CC BY
22
APPLICATION OF BIOPOLYMERS FOR CRYOPRESERVATION OF RAT TESTICULAR TISSUE
Volkova N. O., Yukhta M. S., Chernyshenko L. G., Stepanyuk L. V., Sokil L. V., Goltsev A. M.
Abstract. Today, transplantation of cryopreserved fragments of immature testicles is a non-alternative way for fertility preserving in pre-adolescent patients, which has been planed cytotoxic therapy. However, loss of spermatogonal stem cells occurs during cryopreservation. Therefore, the effectiveness of the cryopreservation procedure is critical and should be improved. A promising approach is to use biopolymer gels, since the presence of an extracellular matrix may affect the structure of ice crystals during cryopreservation.
The aim of the work was to determine the effect of collagen (CG) and fibrin (FG) gels on the morphological and functional characteristics of the fragments of the seminiferous tubules of the testes of immature rats in a programmed freezing condition.
Object and methods. The following experimental cryoprotective media were used: 1. collagen gel (CG) with 5% DMSO; 2. fibrin gel (FG) with 5% DMSO. Controls: 1. Hanks' solution with 5% bovine serum albumin (BSA) and 5% DMSO; 2. Hanks' solution without cryoprotectant; 3. intact tissue. CG was prepared from collagen type I, which was obtained from rat tendons. FG was obtained from an average fraction of fresh blood of animals after centrifugation (12 min, 1500 g).
Samples of seminiferous tubules were obtained mechanically from both testes of immature rats (n = 50, weighing 50 ± 15 g, aged 7-8 weeks), incubated in media for 30 min (4°C) and cryopreserved according to the program: ramp to 0°C at a rate of 1°C/min; hold for 5 min at 0°С; ramp to -8°С at a rate of 1°C/min; hold for 1 min at -8°C; ramp to -40°C at a rate of 1°C/min and up to -70°C at a rate of 10°C/min; transferred to liquid nitrogen. After heating the histological structure and the metabolic activity (MTT test and LDH activity) of spermatogenic epithelium cells was evaluated.
Results. Histologically, testicular tissue of intact rats had a normal structural organization. Cryopreservation without cryoprotectants (negative control) caused gross damages of structure of seminiferous tubules: a sharp retraction of cells with the formation of large cracks inside the spermatogenic epithelium, its complete desquamation, lysis and picnosis of almost 90% of nuclei. The spermatogenic epithelium after cryopreservation under protection of BSA + 5% DMSO had moderately pronounced changes: the degree of retraction and desquamation, the number and size of the cavities decreased. The use of FG with 5% DMSO (as opposed to CG) led to a decrease in the severity of desquamation and retraction of spermatogenic cells, as well as in the number of cells with pyknotic nuclei, compared to the use of BSA instead biopolymer gel.
According to the MTT-test, cryopreservation under the protection of FG with 5% DMSO was in 3.9 times more effective compaid to the negative control, exceeding by 27% the result of application of BSA as the basis of the cryoprotective medium. A similar trend was observed during LDH activity determination: in the group of FG + 5% DMSO application LDG activity was increased in 1.6 times in relation to negative control. The use of CG was less effective by both parameters.
In general, the obtained data indicate that the use of FG as a basis of cryoprotective medium increases the resistance of the cells of the seminiferous tubules of immature rats to the action of factors of cryopreservation.
Conclusion. Cryopreservation of fragments of the seminiferous tubules under the protection of a cryoprotective medium based on FG allows preserving their histostructure and metabolic activity and is more effective than the use of BSA or CG.
Key words: testicular tissue, immature rats, dimethyl sulfoxide, cryopreservation, bovine serum albumin, collagen gel, fibrin gel.
Рецензент - проф. брошенко Г. А.
Стаття наджшла 13.03.2019 року
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-70-75 УДК 612.172: 611.127-018
1Загоруйко Ю. В., Загоруйко Г. Е., Марциновский В. П., 2Филатова В. Л.
ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАРДИОМИОГЕНЕЗА У КРЫС WISTAR: РОСТ СУММАРНОЙ ЧИСЛЕННОСТИ КАРДИОМИОЦИТОВ И ОБРАЗОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ ДВУЯДЕРНЫХ МИОЦИТОВ В ПАРЕНХИМЕ МИОКАРДА КОМПЛЕКСА (ЛЖ + МЖП) Ровненский государственный гуманитарный университет (г. Ровны) Харьковский национальный медицинский университет (г. Харьков) 2Украинская медицинская стоматологическая академия (г. Полтава)
prof.zagoruykoGE@gmail.com
Связь публикации с плановыми научно-исследовательскими работами. Исследование проведено в соответствии с тематикой НИР «Морфофункцюналь-ний стан оргашв i тканин експериментальних тварин та людини в онтогенезi в нормi та шд впливом зовшш-шх i внутршшх чиннишв», № государственной регистрации 0117и003181.
Вступление. Проблемы миогенеза скелетной мышечной ткани [1] и кардиомиогенеза [2-6] привлекают пристальное внимание ученых на протяжении многих
десятилетий. Одной из проблем кардиомиогенеза является исследование закономерностей пролифе-ративных процессов, развивающихся в миокарде в период эмбрионального и постнатального онтогенеза позвоночных животных и человека [2-6]. Пролиферация кардиомиоцитов (КМЦ) способствует росту массы и объема миокарда, формированию четырехкамер-ного сердца, которое начинает активно сокращаться с 15 суток пренатального развития крысят Wistar. По данным [6,7] в миокарде 19-ти суточных эмбрионов
белых крыс выявляются ацитокинетические митозы, в результате которых образуются двуядерные кардио-миоциты (2-я КМЦ). Для исследования процессов пролиферации и полиплоидии КМЦ используют методы определения индекса меченных ядер (ИМЯ) и мито-тического индекса (МИ) [2-5]. С этой целью проводят авторадиографию ядер КМЦ в препаратах (срезах) миокарда. В серии гистологических и электронно-микроскопических изображений сердечной мышцы определяют численность зерен серебра, локализованных внутри контуров площадей срезов ядер КМЦ. Однако, численность зерен серебра зависит от таких показателей, как: зернистость эмульсии; толщина срезов гистологических препаратов; продолжительность экспонирования (15 - 40) суток; удельной активности 3Н - тимидиновой эмульсии; числа инъекций радиоактивной метки; интервалов между инъекциями; температуры экспонирования препаратов, покрытых эмульсией [8]. Многие авторы [2-6] отмечают, что показатели ИМЯ и МИ непосредственно характеризуют процессы синтеза ДНК и подготовку ядер к митозу, но не цитокинез клеток. Поэтому для определения численности КМЦ в стенке камер сердца применяют методы щелочной диссоциации кусочков миокарда на отдельные миоциты. Способ получения изолированных КМЦ методом щелочной диссоциации фиксированных формалином кусочков миокарда был разработан R. Schneider и P. Pfitzer [9]. Различные методы получения суспензии изолированных клеток нашли широкое применение для определения численности, массы и размеров КМЦ в сердце животных и человека [2-6,9]. В работах по проблеме кардиомиогенеза [10,11,12] в качестве объекта электронно-микроскопического и морфометрического исследования нами использован мышечный комплекс «левый желудочек + межжелудочковая перегородка» (ЛЖ + МЖП). Это обусловлено тем, что сократительная функция миокарда в комплексе (ЛЖ + МЖП) обеспечивает непрерывное кровоснабжение и, следовательно, работоспособность органов опорно-двигательного аппарата, на долю которых в организме позвоночных животных и человека приходится до 80 % массы тела [13]. В настоящей работе ранее полученные данные [12] мы дополнили результатами определения суммарной численности (1-я + 2-я) КМЦ, численности 2-я КМЦ в паренхиме миокарда, исследовали кинетику скорости суточного роста численности КМЦ. Эти мор-фометрические показатели позволили определить некоторые закономерности эмбрионального и постнатального карди-омиогенеза в миокарде комплекса (ЛЖ + МЖП) у крыс Wistar.
Цель работы. На основе результатов морфометрического анализа серии негативов миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) эмбрионов и крыс разного хронологического возраста определить закономерности кинетики: роста суммарной численности (1-я + 2-я) КМЦ; роста численности двуядерных КМЦ, скорость процессов пролиферации и полиплоидии КМЦ, развивающихся в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) в процессе прена-тального и постнатального онтогенеза крыс Wistar.
Объект и методы исследования. При проведении исследований руководствовались принципами биоэтики, изложенными в Законе Украины «Про за-хист тварин вщ жорстокого поводження» (№ 1759 вщ 15.12.2009 р.).
Общее количество экспериментальных животных составило 100 крыс разного возраста (на каждый возраст от 3 до 5 животных). В работе [14] было установлено наличие суточной периодичности интенсивности кариокинеза и клеточных делений в разных органах подопытных животных. Эта периодичность обусловлена ночным образом жизни лабораторных животных и крыс Wistar. Чтобы избежать влияние суточной динамики митоза ядер и пролиферации КМЦ все работы по забою животных и экстирпации сердца проведены в утреннее время, в интервале 8 -10 часов. Были использованы: 15-16 и 20-21 суточные эмбрионы крыс; новорожденные; 1 - 45-ти суточные крысы - самцы линии Wistar. Препараты миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) крыс разного возраста исследовали методами световой, электронной микроскопии, морфометрии. Информация об объекте и методах морфометрии препаратов (ЛЖ + МЖП) подробно изложена в наших работах [10,11,12]. В данной работе определяли: 1. Кинетику роста суммарной численности (1-я + 2-я) КМЦ - £кмц = /1 в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП). 2. Скорость суточного роста суммарной численности КМЦ - Ь.£кми/сут. 3. Полученные данные использовали для вычисления значений показателей Ь.£кми/час и Ь.£кми/мин. 4. Относительную численность пролиферирующихся КМЦ ^п кмц, в %) в паренхиме миокарда определяли по формуле - Nп кмц = (Д£кмц /£кмц) х 100 %. 5. Кинетику роста численности 2-я КМЦ - N 2-я кмц = №). 6. Скорость суточного роста численности 2-я КМЦ -ДN 2-я кми/сут. 7. Полученные данные использовали для вычисления значений показателей ДN 2-я кми/ час и ДN 2-я кми/мин.
Результаты исследований и их обсуждение. На рис. 1 представлен график 1 кинетики роста суммарной численности КМЦ кмц) в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП).
В процессе пре- и постнатального кардиомиогенеза (15 суток до и 15 суток после) рождения суммарная численность КМЦ в паренхиме (ЛЖ + МЖП) увеличивается в 4,34 раза (от 0,35 до 1,52) х 107 кмц. В период эмбрионального кардиомиогенеза (15 - 21) сутки значения £кми возрастают в 2 раза (от 0,35 до 0,74) х 107
- -•7/ —«
-
- 1
- 1 \ д 2
- \ ' ч 2
-
- \л
—1 Г-Г- I -ГП I г-1- -т— г-г- ly/
сутки
Рис. 1. Кинетика роста суммарной численности (1-я + 2-я) КМЦ (график 1)
и численности N 2-я КМЦ (график 2) в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) у крыс Wistar в процессе пренатального - 1 и постнатального - 2 кардиомиогенеза. По оси абсцисс - сутки развития, по оси ординат -численность КМЦ.
Рис. 2. Кинетика скорости суточного роста суммарной численности КМЦ (Д£кмц/сутки) в паренхиме миокарда (ЛЖ + МЖП) в процессе кардиомиогенеза.
Остальные обозначения те же, что на рис. 1.
кмц. В процессе постнатального кардиомиогенеза, в интервале времени (новорожденные - 15-ти суточные крысята), значения X кмц также увеличивается в 2 раза (от 0,77 до 1,52) х 107 кмц. В период эмбрионального кардиомиогенеза участок графика 1 вогнут вниз (ф). Это свидетельствует о монотонном увеличении скорости суточного роста суммарной численности КМЦ. После рождения крысят участок графика 1 выпуклый вверх (^). Это свидетельствует о том, что в период постнатального кардиомиогенеза, после прохождения «точки перегиба» на графике с координатами (0 суток и 0,8 х 107 кмц), происходит уменьшение скорости суточного роста суммарной численности КМЦ в паренхиме миокарда (ЛЖ + МЖП). При t > 10 суток наблюдается приближение значений Xкмц к асимптоте с ординатой равной 1,52 х 107 кмц. В интервале времени (15 - 45) суток суммарная численность КМЦ не изменяется - X кмц ~ const ~ (1,51 ± 0,02) х 107 кмц. Представленные данные подтверждают положение о том, что в период постнатального кардиомиогенеза происходит затухание процессов пролиферации КМЦ в миокарде позвоночных животных и человека [2-5]. В этих публикациях было установлено, что в процессе возрастного развития белых крыс (t > 45 суток), численность постмитотических КМЦ в паренхиме миокарда не увеличивается. При умеренных продолжительных физических нагрузках, в условиях экспериментальной патологии разного генеза, в миокарде лабораторных животных возможно развитие таких процессов, как: гипертрофия ^ атрофия КМЦ; увеличение плоидности ядер миоцитов; гибель некоторого количества миоцитов, но численность КМЦ не возрастает [2-5,7,12].
На рис. 2 представлен график изменения скорости суточного роста суммарной численности КМЦ в паренхиме миокарда (ЛЖ + МЖП).
На этом графике определяются четыре последовательных участка монотонного изменения значений показателя АХкмц/ сутки. Первый участок графика ограничен временными координатами (16 суток до рождения, 0 - новорожденные крысята). В период эмбрионального кардиомиогенеза происходит интенсивный рост значений АХкмц/сут от 0,033 х 107 кмц/ сут (1,38 х 103 кмц/час и 229 кмц/мин) до максимального 0,09 х 107 кмц/сут (3,75 х 104 кмц/час и 625 кмц/мин). Эти данные свидетельствует об активизации процессов пролиферации эмбриональных КМЦ. Второй участок графика ограничен временными координатами (0 и 3) суток
после рождения. В этот период постнатального кардиомиогенеза наблюдается уменьшение значений показателя АХкмц/ сутки (от 0,09 до 0,065) х 107 кмц/сут (2,71 х 104 кмц/час и 451 кмц/мин). Следовательно, в первом периоде постнатального кардиомиогенеза происходит уменьшение пролиферативной активности КМЦ. Третий участок графика ограничен временными координатами (3 и 7) суток после рождения. Этот второй период постнатального кардиомиогенеза характеризуется постоянством цифровых значений - АХ кмц/сут ~ const ~ 0,06 ± 0,005 х 107 кмц/сут (2,5 х 104 кмц/час и 417 кмц/мин). Стабильность значений показателя АХ кмц/сут обусловлено морфофункциональными взаимодействиями между тремя популяциями КМЦ (1-я т-КМЦ ^ 1-я с-КМЦ^2-я КМЦ) [12]. Четвертый участок графика ограничен временными координатами (7 и 15) суток после рождения крысят. Он характеризует третий период постнатального кардиомиогенеза. В это время происходит убыль значений показателя АХ кмц/сут (от 0,06 до 0,015) х 107 кмц/сут (6,25 х 103 кмц/час и 104 кмц/мин). Следовательно, одним из морфологических признаков завершения постнатального кардиомиогенеза является затухание пролиферативных процессов в паренхиме миокарда (ЛЖ + МЖП).
На рис. 3 представлен график относительного количества (в %) пролиферирующихся КМЦ в миокарде (ЛЖ + МЖП).
В период эмбрионального кардиомиогенеза наблюдается «рост ^ убыль» цифровых значений показателя Nп кмц (%). В интервале времени (15 - 18) суток развития эмбрионов, значения Nп кмц возрастают от 8,6 % до максимального, равного 16,7 %. Ко времени завершения эмбриогенеза, количество пролиферирующихся КМЦ в паренхиме миокарда убывает до = 10 %. В процессе постнатального кардиомиогенеза наблюдается снижение пролиферативной активности КМЦ. В паренхиме миокарда 15-ти суточных крысят значения Nп кмц ~1 %. Наибольшая пролиферативная активность КМЦ определяется в эмбриональный период развития крысят.
Единичные 2-я КМЦ нами были выявлены в миокарде 18-19-ти суточных эмбрионов. КМЦ имели такие характерные морфологические признаки. 1. Наличие в саркоплазме «изогенных ядерных дуплетов» (по терминологии П.П. Румянцева [2]). 2. Сестринские ядра отделены друг от друга узкой щелью, в которой
Рис. 3. Изменение относительного количества пролиферирующихся КМЦ (1Чп кмц, %) в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) крыс разного возраста. Остальные обозначения те же, что на рис. 1.
выявляются элементы эргастоплазмы. 3. Отсутствие морфологических признаков «разборки ^ сборки» миофибрилл, расположенных вблизи ядер. 4. Отсутствие морфологических признаков цитокинеза - борозды деления в области расположения сестринских ядер. На рис. 1 представлен график 2 кинетики роста численности популяции 2-я КМЦ в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП). В процессе кардиомиогенеза (18 суток до и 15 суток после) рождения, численность N 2-я КМЦ в паренхиме (ЛЖ+МЖП) увеличивается в 1000 раз! (от 0,00144 до 1,44) х 107 кмц. График имеет форму вытянутой буквы «S». В период эмбрионального и раннего постнатального кардиомиогенеза, в интервале времени (18 суток до и 5 суток после) рождения, участок графика 2 вогнут вниз (ф). Это свидетельствует об интенсивном увеличении скорости суточного роста численности 2-я КМЦ. При te (5 - 15) суток, участок графика 2 выпуклый вверх (^). После прохождения «точки перегиба» на графике с координатами (5 суток, 0,6 х 107 кмц), происходит уменьшение скорости суточного роста численности 2-я КМЦ в паренхиме миокарда (ЛЖ + МЖП). При t ^ 15 суткам, цифровые значения показателя N 2-я кмц ^ 1,44 х 107 кмц. В интервале времени te (15 - 45) суток наблюдается стабилизация цифровых значений показателя N 2-я кмц ~ const ~ 1,44 х 107 кмц. Следовательно, после завершения постнатального кардиомиогенеза, численность 2-я КМЦ в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) не увеличивается и составляет = 94 - 95 % от суммарной численности миоцитов.
На рис. 4 представлен график скорости суточного роста численности популяции 2-я КМЦ (AN 2-я кмц/ сут) в (ЛЖ + МЖП).
График расположен асимметрично относительно вертикальной штриховой линии (время рождения крысят) и смещен вправо вдоль оси абсцисс - сутки постнатального развития. В процессе эмбриогенеза (18 - 21) сутки, значения показателя AN 2-я кмц/ сут медленно увеличиваются (от 0,00144 до 0,009) х 107 кмц/сут (от 600 кмц/час и 10 кмц/мин до 2300 кмц/час и 38 кмц/мин). В течении 5 суток после рождения, цифровые значения показателя AN 2-я кмц/ сут интенсивно возрастают до максимума равного 0,175 х 107 кмц/сут или (73 х 103 кмц/час и 1215 кмц/мин). При te (5 - 15) суток цифровые значения показателя AN 2-я кмц/сут интенсивно убывают до минимума 0,002 х 107 кмц/сут или (8,3 х 103 кмц/ час и 175 кмц/мин). Экстраполяция экспериментальных данных позволяет с большой вероятностью предположить, что при t >15 суток, AN 2-я кмц/ сут > 0. Следовательно, в течение постнатальной жизни позвоночных животных и человека, в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) происходит процесс медленного обновления популяции 2-я КМЦ. Если принять максимальную численность 2я КМЦ равную 1,44 х 107 кмц за 100 %, то в период эмбрионального кардиомиогенеза значения показателя N 2-я кмц медленно возрастают от 0 до 1,35 %. В эмбриональный период источником образования 2-я КМЦ в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП), вероятно, является субпопуляция тетраплоидных 1-я с-КМЦ (4с х 1). Эти 1-я с-КМЦ находятся в периоде
Рис. 4. График скорости суточного роста численности популяции 2-я КМЦ (aN 2-я кмц/сут) в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП). Остальные обозначения те же, что на рис. 1.
клеточного цикла с отстроченным кариокинезом. Такие 1-я с-КМЦ имеют увеличенные размеры, содержат большое ядро (V = 180 - 200) мкм3 и вместе с множеством 1-я с-КМЦ (2с х 1) участвуют в сократительной функции миокарда эмбрионального сердца.
К окончанию постнатального периода кардиомиогенеза завершается и полиплоидизаиия КМЦ в паренхиме миокарда. 2-я КМЦ составляют = (94 - 96) % суммарной численности КМЦ в миокарде половозрелых крыс. Эти КМЦ находятся в состоянии терминальной дифференииаиии и выведены из клеточного цикла. Остальные 4-6 % - это, вероятно, 1-я с-КМЦ (4с х 1), которые, при определенных условиях, способны трансформироваться в 2-я КМЦ и замещать стареющие и погибающие апоптозом КМЦ в процессе постнатальной жизни млекопитающих. Исходя из данных современных публикаций [15,16], предшественниками 1-я с-КМЦ (4с х 1) являются стволовые клетки, расположенные в эндотелии коронарных артерий, которые, пройдя ряд трансформаций, мигрируют в паренхиму миокарда и дают начало КМЦ. В условиях нормы процесс регенерации паренхимы миокарда у человека происходит с очень низкой скоростью (1 - 4) % в год. Выводы
1. В процессе эмбрионального и постнатального кардиомиогенеза в комплексе (ЛЖ + МЖП) происходит непрерывный рост суммарной численности (1-я + 2-я) КМЦ с максимальной скоростью в миокарде новорожденных крысят.
2. Образование и увеличение численности популяции 2-я КМЦ в паренхиме миокарда происходит в интервале времени (18-19 суток до и 15 суток после) рождения крысят.
3. После завершения постнатального периода кардиомиогенеза в интервале времени (15 - 45) суток, суммарная численность КМЦ и численность 2-я КМЦ не возрастают.
4. Относительное содержание пролиферирующих-ся КМЦ в комплексе (ЛЖ + МЖП) максимально в миокарде 18-ти суточных эмбрионов крыс.
5. Наиболее активно процесс полиплоидии КМЦ в паренхиме миокарда комплекса (ЛЖ + МЖП) развивается в начале постнатального кардиомиогенеза с максимальной скоростью на 5-е сутки после рождения крысят.
Перспективы дальнейших исследований. Будет представлена морфометрическая информация о закономерностях морфогенеза и взаимодействия популяций КМЦ, образующих и формирующих паренхиму миокарда мышечного комплекса (ЛЖ+МЖП) в процессе кардиомиогенеза.
Литература
1. Problemy miogeneza. L.: Nauka; 1981. 268 s. [in Russian].
2. Rumyancev PP. Kardiomiocity v processah reprodukcii, differencirovki i regeneracii. L.: Nauka; 1982. 288 s. [in Russian].
3. Tverdohleb IV. Geterogennost miokarda i ee razvitie v normalnom kardiomiogeneze. Dnepropetrovsk: POROGI; 1996. 224 s. [in Russian].
4. Shponka IS. Gistogeneticheskie protsessy v razvivaijemsia miokarde mlekopitaiyih. Dnepropetrovsk: POROGI; 1996. 228 s. [in Russian].
5. Kozlov SV, Savenkova OO. Geteromorfnist stinki sertsia na etapah rannogo kardiogeneza lydunu. Morfologiia. 2007;1(3):32-4. [in Ukrainian].
6. Bolshakova GB. Proliferaciya kardiomiocitov u plodov krys v norme i posle povrezhdeniya serdca. Byull. eksper. biol. 2008;4:471-4. [in Russian].
7. Balueva OB. Morfofunkcionalnaya kharakteristika kardiomiocitov v norme i posle vozdejstviya etilovogo efira dimetiltrikhlorgeksenovoj kisloty v razlichnye periody ontogeneza krys [avtoreferat]. Spb.; 1996. 22 s. [in Russian].
8. Podymov VF, Kortukov EV. Sovremennye metody analiza elektronno-mikroskopicheskikh avtoradiogramm v issledovaniyakh na subkletochnom urovne. Citologiya. 1988;23(12):1339-51. [in Russian].
9. Scheider R, Pfitzer P. Die Zahl der Kerne in isolierten Zellen des menschlichen Myokards. Virchows Arch. 1973;12:238-58.
10. Zahoruiko GE, Shmulich AV, Zahoruiko YuV. Zakonomernosti kinetiki rosta massy serdca, kompleksa (LZh+MZhP) i parenkhimy miokarda v prenatalnom i postnatalnom ontogeneze krys. Visnik probl. biol. i med. 2018;2(144):87-90. [in Russian].
11. Zahoruyko GE, Zahoruyko YuV. Vozrastnye izmeneniya razmerov i chisla kardiomiocitov, ix yader v processe prenatalnogo i rannego postnatal-nogo razvitiya serdca krys. Visnik probl. biol. i med. 2017;3(141):304-11. [in Russian]. 12. Zahoruyko GE, Zahoruyko YuV, Filatova VL. Morfo-metricheskaya kharakteristika populyacij kardiomiocitov obrazuyushhikh parenkhimu miokarda v processe postnatalnogo kardiomiogeneza. Visnik probl. biol. i med. 2018;2(147):282-6. [in Russian].
12. Pankov EYa. Oporno-dvigatelnyj apparat. V kn: Mikromorfologiya cheloveka. Chast 2. Kharkov: XGMU; 1994. s. 147-58. [in Russian].
13. Alov IA, Krasilnikova NV. Sutochnyj ritm mitozov raznykh organov belykh myshej i krys. Dokl. AN SSSR. 1962;142(4):933-8. [in Russian].
14. Shakhov VP, Popov SV. Stvolovye kletki i kardiomiogenez v norme i patologii. Tomsk: STT; 2004. 170 s. [in Russian].
15. Bryan A, Floret J, Heimfeld D. Endothelial cells contribute to generation of adult ventricular myocytes during cardiac homeostasis. Cell Reports. 2014;8(1):229-41.
ЗАКОНОМ1РНОСТ1 КАРДЮМЮГЕНЕЗА У ЩУР1В WISTAR: Р1СТ СУМАРНО1 ЧИСЕЛЬНОСП КАРД1ОМ1ОЦИТ1В I ФОРМУВАННЯ ПОПУЛЯЦП ДВОЯДЕРНИХ М1ОЦИТ1В В ПАРЕНХИМ1 М1ОКАРДА КОМПЛЕКСУ (ЛШ + МШП) Загоруйко Ю. В., Загоруйко Г. Е., Марциновський В. П., Фшатова В. Л.
Резюме. В iнтервалi часу (15 дiб до та 15 дiб тсля) народження щурят в мiокардi комплексу (ЛШ + МШП) сумарна чисельшсть (1-я + 2-я) КМЦ зростае (вщ 0,35 до 1,52) х 107 кмц. Найбтьша штенсившсть зростання значень I кмц визначаеться в паренхимi мюкарду новонароджених щурят (3,75 х 104 кмц/год або 625 кмц/ хв). В iнтервалi часу (18 дiб до та 15 дiб тсля) народження, в мiокардi комплексу (ЛШ + МШП) чисельшсть 2-я КМЦ зростае в 1000 разiв (вщ 0,0014 до 1,44) х 107 кмц. Максимальна штенсившсть росту чисельност 2-я КМЦ визначаеться в мiокардi (ЛШ + МШП) щурят на 5-ту добу (73 х 103 кмц/год i 1215 кмц/хв). Ключовi слова: кардюмюгенез, пролiферацiя, полтло^я, кардюмюцит.
ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАРДИОМИОГЕНЕЗА У КРЫС WISTAR: РОСТ СУММАРНОЙ ЧИСЛЕННОСТИ КАРДИО-МИОЦИТОВ И ОБРАЗОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ ДВУЯДЕРНЫХ МИОЦИТОВ В ПАРЕНХИМЕ МИОКАРДА КОМПЛЕКСА (ЛЖ + МЖП)
Загоруйко Ю. В., Загоруйко Г. Е., Марциновский В. П., Филатова В. Л.
Резюме. В интервале времени (15 суток до и 15 суток после рождения крысят) в миокарде комплекса (ЛЖ+МЖП) суммарная численность J кмц (1-я КМЦ + 2-я КМЦ) возрастает (от 0,35 до 1,52) х 107 кмц. Наиболее интенсивный рост Хкмц определяется в паренхиме миокарда новорожденных крысят (3,75 х 104 кмц/ час и 625 кмц/мин). В интервале времени (18 суток до и 15 суток после рождения) в миокарде комплекса (ЛЖ+МЖП) численность N2-я кмц возрастает в 1000 раз (от 0,0014 до 1,43) х 107 кмц. Максимальная интенсивность роста численности N2-я кмц определяется в паренхиме миокарда (ЛЖ + МЖП) у 5-ти суточных крысят (73 х 103 кмц/час и 1215 кмц/мин).
Ключевые слова: кардиомиогенез, пролиферация, полиплоидия кардиомиоцит.
REGULARITIES OF CARDIOMYOGENESIS IN WISTAR RATS: CARDIOMYOCYTES NUMBER OF GROWTH AND FORMATION OF PUBLICATION OF DUAL MYOCYTES IN THE COMPLEX MYOCARDIUM (LV + IVF) Zagoruуko Yu. V., Zagoruуko G. E., Martsinovsky V. P., Filatova V. L.
Abstract. In the work were used: 15-16 and 20-21 daily embryos of rats, newborns, 1 - 45 daily rats - Wistar males. A morphometric analysis of the myocardial parenchyma of the complex "left ventricle + interventricular septum" (LV + IVF) was performed. It was established that in the process of prenatal and postnatal cardiomyogenesis (15 days before and 45 days after) birth, the total number of CMC (2 cmc = N1^ 1st cmc + N2< cmc) in the parenchyma (LV + IVF) increases by 4,34 times (from 0.35 to 1.52) x 107 cmc. During the period of embryonic cardiomyogenesis (15-21) days, the values of L cmc increase by 2 times (from 0.35 to 0.74) x 107 cmc. In the process of postnatal cardiomyogenesis, in the time interval (newborns - 15 daily rats), the volume of values cmc also increases by 2 times (from 0.77 to 1.52) x 107 cmc. In the time interval (15-45) days, the total number of cmc does not change - 2 cmc и const и (1.51 ± 0.02) x 107 cmc. During the embryonic period of cardiomyogenesis continuous proliferation of cmc occurs with a maximum speed of 3.75 x 104 cmc/h or 625 cmc/min in the myocardial parenchyma of the newborn rat pups. After birth a significant decrease in the rate of proliferative processes in the myocardial parenchyma is observed. at t ^ 15 days, AN cmc/day > 0. The formation of the 2nd cmc population in the myocardium of the complex (LV + IVF) begins from the 19th day of embryogenesis in rats. In the process of cardiomyogenesis (18 days before and 15 days after) the birth of rat pups as a result of polyploidy the number of 2nd cmc in the parenchyma (LV + IVF) increases 1000 times! (from 0.00144 to 1.44) x 107 cmc. In the time interval te (15 - 45) days the digital values of the index N 2cmc и const и 1.44 x 107 cmc. Therefore, after the completion of the postnatal period of cardiomyogenesis, the number of 2nd cmc does not change and amounts to и 94 - 95% of the total number of
myocytes in the myocardial parenchyma of the complex (LV + IVF). The most active polyploidy process of cmc occurs within 5 days after the birth of rat pups. The maximum speed of polyploidy of cmc is determined on the 5th day and is equal to 73 x 103 cmc/h or 1215 cmc/min.
Key words: rats, cardiomyogenesis, proliferation, polyploidy, cardiomyocytes, left ventricle + interventricular septum.
Рецензент - проф. брошенко Г. А. Стаття наджшла 21.02.2019 року
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-75-79 УДК 546.881:678.048 Сушко О. О., 1скра Р. Я.
ВПЛИВ ЦИТРАТУ ВАНАД1Ю НА МАСУ Т1ЛА, Р1ВЕНЬ ГЛЮКОЗИ В КРОВ1 ТА АНТИОКСИДАНТНИЙ ЗАХИСТ У ПЕЧ1НЦ1 ТА НИРКАХ ЩУР1В 13 АЛОКСАНОВИМ ЦУКРОВИМ Д1АБЕТОМ 1нститут б10Л0гГ| тварин НААН (м. Льв1в)
sushko.ola@gmail.com
Зв'язок публiкацГí з плановими науково-дослщ-ними роботами. Дослiдження виконувалися вщпо-вiдно до завдання програми наукових дослщжень НААН 35.00.01.02 Ф «Вивчити бiологiчнi особливост1 дм цитратiв мiкроелементiв в рiзнi перюди онтогенезу тварин», ДР № 0116и001407.
Вступ. Цукровий дiабет (ЦД) - це група метабо-лiчних захворювань, що характеризуеться ппергли кемieю, яка е наслiдком дефектiв секрецп та/або дй" iнсулiну. Захворювання характеризуеться хрошчним перебiгом i порушенням уах видiв обмiну речовин: вуглеводного, лтщного, протеинового, мiнерaльного i водно-сольового. У даний час хворих на ЦД у свт нaлiчуеться близько 400 мшьйошв, i очiкуеться, що "х кiлькiсть зросте до 550 мiльйонiв у 2030 роцi [1].
Лтування ЦД iнсулiном спрямоване на максимально можливу компенсaцiю вуглеводного обмшу, зaпобiгaння гiпо- i ппергжкемп. Використання шсули ну перорально унеможливлюеться через деградащю пептиду у кишково-шлунковому тракту саме тому ви-користовують його лише шляхом ш'екцп. Такий зааб для лiкувaння ЦД е дорогим, болкним та непрактич-ним. Тому виникла потреба у пошуку речовин, як1 будуть шсулшовими iмiтaторaми та як можна вико-ристовувати перорально. £ ряд юшв метaлiв, яким влaстивi iнсулiн-подiбнi влaстивостi: V(IV, V), Сг(111), Mo(VI), Мп(11), W(VI), Se(V), Zn(II) [2].
Сьогоднi цiкaвим мaтерiaлом для дослiджень у всьому свт стала iнсулiноподiбнa влaстивiсть Вана-дш та його використання в якост терапевтичного за-собу для профтактики та лiкувaння ЦД. Як вщомо, Вaнaдiй виступае необхiдним мiкроелементом для нормального клп"инного функцiонувaння та розви-тку оргaнiзму. Мехaнiзм дм шсулшсенсиб^зуючих ефектiв Вaнaдiю пов'язаний з шпбуванням тирозин-фосфатази [3]. Iнгiбувaння цього протешу в^грае ключову роль у негативнш регуляцп сигнальних шля-хiв, опосередкованих рецепторами iнсулiну i лепти-ну, що вiдповiдно регулюе чутливiсть до iнсулiну. Це iдеaльнa фармацевтична мшень при лiкувaннi ЦД та ожирiння.
Пiдвищений оксидативний стрес в^грае важли-ву патогенну роль у розвитку та прогресуванш дia-бету та його ускладнень [4]. Постшна гiперглiкемiя призводить до збiльшення виробництва вшьних ра-дикaлiв за допомогою автоокиснення глюкози та не-ензиматичного глтозилювання проте'|'шв [5]. Активн1
форми Оксигену (АФО) модифтують лтщи, вуглево-ди, протеТни та нуклеíновi кислоти i реагують з ними, а це у свою чергу призводить до цитотоксичност i дисфункцп.
Рiвень АФО контролюються антиоксидантними ензимами, тому антиоксидантний захист у печшц та нирках виступае важливим фактором перебку дiабе-тичних ускладнень в цих органах.
Мета дослщжень. Встановити вплив рiзних кть-костей цитрату ванадш на масу тiла, рiвень глюкози в кровi та активнiсть про/антиоксидантноТ системи у печiнцi та нирках щурiв iз алоксановим цукровим дiабетом.
Об'ект i методи дослiджень. Дослщження проведено на 40 бших лабораторних щурах, якi перебу-вали в умовах вiварiю 1нституту бюлоги тварин НААН (12 год цикл св^ло/темрява). Всi тварини були клЫч-но здоровi, отримували стандартний гранульований корм для лабораторних щурiв, був втьний доступ до води. Щури масою тiла вiд 100 до 120 г, роздтеш на п'ять груп: I група - контрольна; II, Ill, IV, V - дослщ-ш групи. Тварини контрольноТ групи утримувалися в тих же умовах, що i тварини дослщних груп. До-слiдним щурам II групи давали пити чисту воду без добавок, а тваринам III, IV, V груп протягом мкяця до питноТ води додавали розчин цитрату ванад^ в дозах 0,125, 0,5 i 2,0 мкг V/мл води. У тварин II, III, IV, V дослщних груп на тл 24-ох годинного голоду-вання був викликаний експериментальний цукровий дiабет (ЕЦД) шляхом внутрiшньоочеревинного вве-дення 5% розчину монопдрат алоксану ("Синбiас") у кiлькостi 150 мг/кг маси тша. Гiперглiкемiю виявляли шляхом вимiрювання глюкози кровi, зiбраноí з хвос-товоТ вени, за допомогою портативного глюкометра ("Gamma-M"). Динамiку змiни рiвня глюкози проводили натще перед початком закладання дослщу та впродовж експерименту, а також продовжували вимiрювання тсля ш'екци алоксану на 32-, 36- i 40-у доби. Рiвень глюкози в кровi бiльше 11,1 ммоль/л у щурiв був прийнятий як успiшна iндукцiя цукрового дiабету. Щурам I групи вводили 0,9% фiзiологiчний розчин у кiлькостi вщповщнш алоксану.
На 40 добу дослщжень тварин виводили з експерименту шляхом забиття за введення тюпенталу натрiю. Експерименти на тваринах проводилися вщ-повiдно до положень "бвропейськоТ конвенци про захист хребетних тварин, як використовуються для
