНА ТР53 У БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМОЙ
1 ФГБНУ НИИ терапии и профилактической медицины, 630089, г. Новосибирск, Россия;
2 ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России,
630089, г. Новосибирск, Россия
В настоящее время отсутствует комплексное описание изменчивости гена ТР53 при диффузной В-крупноклеточной лимфоме (В-ККЛ). В ходе проведенного исследования описаны частота, спектр и функциональная значимость мутаций в гене ТР53 у 74 больных диффузной В-ККЛ г. Новосибирска. Показано, что локализация «горячих точек» мутаций в обследованной выборке больных диффузной В-ККЛ отличалась от данных, представленных в IARC TP53 mutation database. Выявлено наличие при диффузной В-ККЛ патогенетически значимых интронных и сеймсенс-замен. Частота метилирования промотора ТР53 в группе исследования составила 5,8%. Потеря гетерозиготности в гене наблюдалась у 25% больных диффузной В-ККЛ и была отмечена только в подгруппе больных с измененным статусом ТР53 (мутации или метилирование промотора). Полученные результаты свидетельствуют, что при диффузной В-кКл происходит селекция функционально значимых мутаций в участках TP53, кодирующих ДНК-связывающий регион, а недостаточность функции данного гена может формироваться по двухударному принципу.
Ключевые слова: диффузная В-крупноклеточная лимфома; ген ТР53; метилирование промотора; потеря гетерозиготности; мутации; секвенирование.
Для цитирования: Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Воевода М.И., Максимов В.Н. Результаты комплексного анализа статуса гена ТР53 у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Гематология и трансфузиология. 2016; 61(3): 138-143. DOI: 10.18821/0234-5730-2016-61-3-138-143
Voropaeva E.N.', Pospelova T.I.2, Voevoda M.I.', Maksimov V.N.1
THE RESULTS OF COMPLEX ANALYSIS OF TP53 GENE STATUS IN PATIENTS WITH DIFFUSE LARGE CELL LYMPHOMA
'Institute of Internal and Preventive Medicine, Novosibirsk, 630089, Russian Federation;
2Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, 630091, Russian Federation Analysis of the literature shows that there is no comprehensive description of the variability of TP53 gene in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). The frequency, spectrum and functional significance of mutations in the TP53 gene were investigated at 74 DLBCL patients. The localization of mutations "hot spots" in the studied sample of patients with DLBCL was shown to be differed from the data presented in IARC TP53 mutation database. The occurrence of DLBCL with pathogenetic intron and synonymous replacements was revealed. The frequency of TP53 promoter methylation in the study group was 5.8%. The loss of heterozygosity in the gene was observed in 25% of cases and only in a subset of patients with modified (mutation or promoter methylation) status of the TP53 gene. The results indicate to the selection of functionally significant mutations in the TP53 DNA-binding region in DLBCL. The lack of function of the gene in DLBCL was shown to be possibly formed on the two-hit principle. Keywords: gene TP53; diffuse large B-cell lymphoma; promoter methylation; loss of heterozygosity; mutations; sequencing
For citation: Voropaeva E.N., Pospelova T.I., Voevoda M.I., Maksimov V.N. The results of comprehensive analysis of TP53 gene status in patients with diffuse large cell lymphoma. Hematology and Transfusiology. Russian journal (Gematologiya i transfusiologiya). 2016; 61(3): 138-143.
(in Russian). D0I:10.18821/0234-5730-2016-61-3-138-143_
Funding. The study was executed with the financial support of the Grant of the President of Russian Federation for the State support of leading scientific schools "The role of molecular genetic factors in the formation of predisposition, tumor progression and development of complications of therapy of tumor diseases of the blood system. (project No 10240.2016.7). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 20 Apr 2016 Accepted 17 July 2016
Диффузная В-крупноклеточная лимфома (В-ККЛ) - опухоль, характеризующаяся диффузной пролиферацией атипичных крупных лимфоцитов с везикулярным ядром, ярко выраженными ядрышками и базофильной цитоплазмой. Диффузная В-ККЛ составляет около трети случаев неходжкинских лимфом взрослых: до 25-30% в развитых и 30-40% в развивающихся странах, что делает этот вариант лимфом одним из самых частых в мире [1].
Для корреспонденции:
Воропаева Елена Николаевна, кандидат мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний ФГБНУ НИИ терапии и профилактической медицины, 630083, г. Новосибирск, Россия. E-mail: vena.81@mail.ru.
For correspondence:
Voropaeva Elena N., MD, PhD, Senior Researcher of the Laboratory of molecular genetic studies of therapeutic diseases of the Institute of Internal and Preventive Medicine, Novosibirsk, 630089, Russian Federation. E-mail: vena.81@mail.ru. Information about authors:
Voropaeva E.N., http://orcid.org/0000-0001-7542-7285; Pospelova T.I., http://orcid.org/0000-0002-1261-5470; Voevoda M.I., http://orcid.org/0000-0001-9425-413X; Maksimov V.N., https://orcid.org/0000-0002-7165-4496.
Этиология диффузной В-ККЛ остается неизвестной. Среди факторов риска заболевания выделяют генетическую предрасположенность (наследственность, полиморфизм генов), коморбидные состояния (иммуносупрессия, инфицирование вирусом Эпштейна-Барр, хроническое воспаление), неблагоприятные воздействия внешней среды (ионизирующее излучение, солнечная радиация, пестициды) и ожирение [1, 2].
Одним из важнейших патогенетических механизмов, лежащих в основе развития В-ККЛ, является генетическая нестабильность клеток лимфоидного ряда как часть нормального развития В-лимфоцитов, которая может приводить к предопухолевым генетическим изменениям. В результате на одном из этапов созревания лимфоидных клеток происходит нарушение В-клеточного гомеоста-за с неконтролируемой пролиферацией, блоком дифференцировки и иммортализацией В-лимфоцита [3].
Генетические факторы, нарушающие репарацию ДНК или процесс программированной клеточной смерти, повышают вероятность возникновения предопухолевых событий. Повреждения генома В-лимфоцитов, которые не были репарированы или элиминированы путем апоптоза, в последующем могут модулироваться средо-выми воздействиями, эпигенетическими факторами (гипо-гипер-
Original article
tüH
M HM M HM M HM M HM M HM M нм 1 2 3 К 4 5
Рис. 1. Анализ статуса метилирования промотора гена ТР53: результаты метилспецифической ПЦР с фланкирующими прай-мерами, электрофорез в 8% полиакриламидном геле.
М - ПЦР с праймерами, специфичными к метилированному аллелю (длина продукта 166 пн), НМ - ПЦР с праймерами, специфичными к неметилированному аллелю (длина продукта 170 пн), 1-5 номера случаев: 1, 2, 4 - норма; 3, 5 - метилирование; К - контрольные ДНК.
метилирование), сопутствующими заболеваниями (аутоиммунными), генетическим полиморфизмом и запустить дальнейшее развитие опухоли [4].
Белок р53 - ядерный фосфопротеин молекулярной массой 53 кД, основная роль которого заключается в обеспечении экстренного удаления поврежденных и потенциально опасных для организма клеток [5]. Опухольсупрессирующая функция его обусловлена участием в таких процессах, как контроль клеточного цикла, репарация ДНК, апоптоз, старение и аутофагия как через транскрипционно-зависимые, так и транскрипционно-независимые механизмы [6]. Под действием стресса лимфоциты склонны к р53-опосредованному апоптозу в отличие от других типов клеток, подверженных остановке клеточного цикла, р53-независимому апоптозу или некрозу [7]. По этой причине нарушение функции гена ТР53 является основополагающим для развития и прогрессии лимфопро-лиферативных заболеваний [7, 8].
В В-лимфоцитах с инактивацией ТР53 отмечается увеличение выраженности генетической нестабильности, являющейся промотором дальнейшей опухолевой прогрессии и ускользания злокачественной клетки от иммунной системы, а также терапевтического воздействия. В условиях дефицита его функции увеличивается темп поликлональной эволюции В-клеток с самыми разными генетическими аномалиями: измененным числом и перестройками хромосом, генными мутациями, амплификацией отдельных участков генома [9].
Дисфункция гена ТР53 может быть результатом нарушений в структуре самого гена, изменения процессов транскрипции и стабильности м-РНК, дефекта посттрансляционных модификаций и взаимодействий белка р53. Возможно, молекулярные механизмы на уровне молекулы ДНК, приводящие к дефициту ТР53, включают генные мутации, метилирование промотора, аллельный дисбаланс и генетический полиморфизм [4].
Анализ базы данных dbSNP [10] показывает, что в гене ТР53 (данные на январь 2016 г.) было зарегистрировано около 700 вариантов однонуклеотидных замен, из них 50 цитируются в базе Pubmed, и только 83 полиморфизма имеют Global MAF более 1%: 4 -миссенс замены, 71 - интронные, 5 - 5'-нетранслируемой и 3 -З'-нетранслируемой последовательности маркера [11].
Лишь 20 полиморфных вариантов гена ТР53 встречаются в популяции с частотой более 5% и могут представлять реальный клинический интерес. Большинство из них за редким исключением при биоинформационном предсказании не имеет функционального значения [12]. Некоторые из этих полиморфизмов TP53 в популяциях человека вызывают значимое изменение функции р53, три из них (rs1042522, rs17878362 и rs1625895) хорошо изучены в плане функциональных характеристик, распространенности в популяции и ассоциации с риском опухолей [12]. Проведенные нами ранее исследования [13, 14] показали, что данные маркеры гена TP53, в том числе в составе гаплотипных групп, могут быть как факторами риска диффузной В-ККЛ, так и быть ассоциированными с прогрессией заболевания и эффективностью противоопухолевой терапии.
Литературный поиск показывает, что делеция 17р13.1, приводящая к потере гетерозиготности (ПГ) в гене ТР53, при диффузной В-ККЛ регистрировалась с большим разбросом частот между исследованиями: от 30,4 до 42% по данным китайских авторов [15-17], от 40 до 50,4% - в чешской [18, 19], 30,4% - арабской [20], 22,5% -австрийской популяциях [21]. Наименьшая (22,2%) частота деле-ции 17р13.1 была показана в исследовании International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program Study [22], объединяющем выборки больных 16 гематологических центров США, Швейцарии, Нидерландов, Германии, Италии и Испании.
К о к о к о
1 2 3
Рис. 2. Анализ микросателлитной нестабильности в локусе D17S796: результаты ПЦР с фланкирующими праймерами, электрофорез в 8% полиакриламидном геле (длина продукта 144-174 пн).
К - ДНК крови, О - ДНК опухолевой ткани, 1-3 номера случаев: 1, 3 - потеря гетерозиготности; 2 - норма.
Наиболее изученным аспектом изменчивости гена ТР53 при диффузной В-ККЛ является анализ его кодирующей последовательности на наличие мутаций. Показано, что частота мутации в гене ТР53 при диффузной В-ККЛ достигает 20% и более [23].
В 1990 г. была организована база данных IARC TP53 mutation database для регистрации мутаций в данном гене, которая в настоящее время содержит информацию о более чем 30 000 соматических мутаций и 700 мутациях зародышевой линии [24]. Ее анализ показывает, что при диффузной В-ККЛ в ТР53 описано более 120 мутаций. Из них 95% составили однонуклеотидные замены: 88% - миссенс, 7% - нонсенс-мутации, 5% - мутации со сдвигом рамки считывания. Более 95% мутаций было выявлено в экзонах 5-8 гена, мутации в экзонах 9-11 описаны не были. «Горячими точками» мутаций в гене ТР53 при диффузной В-ККЛ были следующие кодоны в порядке убывания частоты: 248, 273, 175, 245, 281, 244, 305, 249 и 297 [25].
Однако преобладание так называемых «горячих точек» может меняться в зависимости как от варианта опухоли, так и этнического происхождения исследуемой выборки пациентов [26]. Сравнительный анализ мутаций ТР53 показывает, что их частота и спектр при одном и том же типе онкологической патологии также могут значительно меняться в зависимости от исследуемой популяции [27]. Информация о российской популяции в текущей версии IARC TP53 mutation database не представлена.
Подавляющее большинство работ, изучающих роль изменений в нуклеотидной последовательности ТР53, было сосредоточено на анализе 5-8-го экзонов гена. Интронные регионы не исследовались. Вместе с тем эти последовательности потенциально могут влиять не только на сплайсинг м-РНК, но и на экспрессию гена, нарушая авторегуляцию процессинга, нормальное прохождение посттранскрипционных модификаций м-РНК и посттрансляционных изменений белка [28-30].
Связь между гиперметилированием промотора ТР53 и снижением уровня транскрипции гена была показана на ряде опухолей [4, 31, 32]. Несмотря на широкое изучение метилирования данного гена при раках, этот вопрос менее изучен при гемобластозах и практически не разработан при лимфопролиферативных заболеваниях [4]. Например, при остром лимфобластном лейкозе метилирование промотора ТР53 регистрируют у трети пациентов [33], а при хроническом лимфолейкозе - в каждом пятом случае [4]. В литературе имеются лишь единичные сообщения о частоте метилирования промотора гена ТР53 при диффузной В-ККЛ [34]. Комплексное описание изменчивости гена ТР53 при диффузной В-ККЛ отсутствует.
Цель исследования - описать частоту гиперметилирования и потери гетерозиготности, а также частоту, спектр и функциональную значимость мутаций в кодирующих и интронных участках гена ТР53 у больных диффузной В-ККЛ г. Новосибирска.
Материал и методы
Группу обследования составили 74 больных диффузной В-ККЛ (35 мужчин и 39 женщин) в возрасте от 21 года до 78 лет (средний возраст 52,8 ± 14,3 года), госпитализированных в Городской гематологический центр г. Новосибирска за период 2012-2015 гг. 91% обследованных имели продвинутые (III и IV) стадии заболевания и 2/3 - неблагоприятный прогноз по Международному прогностическому индексу [35].
Исследование было одобрено локальным этическим комитетом. Все пациенты подписали информированное согласие до включения в исследование.
Оригинальная статья
Общая характеристика результатов секвенирования
Таблица 1
Интронные В кодирующей последовательности гена ТР53
c неизвестным эффектом влияние на плайсинг нонсенс сдвиг рамки считывания миссенс сеймсенс
Таблица 2 Сравнение спектра выявленных мутаций в гене ТР53 с данными базы ТАЯС (р > 0,05)
IVS4-30r>C
IVS5+43G>T
IVS5-17r>C
IVS7+31G>C*
^8+100А*
IVS8+20A>G
IVS8+37A>G
IVS9+12^C*
(rs1800899)
IVS6-36G>C p.R213X p.A189Pfs
p.Ll30F p.W146R* p.Tl55I* p.Rl56C p.Rl96Q p.G244S p.V272E* p.A276V p.G293R
р.V157V р.Н179Н p.L252L р.V272V p.G302G р.A307A
Примечание. * - мутации, встреченные в группе обследования дважды.
Частота, %
Тип замены нуклеотида в выборке в базе данных мутаций в гене TP53 IARC
GC>AT в CpG 15,6 26
GC>AT 34,4 25
GC>CG 3,1 8
GC>TA 9,4 lO
AT>GC 12,5 l3
AT>CG 12,5 5
AT>TA 12,5 8
Геномная ДНК была выделена из парафиновых блоков биоптатов опухолевых лимфатических узлов и экстранодальных очагов поражения методом фенольно-хлороформной экстракции с применением гуаниди-на. На исследование брали срезы ткани, содержащие не менее 80-90% опухолевых клеток.
Прескрининг мутаций не проводили. Методом прямого секвени-рования по Сэнгеру был выполнен анализ кодирующей последовательности гена ТР53 (с 5-го по 10-й экзоны) и примыкающих участков интронов, согласно IARC protocol (2010 update) [36]. На первом этапе проводили наработку отдельных фрагментов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы геномной ДНК. Полученные ампликоны подвергали очистке от солей, не включившихся праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов на микроколонках с Sephadex G-50 medium ("GE Healthcare Bio-Sciences AB"). Секвениро-вание образцов осуществляли при помощи наборов BigDye® Terminator v3.1 ("Applied Biosystems") методом капиллярного электрофореза на аппарате Hitachi 3500 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems"). Анализ результатов секвенирования, выравнивание и сопоставление с референс-ной последовательностью (NG_017013) осуществляли с применением программ Chromas, SeqScape v.2.7, Sequence Scanner. Анализ биологической значимости обнаруженных мутаций выполняли с помощью баз данных и инструментов IARC TP53 Database и The TP53 UMD mutation database in human cancer [24, 37]. Дополнительно был проведен биоинформационный анализ миссенс-мутаций с помощью on-line программы Polymorphism Phenotyping 2 (Polyphen-2) [38].
Таблица 3
Результаты функционального анализа миссенс-мутаций гена ТР53
Мутация Функциональный прогноз Активность белка р53 в экспериментах in vitro [ссылка]
PolyРhen-2 (характер мутации) SIFT (характер мутации) Mut ass (степень патоген-ности)
p.Ll30F Возможно Опасная Высокая Не активен
патогенная [41]
p.W146R Не патогенная Нейтральная Низкая Незначительно
снижена [41]
p.Tl55I Возможно Опасная Средняя Не активен
патогенная [41-43]
p.Rl56C Не патогенная Нейтральная Низкая Гиперактивен
[41, 44]
p.Rl96Q Возможно Опасная Высокая Не активен
патогенная [45]
p.G244S Возможно Опасная Средняя Не активен
патогенная [42, 46]
p.V272E Возможно Опасная Высокая Не активен
патогенная [41]
p.A276V Возможно Опасная Средняя Не активен
патогенная [43]
p.G293R Не патогенная Нейтральная Средняя Незначительно
снижена [41]
p.A276V Возможно Опасная Средняя Не активен
патогенная [45]
p.G293R Не патогенная Нейтральная Средняя Незначительно
снижена [41]
Бисульфитную конверсию образцов ДНК осуществляли наборами EZ DNA Methylation Kit ("Zymo research", США) согласно протоколу производителя. В реакцию брали 300-500 нг ДНК.
Анализ статуса метилирования промотора гена ТР53 проводили методом метилспецифической ПЦР на бисульфитконвертированной ДНК в двух пробирках: с праймерами, специфичными к метилированному и неметилированному аллелю, согласно методике, описанной ранее [39]. По методологическим причинам анализ статуса метилирования промотора гена ТР53 методом метилспецифической ПЦР был выполнен у 69 больных диффузной В-ККЛ (рис. 1).
Оценку потери гетерозиготности в гене ТР53 проводили по микро-сателлитному локусу D17S796 методом ПЦР [40]. Для анализа были доступны 24 пары образцов опухолевой и нормальной ткани больных диффузной В-ККЛ группы исследования (рис. 2).
Сравнение частот типов нуклеотидных замен в гене ТР53 при диффузной В-ККЛ в обследованной выборке больных и в IARC TP53 mutation database проводили с помощью статистических методов Х2-Пирсона и точного критерия Фишера. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми прир < 0,05.
Результаты
Мутации в кодирующей и интронных последовательностях гена ТР53
В ходе анализа опухолевого материала от 74 больных диффузной В-ККЛ было выявлено 33 мутации: 21 в кодирующей, 12 в интронных последовательностях гена ТР53 (рис. 3, см. на обложке). Распределение мутаций было следующим (табл. 1): 1 (3%) мутация, приводящая к нарушению сплайсинга молекулы РНК, 11 (33%) -интронных с неизвестным эффектом, 12 (37%) - миссенс, 6 (18%) -сеймсенс, 2 (6%) - нонсенс-типа, 1 (3%) - мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания в гене ТР53.
Все находки за исключением A189Pfs (96,9%) представляли собой однонуклеотидные замены, 5 (15,6%) из которых были мутации типа GC>AT в CpG островках. Замены GC>AT составили 34,4%, GC>CG - 3,1%, GC>TA - 9,4%, AT>GC - 12,5%, AT>CG - 12,5%, AT>TA - 12,5%, что значимо не различается от данных, представленных в IARC TP53 mutation database (табл. 2).
Все выявленные нами в исследуемой выборке больных диффузной В-ККЛ мутации в кодирующей последовательности гена ТР53 описаны ранее в IARC TP53 mutation database [24] при других онкологических заболеваниях и были расположены в 5-8-м экзонах гена.
В обследованной выборке 4 (6,8%) больных имели множественные мутации, а ряд находок встречался неоднократно (в 2 случаях каждая): в кодирующей последовательности - p.W146R, p.T155I, p.V272E, p.R213X, в интронных областях IVS7+31G>C, IVS9+12T>C и IVS8+10C>A (см. табл. 1).
Анализ биологической значимости всех выявленных нами в исследуемой выборке больных диффузной В-ККЛ миссенс-мутаций в гене ТР53 показал следующие данные (табл. 3). Мутации p.L130F, p.T155I, p.R196Q, p.G244S, p.V272E, p.A276V, приводящие к появлению белка, утрачивающего функциональную активность, всеми тремя прогностическими программами были отнесены к повреждающим, вредным или с высокой/средней степенью опасности заменам. Тогда как мутации р.W146R и p.G293R, незначительно снижающие активность р53, а также p.R156C с гиперактивным продуктом, были отнесены к неопасным, нейтральным или с низкой/средней степенью опасности заменам.
Биологическая значимость мутаций p.R213X и p.A189Pfs не вызывает сомнений, поскольку обе они приводят к появлению усеченного белка р53 с нулевой активностью.
Сложнее оценить эффект сеймсенс-мутаций, выявленных в исследуемой выборке, поскольку они являются синонимическими
Original article
заменами нуклеотидов, которые характеризиру-ются сохранением смысла кодирующего кодона. Согласно прогнозу TP53 Mutant assessor, из сеймсенс-мутаций наибольшего внимания заслуживает замена р.А307А ввиду того, что 307-й кодон близок к концу экзона и потенциально может находиться в сайте сплайсинга молекулы РНК [47].
Функциональный эффект большинства ин-тронных мутаций, выявленных в группе больных диффузной В-ККЛ, точно не известен. Одна из биологически значимых мутаций гена ТР53 (IVS6-36G>C) расположена в 6-м интроне гена. Она относится к изменениям, влияющим на сплайсинг, согласно The TP53 UMD mutation database in human cancer [24]. В эксперименте in vitro было продемонстрировано, что данная замена в отсутствие изменений в кодирующей последовательности гена приводит к выживанию клеток в условиях химиотерапии и длительно ингибирует апоптоз [48].
Среди интронных мутаций также следует отметить IVS4-30T>C ввиду того, что в 4-м интроне ТР53 расположен альтернативный промотор гена, участвующий в синтезе изоформы delta133, которая в норме экспрессируется в лимфоидной ткани [49].
Анализ аллельного дисбаланса и статуса метилирования гена ТР53
Частота метилирования промотора гена ТР53 в обследованной выборке из 69 больных диффузной В-ККЛ составила 4 (5,8%) и значимо не различалась (р = 0,5663) в подгруппах с мутантной - у 1 (4,2%) из 24 и нормальной структурой гена у 3 (6,7%) из 45.
Анализ ПГ в гене ТР53 по микросателлитному маркеру D17S796 был выполнен у 24 больных диффузной В-ККЛ группы исследования, из них у 13 человек обнаружены мутации, у 11 отсутствовали изменения в последовательности гена ТР53. Были выявлены 6 (25%) случаев ПГ, из них 5 (83,3%) случаев ПГ приходились на больных, у которых в ходе секвенирования были выявлены мутации в последовательности 5-8-го экзонов и прилегающих участков интронов ТР53. В единственном случае ПГ у больного диффузной В-ККЛ без мутаций обнаружено метилирование промотора гена.
Обсуждение
Спектр однонуклеотидных замен, выявленных в группе больных диффузной В-ККЛ, значимо не различался с данными, представленными в IARC TP53 mutation database. Преобладали (95%) мутации в участках гена TP53, кодирующих ДНК-связывающий регион. Мутация p.G293R - единственная из выявленных миссенс-замен, которая не затрагивает функциональнозначимого ДНК-связывающего домена р53.
Анализ базы данных IARC TP53 mutation database показал, что все функционально значимые мутации, выявленные нами в группе обследования, были описаны ранее при широком круге новообразований человека. Кодоны 196 и 213 при всех опухолях и кодон 244 при гемобластозах вообще и диффузной В-ККЛ в частности являются «горячими точками» мутаций в гене ТР53 [25]. Более того, описаны случаи синдрома LiFraumeni [25], для которого характерно развитие первично-множественных злокачественных новообразований, вызванных герминогенными мутациями p.R213X, р.G244S, p.L130F и p.T155I, аналогичными описанным нами.
В ходе исследования за исключением 244-го кодона не выявлено мутаций в большей части кодонов (248, 273, 175, 245, 281, 305, 249 и 297), для которых в IARC TP53 mutation database описано наибольшее количество мутаций в гене ТР53 при диффузной В-ККЛ. В анализируемой выборке больных кодоны 275, 155, 272 и 212 являлись «горячими точками» мутаций.
Анализ публикаций [44-46, 50], посвященных изучению последствий мутаций гена ТР53, показывает, что каждая из них может иметь разнонаправленные эффекты на различные аспекты функционирования р53. Эти эффекты могут быть условно разделены на последствия для структурных характеристик белка, его биохимических свойств и биологической активности, а также в ряде случаев приводить к приобретению р53 новых функций, не свойственных белку нормального типа. Таким образом, каждая из мутантных форм белка является уникальным продуктом мутации и может сочетать в себе как усиление или снижение определенных видов активности р53, так и нарушение его структуры или приобретение белком новых свойств.
К появлению функционально неактивного белка р53 в обследованной выборке больных диффузной В-ККЛ приводили миссенс-
Рис. 4. Возможный двухударный механизм формирования дефицита функции гена ТР53 при диффузной В-ККЛ.
мутации p.L130F, p.T155I, p.R196Q, p.G244S, p.V272E и p.A276V наряду с мутацией p.A189Pfs, приводящей к сдвигу рамки считывания, нонсенс заменой p.R213X и сплайс-мутацией IVS6-36G>C. Все описанные выше события в кодирующей части гена приходятся на регионы, несущие информацию о высококонсервативных участках ДНК-связывающего домена белка, закрепленных эволюционно в филогенезе, и встречающихся в большинстве изоформ р53, а также структуре белков-гомологов р63 и р73.
Мутации p.R213X и р.G244S, а также p.V272E ранее уже были описаны при диффузной В-ККЛ [51, 52], а выявленная нами р.Т1551 ранее была зарегистрирована у нескольких больных ХЛЛ и ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и низкой эффективностью его терапии [53]. Среди случаев с гемобластозами p.V272E ранее была описана при лимфоме Беркитта, болезни Ходжкина и В-клеточных НХЛ [25].
Все эти данные свидетельствуют о селекции p.L130F, p.T155I, p.R196Q, p.G244S, p.V272E, p.A276V, p.R213X и p.A189Pfs на этапах опухолевой прогрессии и не случайном их обнаружении у больных диффузной В-ККЛ.
По результатам анализа из выявленных в обследованной группе больных диффузной В-ККЛ лишь у 2 миссенс-замены (p.W146R и p.G293R) существенно не отражались на функции р53, а p.R156C приводил к появлению гиперактивного мутантного белка.
Из выявленных нами в группе больных диффузной В-ККЛ мутаций две могут влиять на сплайсинг молекулы РНК. К ним относятся сеймсенс-замена р.А307А и IVS6-36G>C. Функциональная значимость IVS6-36G>C была доказана в эксперименте in vitro [48]. Согласно прогнозу TP53 Mutant assessor (release 1.00, 2012), р.А307А также находится в сайте сплайсинга молекулы РНК [47]. Несмотря на то что при сеймсенс-мутациях вновь образующийся кодон продолжает кодировать ту же аминокислоту, что обусловлено вырожденностью генетического кода, считается, что мутации данного типа могут менять сплайсинг, транскрипцию и стабильность РНК [24].
Функциональный эффект не затронутых в обсуждении интрон-ных и сеймсенс-мутаций, выявленных в группе больных диффузной В-ККЛ, остается неизвестными. Вместе с тем они потенциально могут влиять не только на сплайсинг мРНК, но и на экспрессию гена, нарушая авторегуляцию процессинга [28]. Также среди интронных мутаций следует отметить IVS4-30T>C ввиду того, что в 4-м интроне ТР53 расположен альтернативный промотор гена, участвующий в синтезе изоформ delta133 и delta160 р53 [49].
Имеющиеся в литературе единичные сообщения о низкой частоте метилирования промотора гена ТР53 при диффузной В-ККЛ [34] были проверены на исследуемой группе больных г. Новосибирска. Частота метилирования промотора гена ТР53 в обследованной выборке больных диффузной В-ККЛ составила 5,8% и значимо не различалась в подгруппах с мутантной (4,2%) и нормальной (6,7%) структурой гена, а также от данных K. Amara и соавт. (3,7%) [34].
Анализ ПГ в гене ТР53 был выполнен у 24 больных диффузной В-ККЛ группы исследования, из них 13 человек имели мутации, 11 - отсутствие изменений в последовательности гена ТР53. По данным анализа микросателлитного маркера D17S796, расположенного рядом с ТР53, выявлены 6 (25%) случаев ПГ, что соответствовало данным литературы [22].
Гематология и трансфузиология. 2016; 61(3) DOI 10.18821/0234-5730-2016-61-3-138-143
Оригинальная статья
При этом ПГ наблюдалась только в подгруппе больных с измененным статусом гена ТР53 (мутации - у 5 больных или метилирование промотора - у 1 больного), что составило 6 (42,9%) из 14 против 0% в группе из 10 больных с интактным геном (р = 0,0223).
Комплексный анализ изменчивости гена показывает, что недостаточность функции ТР53 при диффузной В-ККЛ может формироваться по двухударному принципу. Согласно ему, для перехода нормальной В-клетки в опухолевую при возникновении по меньшей мере части случаев диффузной В-ККЛ могут быть необходимы два последовательных события (рис. 4). Первое событие - это мутация или метилирование промотора ТР53, приводящие к образованию клетки с повышенным риском злокачественной трансформации. Для реализации опухолевого потенциала в клетке должно случиться второе событие - потеря неповрежденного аллеля гена.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о селекции при диффузной В-ККЛ функционально значимых мутаций в участках гена TP53, кодирующих ДНК-связывающий регион.
Локализация «горячих точек» мутаций в отличие от спектра однонуклеотидных замен в обследованной выборке больных диффузной В-ККЛ отличается от данных, представленных в IARC TP53 mutation database.
Было показано наличие при диффузной В-ККЛ патогенетически значимых интронных и сеймсенс-замен, что свидетельствует о важности как анализа прилегающих к экзонам некодирующих участков гена, так и биоинформационного анализа выявленных синонимичных замен.
Комплексный анализ статуса ТР53 дает большее представление о возможных механизмах участия изменчивости данного гена в патогенезе диффузной В-ККЛ. Показано, что недостаточность функции ТР53 при диффузной В-ККЛ может формироваться по двух-ударному принципу.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (проект № НШ-10240.2016.7). Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
9. Kopnin B.P., Kopnin P.B., Khromova N.V., Agapova L.S. Multifaced p53: variety of forms, functions, tumor-supressive and oncogenic activities. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2008; 1(1): 2-9. 27. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и
применение. Пер. с англ. М.: Мир; 2002. Остальные источники литературы см. е References
REFERENCES
1. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stain H., et al. WHO Classification of Tumors of Haematopoetic and Lymphoid Tissues. Lyon; 2008.
2. Niroula R., Butera J. Genetics and diffuse large B-cell lymphoma. R. I. Med. J. 2015; 98(11): 23-6.
3. Skibola C.F., Curry J.D., Nieters A. Genetic susceptibility to lymphoma. Haematologica. 2007; 92(7): 960-9.
4. Xu-Monette Z.Y., Medeiros L.J., Li Y., Orlowski R.Z.,Andreeff M., Bueso-Ramos C.E., et al. Dysfunction of the TP53 tumor suppressor gene in lymphoid malignancies. Blood. 2012; 119(16): 3668-83. doi: 10.1182/ blood-2011-11-366062.
5. Hollstein M., Hainaut P. Massively regulated genes: the example of TP53. J. Pathol. 2010; 220(2): 164-17. doi: 10.1002/path.2637.
6. Cheung K.J., Horsman D.E., Gascoyne R.D. The significance of TP53 in lymphoid malignancies: mutation prevalence, regulation, prognostic impact and potential as a therapeutic target. Br. J. Haematol. 2009; 146(3): 257-69. doi: 10.1111/j.1365-2141.2009.07739.x.
7. Gudkov A.V., Komarova E.A. The role of p53 in determining sensitivity to radiotherapy. Nat. Rev. Cancer. 2003; 3(2): 117-29.
8. Peller S., Rotter V. TP53 in hematological cancer: low incidence of mutations with significant clinical relevance. Hum. Mutat. 2003; 21(3): 277-84.
9. Kopnin B.P., Kopnin P.B., Khromova N.V., Agapova L.S. Multifaced p53: variety of forms, functions, tumor-supressive and oncogenic activities. Clinical Oncohematology. Basic Research and Clinical Practice. Russian Journal (Klinicheskaya onkogematologiya). 2008; 1(1): 2-9. (in Engl.)
10. Kitts A., Phan L., Ward M., Holmes J.B. The Database of Short Genetic Variation (dbSNP). The NCBI Handbook. 2nd ed. Bethesda: National Center for Biotechnology Information (US); 2013. (Last Update: April 3, 2014). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK174586/11. http://www. ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=TP53
12. Whibley C., Pharoah P.D., Hollstein M. P53 polymorphisms: cancer implications. Nature Rev. Cancer. 2009; 9(2): 95-107.
13. Voropaeva E.N., Voevoda M.I., Pospelova T.I., Maksimov V.N. Linkage disequilibrium and haplotypes of rs1042522, rs1625895 and rs17878362 gene TP53 markers in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Mol. Biol. (Mosk). 2014; 48(5): 663-70.
14. Voropaeva E.N., Voevoda M.I., Pospelova T.I., Maksimov V.N. Prognostic
impact of the TP53 rs1625895 polymorphism in DLBCL patients. Br. J. Haematol. 2015; 169(1): 32-5.
15. Lu J.T., Cen L., Zhou M. Prognostic value of P53 aberrations in diffuse large B-cell lymphoma. Zhongguo Shi YanXue YeXue Za Zhi. 2012; 20(1): 100-2.
16. Sun G.X., Cao X.S., Li Q., Wang Z.L. Correlation of BCL-6, MYC and p53 gene abnormalities with immunological subtypes andprognosis of diffuse large B-cell lymphoma. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2012; 29(5): 576-81.
17. Gao P., Li Q., Wang Z., Yan F., Lu C., Cao X. Significance of BCL-6, MYC, P53 genes abnormalities for the prognosis of diffuse large B-cell lymphoma. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2014; 31(5): 628-31. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2014.01.020.
18. Stefancikova L., Moulis M., Fabian P., Vasova I., Zedek F., Ravcukova B., et al. Prognostic impact of p53 aberrations for R-CHOP-treated patients with diffuse large B-cell lymphoma. Int. J. Oncol. 2011; 39(6): 1413-20.
19. Stocklein H., Smardova J., Macak J., Katzenberger T., Holler S., Wessendorf S., et al. Detailed mapping of chromosome 17p deletions reveals HIC1 as a novel tumor suppressor gene candidate telomeric to TP53 in difuse large B-cell lymphoma. Oncogene. 2008; 27(18): 2613-25.
20. Tamimi Y., Al-Harthy S., Al-Haddabi I., Al-Kindi M., Babiker H., Al-Moundhri M., Burney I. The p53 mutation/deletion profle in a small cohort of the Omani population with diffuse large B-cell lymphoma. Sultan Qaboos Univ. Med. J. 2014; 14(1): e50-8.
21. Simonitsch-Klupp I., Hauser I., Ott G., Drach J., Ackermann J., Kaufmann J., et al. Diffuse large B-cell lymphomas with plasmablastic/ plasmacytoid features are associated with TP53 deletions and poor clinical outcome. Leukemia. 2004; 18(1): 146-55.
22. Xu-Monette Z.Y., Wu L., Visco C., Tai Y.C., Tzankov A., Liu W.M., et al. Mutational profile and prognostic significance of TP53 in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with R-CHOP: report from an International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program Study. Blood. 2012; 120(19): 3986-96.
23. Young K.H., Leroy K., M0ller M.B., Colleoni G.W., Sánchez-Beato M., Kerbauy F.R., Haioun C., et al. Structural profiles of TP53 gene mutations predict clinical outcome in diffuse large B-cell lymphoma: an international collaborative study. Blood. 2008; 112(8): 3088-98.
24. Edlund K., Larsson O., Ameur A., Bunikis I., Gyllensten U., Leroy B., et al. Data-driven unbiased curation of the TP53 tumor suppressor gene mutation database and validation by ultradeep sequencing of human tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109(24): 9551-6.
25. http://p53.iarc.fr/DownloadDataset. aspx
26. Frebourg T., Barbier N., Kassel J., Ng Y.S., Romero P., Friend S.H. A functional screen for germ line p53 mutations based on transcriptional activation. Сancer Res. 1992; 52(24): 6976-8.
27. Tennis M., Krishnan S., Bonner M., Ambrosone C.B., Vena J.E., Moysich K., et al. p53 mutation analysis in breast tumors by a DNA microarray method. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2006; 15(1): 80-5.
28. Glick B.R., Pasternak J.J., eds. Moleculer biotechnology. Principles and applications of Recombinant DNA. 2nd ed. Washington: ASM Press; 1994.
29. Lehman T.A., Haffty B.G., Carbone C.J., Bishop L.R., Gumbs A.A., Krishnan S. et al. Elevated frequency and functional activity of a specific germ-line p53 intron mutation in familial breast cancer. Cancer Res. 2000; 60(4): 1062-9.
30. Agirre X., Novo F.J., Calasanz M.J., Larrayoz M.J., Lahortiga I., Valganon M., et al. TP53 is frequently altered by methylation, mutation, and/or deletion in acute lymphoblastic leukaemia. Mol. Carcinog. 2003; 38(4): 201-8.
31. Pogribny I.P., James S.J. Reduction of p53 gene expression in human primary hepatocellular carcinoma is associated with promoter region methylation without coding region mutation. Cancer Lett. 2002; 176(2): 169-74.
32. Kang J.H., Kim S.J., Noh D.Y., Park I.A., Choe K.J., Yoo O.J., Kang H.S. Methylation in the p53 promoter is a supplementary route to breast carcinogenesis: correlation between CpG methylation in the p53 promoter and the mutation of the p53 gene in the progression from ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma. Lab. Invest. 2001; 81(4): 573-9.
33. Garcia-Delgado M., Larrayoz M.J., Novo F.J. Methylation of CpG dinu-cleotides and/or CCWGG motifs at the promoter of TP53 correlates with decreased gene expression in a subset of acute lymphoblastic leukemia patients. Oncogene. 2003; 22(7): 1070-2.
34. Amara K., Trimeche M., Ziadi S., Laatiri A., Hachana M., Sriha B., et al. Presence of simian virus 40 DNA sequences in diffuse large B-cell lymphomas in Tunisia correlates with aberrant promoter hypermethylation of multiple tumor suppressor genes. Int. J. Cancer. 2007; 121(12): 2693-702.
35. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. N. Engl. J. Med. 1993; 329(14): 987-94.
36. http://p53.iarc.fr/download/tp53_directsequencing_iarc.pdf
37. Petitjean A., Mathe E., Kato S., Ishioka C., Tavtigian S. V., Hainaut P., et al. Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database. Hum. Mutat. 2007; 28(6): 622-9.
38. Adzhubei I., Jordan D.M., Sunyaev S.R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. 2013; Ch.7: Unit 7.20. doi: 10.1002/0471142905.hg0720s76.
39. Almeida L.O., Custódio A.C., Pinto G.R., Santos M.J., Almeida J.R., Clara C.A. et al. Polymorphisms and DNA methylation of gene TP53 associated with extra-axial brain tumors. Genet. Mol. Res. 2009; 8(1): 8-18.
40. Grebe S.K., McIver B., Hay I.D., Wu P.S., Maciel L.M., Drabkin H.A., et al.
Frequent loss of heterozygosity on chromosomes 3p and 17p without VHL or p53 mutations suggests involvement of unidentified tumor suppressor genes in follicular thyroid carcinoma. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997; 82(11): 3684-91.
41. Shiraishi K., Kato S., Han S.Y., Liu W., Otsuka K., Sakayori M., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. J. Biol. Chem. 2004; 279(1): 348-55.
42. Monti P., Campomenosi P., Ciribilli Y., Iannone R., Inga A., Abbondan-dolo A., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild type p53. Oncogene. 2002; 21(11): 1641-8.
43. Campomenosi P., Monti P., Aprile A., Abbondandolo A., Frebourg T., Gold B., et al. P53 mutants can often transactivate promoters containin gap21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 2001; 20(27): 3573-9.
44. Kakudo Y., Shibata H., Otsuka K., Kato S., Ishioka C. Lack of correlation between p53-dependent transcriptional activity and the ability to induce apoptosis among 179 mutant p53s. Cancer Res. 2005; 65(6): 2108-14.
45. Monti P., Campomenosi P., Ciribilli Y., Iannone R., Aprile A., Inga A., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 2003; 22(34): 5252-60.
46. Dearth L.R., Qian H., Wang T., Baroni T.E., Zeng J., Chen S.W., et al. Inactive full-leng the p53 mutants lacking dominant wild-type p53 inhibition highlight loss of heterozygosity as an important aspect of p53 status in human cancers. Carcinogenesis. 2007; 28(2): 289-98.
47. Leroy B., Fournier J.L., Ishioka C., Monti P., Inga A., Fronza G., Soussi T. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation
Original article
database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (Database issue): D962-9. doi: 10.1093/nar/gks1033.
48. Lehman T.A., Haffty B.G., Carbone C.J., Bishop L.R., Gumbs A.A., Krishnan S., et al. Elevated frequency and functional activity of a specific germ-line p53 intron mutation in familial breast cancer. Cancer Res. 2000; 60(4): 1062-9.
49. Bourdon J.C., Fernandes K., Murray-Zmijewski F., Liu G., Diot A., Xirodimas D.P., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 2005; 19(18): 2122-37.
50. Dekairelle A.F., Tombal B., Cosyns J.P., Gala J.L. Assessment of the transcriptional activity of p53 improves the prediction of recurrence in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. Clin Cancer Res. 2005; 11(13): 4724-32.
51. Young K.H., Weisenburger D.D., Dave B.J., Smith L., Sanger W., Iqbal J., et al. Mutations in the DNA-binding codons of TP53, which are associated with decreased expression of TRAIL receptor-2, predict for poor survival in diffuse large B-cell lymphoma Blood. 2007; 110(13): 4396-405.
52. Stefancikova L., Moulis M., Fabian P., Vasova I., Zedek F., Ravcukova B., et al. Prognostic impact of p53 aberrations for R-CHOP-treated patients with diffuse large B-cell lymphoma. Int. J. Oncol. 2011; 39(6): 1413-20.
53. Zenz T., Eichhorst B., Busch R., Denzel T., Habe S., Winkler D., et al. TP53 mutation and survival in chronic lymphocytic leukemia. J. Clin. Oncol. 2010; 28(29): 4473-9.
Поступила 22.04.16 Принята к печати 17.07.16
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.419-036.11-092:575.174.015.3
Горбенко А.С.1, Столяр М.А.1,3, Субботина Т.Н.1,3, Васильев Е.В.4, Ольховский И.А.1,2
РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ARG399GLN ГЕНА ХЙСС1 В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКИХ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
красноярский филиал ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 660036, г. Красноярск, Россия; 2ФГБУН Красноярский научный Центр Сибирского отделения РАН, 660036, г. Красноярск, Россия; 3ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет, 660041, г. Красноярск, Россия; 4КГБУЗ Краевая клиническая больница, 660022, г. Красноярск, Россия
Для оценки ассоциации полиморфизма Дгд399в!п гена ХЙСС1 с хроническими миелопролифератив-ными заболеваниями были обследованы 466 человек, в том числе: 79 больных хроническим миелолей-козом (ХМЛ), 91 - истинной полицитемией (ИП), 132 - эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ), 50 - миело-фиброзом (Мф). Группу контроля составили 114 здоровых добровольцев. Показано, что распространенность минорного аллеля в!п в группе больных ХМЛ значимо выше (ОК 1,53; 95% С1 0,67-3,51), особенно в группе больных с резистентностью к иматинибу (1,83; 95% С1 0,83-4,05), чем в группе контроля. Впервые выявлена взаимосвязь минорного полиморфизма исследуемого гена с ЭТ (ОК 1,31; 95% С1 0,61-2,78), но не с ИП или МФ. Ассоциации полиморфных вариантов гена ХЙСС1 с уровнем аллельной нагрузки .1ДК2 не обнаружено. Полученные результаты свидетельствуют о более важном значении продукта данного гена в контроле стабильности генома дифференцировки миелоидных клеток-предшественниц при ХМЛ и ЭТ. Исследование полиморфизма Дгд399в!п в гене ХЙСС1 может быть полезно в комплексной оценке прогноза развития и эффективности лечения этих заболеваний.
Ключевые слова: ХКСС1 Дгд399в!п; хроническая миелоидная лейкемия; истинная полицитемия; эссенциальная тромбоцитемия.
Для цитирования: Горбенко А.С., Столяр М.А., Субботина Т.Н., Васильев Е.В., Ольховский И.А. Роль полиморфизма Arg399Gln гена ХЯСС1 в патогенезе хронических миелопролиферативных заболеваний. Гематология и трансфузиология. 2016; 61(3): 143-145. DOI: 10.18821/0234-5730-2016-61-3-143-145
Gorbenko AS. ', StolyarM.A.'3, Subbotina T.N.'3, Vasiliev E.V.4, Olkhovskiy I.A.12
SIGNIFICANCE OF THE XRCC1 GENE ARG399GLN POLYMORPHISM IN THE PATHOGENESIS OF THE CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISEASES
'Hematological Scientific Centre (Krasnoyarsk branch), Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation;
2Krasnoyarsk Scientific Centre of the SB of RAS, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation;
3Siberian Federal University, Krasnoyarsk, 66004', Russian Federation;
4Krasnoyarsk Regional Hospital, Krasnoyarsk, 660022, Russian Federation;
We investigated the association between Arg399Gln polymorphism in DNA repair gene XRCC1 and chronic myeloproliferative diseases. 79 patients with chronic myeloid leukemia (CML), 91 patient with polycythemia vera (PV), 132 patients with essential thrombocythemia (ET). 50 patients with myelofibrosis and 114 controls were included in the study. We genotyped the polymorphism in XRCC' gene by using polymerase chain reaction in real-time with TaqMan assay. The detection and quantification of the JAK2 gene V617F mutation allele burden was carried out by means of "Pyromark q24" pyrosequencing. The presence of at least one XRCC' 399Gln allele was found to be significantly different in patients with CML (OR 1.53; 95% CI 0.67-3.51) and ET (OR 1.31; 95% CI 0.61-2.78) in comparison with controls. The presence of XRCC' 399Gln allele was associated with the resistance to imatinib. We found no interactions between the XRCC' genotype and the level JAK2
