CC BY
20
Б1ОЛОГ1Я
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-67-70 УДК 612.617.1:615.014.41:539.21-022.532
Волкова H. О., Юхта M. С., Чернишенко Л. Г., Степанюк Л. В., Сокл Л. В., Гольцев А. М.
ЗАСТОСУВАННЯ Б1ОПОЛ1МЕР1В ПРИ КР1ОКОНСЕРВУВАНН1
ТЕСТИКУЛЯРНОТ ТКАНИНИ ЩУР1В 1нститут пpoблeм Kpio6^orií i кpioмeдицини НАН УкраУни (м. Харкгв)
volkovana781@gmail.com
Зв'язок nублiкацГí з плановими науково-дослщ-ними роботами. Роботу виконано зпдно з планом науково-дослщно! роботи вщдшу крюпатофГзюло-rií та ¡мунологи inKiK НАН Укра'ши у рамках вщомчо!' тематики: «ОптимГзацГя методiв крiоконсервування тканин звитих канальщв сiм'яникiв щурiв з викорис-танням полiмерних носив i наноматерiалiв» (№ державно! реестрацп 0116U003489). Робота проведена за пщтримкою бюджетно! програми НАН Укра'ши «Пщ-тримка розвитку прiоритетних напрямiв наукових до-слiджень» (КПВК 5641230), доrовiр № 2.2.6.99.
Вступ. Kрiоконсервування тканини тестисГв -метод, який може сприяти збереженню репродуктивного потенщалу у рiзних видiв тварин i людини [1], адже ця тканина мГстить сперматогони, з яких в процеа сперматогенезу утворюються сперматозощи. ПГсля заморожування-вiдirрiву сперматогенез може бути завершений in vitro або in vivo, а отримаш спер-матозощи можна використовувати для заплiднення методом внутршньоцитоплазматично'| ¡н'екцп [2]. Ця бiотехнолоriя е единим способом збереження фер-тильшсть молодих пацiентiв, яким показана терашя онкозахворювань.
В даний час немае стандартизованого протоколу крiоконсервування тестикулярно! тканини. БшьшГсть центрiв використовують проrрамне заморожування пщ захистом диметилсульфоксиду (ДМСО) або його поеднання з сахарозою [3]. Кшька дослiджень проде-монстрували переваrу ДМСО для крюконсервування тканини тестисiв над ¡ншими крiопротекторами [4,5]. КрГм того, ксенотрансплантащя крюконсервовано! пщ захистом ДМСО тестикулярно! тканини статевонезри лих макак-резус показала можливГсть ¡ндукцп сперматогенезу [6].
Проте Ohta H. зГ спiвавторами показали, що пщ час крюконсервування вщбуваеться втрата сперма-тогональних стовбурових клГтин. Тому ефектившсть процедури крюконсервування е критичною i повинна бути удосконалена [7]. Перспективним шдходом е використання бюполГмерних гелГв, адже наявшсть позаклГтинного матриксу може впливати на структуру льоду, що утворюеться на етапах охолодження. Попе-редш нашГ дослщження показали, що застосування 6í-ополГмерГв на етап експозицГ! зменшувало токсичний вплив ДМСО на клГтини сперматогенного ештелш та дозволяло збшьшити строк експозицГ! [8,9].
Мета роботи - визначення впливу бюполГме-рГв на збереження морфолопчних характеристик та функцюнального стану фрагмент звитих канальщв сГм'янишв статевонезрших щурГв за умов програмно-го заморожування.
Об'ект i методи дослiдження. yci мантуляцп з тваринами проводили зпдно з положеннями бвро-пейськоУ конвенцп з захисту хребетних тварин, як1 використовуються для експериментальних та шших наукових цiлей. Сiм'янi канальця отримували мехашч-ним шляхом з обох ам'янишв стaтевонезрiлих щурiв (n=20, масою 50±15 г, вiком 7-8 тижшв). З одержаного матерiалу робили навыки масою 75±3 мг i розмiрами вiд 6 до 8 мм3.
Експериментальш групи: 1. колагеновий гель (КГ) + 5% ДМСО (ПанЕко, Ро0я) (n=5); 2. фiбриновий гель (ФГ) + 5% ДМСО (n=5). Контрольш групи: 1. розчин Хенкса (PAA, Австрiя) + 5% бичачий сироватковий альбумш (БСА) (PAA) + 5% ДМСО (n=5); 2. розчин Хенкса без кри опротектору (негативний контроль) (n=5); 3. нативна тканина (штактний контроль) (n=5). Для приготування КГ використовували колаген I типу, який отримували iз сухожиль хвоспв щурiв за стандартною методикою [10]. ФГ отримували з середньоУ фракцп свiжоï кров1 тварин пiсля центрифугування (12 хв, 1500 g).
Звит канальц сiм'яникiв щурiв iнкубували в се-редовищах протягом 30 хв (40С) та крiоконсервували з використанням заморожувача ЗП-10 (СКТБ ДВ InKiK НАН УкраУни) за програмою: охолодження до 0°С з1 швидкiстю 1°С/хв; зупинка 5 хв при 0°С; охолодження до -8°С зi швидшстю 1°С/хв; зупинка 1 хв при -8°С; охолодження до -40°С зi швидкiстю 1°С/хв та до -70°С з1 швидкiстю 10°С/хв; перешс у рiдкий азот. Зразки збе-рiгали в умовах крiобанку впродовж мкяця, пiсля чого вiдiгрiвали на водянш банi при 40°С до рщкоУ фази. Kрiопротектор видаляли шляхом трьохетапноУ змiни крiозахисного середовища на розчин Хенкса.
Для пстолопчних дослщжень зрiзи звитих ка-нальцiв товщиною 7 мкм фарбували гематоксилiном i еозином та дослщжували пiд мтроскопом «LSM 510 Meta» («Carl Zeiss», Нiмеччина). Метаболiчну ак-тивнiсть дослщжували за допомогою МТТ-тесту [11] при довжиш хвилi 540 нм. Загальну актившсть лактат-дегiдрогенази (ЛДГ) вимiрювали за допомогою тест-набору реактивiв «ЛДГ» («Фшат^агностика», Укра-Уна) вщповщно до шструкцп виробника.
Перевiрка нормальност розподiлу кiлькiсних ознак проводилася за сшльним критерieм перевiрки на симетричшсть i нульового коефiцieнту ексцесу. До-стовiрнiсть вiдмiнностей мiж групами оцшювали за допомогою t-критерiю Стьюдента з використанням паке^в програм «Microsoft Excel» та «Statistika 8». Критичне значення рiвня значущостi приймалося рiв-ним 0,05.
Результати дослщження та ïx обговорення. Псто-логiчно, сiм'янi канальця щурiв штактноУ групи мали нормальну структурну органiзацiю. Крюконсервуван-
Рис. 1. Звит канальця ам'яниюв статевонезрших щур^в шсля крюконсервування. Забарвлення гематоксилином та еозином,
збшьшення х150.
Рис. 2. Метабол^чна активность за МТТ-тестом (А) та активность ЛДГ (Б) в зразках звитих канальцев ам'яниюв шсля
крюконсервування.
Приметки: суцтьна л^я - показник iнтактного контролю; пунктирна лЫя - показник негативного контролю; * - рiзниu,я вiропдна вщ-носно вiдповiдного крiопротектору (р<0,05; п=5).
ня звитих канальц1в без кр1опротектор1в (негативний Використання БСА та КГ у комбшацп з 5% ДМСО контроль) (рис. 1) викликало груб1 порушення Тх г1сто- сприяло зниженню ступеню ретракцп I десквамацп, структури: р1зка ретракц1я кл1тин з утворенням вели- к1лькост1 I розм1ру сферичних порожнин в сперма-ких тр1щин всередин1 сперматогенного ештел1ю, його тогенному ештелш. У випадку застосування ФГ з 5% повна десквамац1я, л1зис I п1кноз майже 90% ядер. ДМСО поряд з наведеними змшами вщбувалося
зменшення кiлькостi клiтин з ткнотичними ядрами Аналiз отриманих даних свщчить про те, що вико-
(рис. 1). ристання ФГ у складi крiозахисного середовища шд-
Метаболiчна актившсть клп-ин звитих канальцiв вищуе стштсть клiтин звитих канальцiв статевонезри
та актившсть ЛДГ шсля крiоконсервування в уах ви- лих щурiв до д" низьких температур.
падках знижувалася вщносно iнтактного контролю. Висновки. Крюконсервування звитих канальцiв
Проте за даними МТТ-тесту крiоконсервування пiд за- ^м'яни™ статеи^т™ щурт з застосуванням
г„, „„„^ бринового гелю е бiльш ефективним у порiвнянш з
хистом ФГ з 5% ДМСО було ефектившшим порiвняно .Л.
БСА та колагеновим гелем.
з негативним контролем та БСА + 5% ДМСО в 3,9 та п
о пс.а.иопит ™п1Нилст ,а и^п D ,а Перспективи подальших дослiджень. Отримаш
1,3 рази вiдповiдно. Загальна актившсть ЛДГ в зразках данi можуть бути викориcтанi для обфунтування та
крюконсервованих пiд захистом ФГ з 5% ДМСО була в розробки ефективних методик крюконсервування
1,6 та 1,4 рази вище негативного к°нтр°лю та БСА + 5% звитих канальщв ciм'яникiв з використанням бюполи
ДМСО вiдповiдно. Застосування КГ виявилось менш мерних носив для створення крiобанкiв незршо''' тести-
ефективним в обох дослщженнях (рис. 2). кулярно''' тканини з метою вiдновлeння фертильносп.
Л1тература
1. Lima D, Silva T, Morais GB, Aquino-Cortez A, Evangelista J, Xavier Junior F, et al. Different associations of cryoprotectants for testicular tissue of prepubertal cats submitted to vitrification. Reprod Domest Anim. 2017;52(2):235-41.
2. Yokonishi T, Sato T, Komeya M, Katagiri K, Kubota Y, Nakabayashi K, et al. Offspring production with sperm grown in vitro from cryopreserved testis tissues. Nat Commun. 2014;5:4320.
3. Suzuki N, Donnez J, editors. Gonadal Tissue Cryopreservation in Fertility Preservation. Springer Japan; 2016. 192 p.
4. Keros V, Hultenby K, Borgstram B, Fridstrom M, Jahnukainen K, Hovatta O. Methods of cryopreservation of testicular tissue with viable spermatogonia in pre-pubertal boys undergoing gonadotoxic cancer treatment. Hum Reprod. 2007;22:1384-95.
5. Keros V, Rosenlund B, Hultenby K, Aghajanova L, Levkov L, Hovatta O. Optimizing cryopreservation of human testicular tissue: comparison of protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide as cryoprotectants. Hum Reprod. 2005;20:1676-87.
6. Jahnukainen K, Ehmcke J, Hergenrother SD, Schlatt S. Effect of cold storage and cryopreservation of immature nonhuman primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Hum Reprod. 2007;22:1060-7.
7. Ohta H, Wakayama T. Generation of normal progeny by intracytoplasmic sperm injection following grafting of testicular tissue from cloned mice that died postnatally. Biol Reprod. 2005;73(3):390-5.
8. Volkova NO, Yukhta MS, Chernyshenko LG, Stepanyuk LV, Sokol LV, Goltsev AM. Exposure of seminiferous tubules of immature rats to cryoprotec-tive media of various compositions. Probl Cryobiol Cryomed. 2017;27(3):203-18.
9. Volkova N, Yukhta M, Goltsev A. Biopolymer gels as a basis of cryoprotective medium for testicular tissue of rats. Cell and tissue banking. 2018;19(4):819-26.
10. Chandrakasan G, Torchia DA, Piez KA. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J Biol Chem. 1976;251:6062-7.
11. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):55-63.
ЗАСТОСУВАННЯ Б1ОПОЛ1МЕР1В ПРИ КР1ОКОНСЕРВУВАНН1 ТЕСТИКУЛЯРНОТ ТКАНИНИ ЩУР1В Волкова Н. О., Юхта М. С., Чернишенко Л. Г., Степанюк Л. В., Сокш Л. В., Гольцев А. М. Резюме. Метою роботи було визначення впливу колагенового (КГ) та фiбринового (ФГ) гeлiв на морфо-функцюнальш характеристики фрагменпв звитих канальщв ам'янишв статевонезрших щурiв за умов про-грамного заморожування. Встановлено, що крюконсервування фрагменпв ам'яних канальщв шд захистом крюсередовища на оcновi ФГ дозволяе зберегти 'х пстоструктуру та мeтаболiчну актившсть i е бшьш результа-тивним, шж застосування розчину Хенкса з БСА. За результатами пстолопчного дослщження ФГ з 5% ДМСО (на вщмшу вщ КГ) зменшував виражешсть явищ десквамаци та ретракци сперматогенних ^тин, а також кшьшсть клп"ин з ткнотичними ядрами. Схожа тенденщя спостер^алась i при дослщження мeтаболiчноí активносп (МТТ-тест) та активносп ЛДГ в ^тинах звитих канальщв шсля крюконсервування. Отримаш даш можуть бути використаш для об^рунтування та розробки ефективних методик крюконсервування звитих канальщв ам'яникт з використанням бiополiмeрних гeлiв для створення крюбаншв незршо''' тестикулярно''' тканини.
Ключов1 слова: тестикулярна тканина, статевонезрш щури, диметилсульфоксид, крюконсервування, бича-чий сироватковий альбумш, колагеновий гель, фiбриновий гель.
ПРИМЕНЕНИЕ БИОПОЛИМЕРОВ ПРИ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИИ ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ТКАНИ КРЫС Волкова Н. А., Юхта М. С., Чернышенко Л. Г., Степанюк Л. В., Сокол Л. В., Гольцев А. Н. Резюме. Целью работы было определение влияния коллагенового (КГ) и фибринового (ФГ) гелей на морфо-функциональные характеристики фрагментов извитых канальцев семенников неполовозрелых крыс в условиях программного замораживания. Установлено, что криоконсервирование фрагментов семенных канальцев под защитой криозащитной среды на основе ФГ позволяет сохранить их гистоструктуру и метаболическую активность и есть более результативным, чем применение раствора Хэнкса с БСА. По результатам гистологического исследования ФГ с 5% ДМСО (в отличие от КГ) уменьшал выраженность явлений десквамации и ретракции сперматогенных клеток, а также количество клеток с пикнотичными ядрами. Похожая тенденция наблюдалась и при исследовании метаболической активности (МТТ-тест) и активности ЛДГ в клетках извитых канальцев после криоконсервирования. Полученные данные могут быть использованы для обоснования и разработки эффективных методик криоконсервирования извитых канальцев семенников с использованием биополимерных гелей для создания криобанков незрелой тестикулярной ткани.
Ключевые слова: тестикулярная ткань, неполовозрелые крысы, диметилсульфоксид, криоконсервирование, бычий сывороточный альбумин, коллагеновый гель, фибриновый гель.
APPLICATION OF BIOPOLYMERS FOR CRYOPRESERVATION OF RAT TESTICULAR TISSUE
Volkova N. O., Yukhta M. S., Chernyshenko L. G., Stepanyuk L. V., Sokil L. V., Goltsev A. M.
Abstract. Today, transplantation of cryopreserved fragments of immature testicles is a non-alternative way for fertility preserving in pre-adolescent patients, which has been planed cytotoxic therapy. However, loss of spermatogonal stem cells occurs during cryopreservation. Therefore, the effectiveness of the cryopreservation procedure is critical and should be improved. A promising approach is to use biopolymer gels, since the presence of an extracellular matrix may affect the structure of ice crystals during cryopreservation.
The aim of the work was to determine the effect of collagen (CG) and fibrin (FG) gels on the morphological and functional characteristics of the fragments of the seminiferous tubules of the testes of immature rats in a programmed freezing condition.
Object and methods. The following experimental cryoprotective media were used: 1. collagen gel (CG) with 5% DMSO; 2. fibrin gel (FG) with 5% DMSO. Controls: 1. Hanks' solution with 5% bovine serum albumin (BSA) and 5% DMSO; 2. Hanks' solution without cryoprotectant; 3. intact tissue. CG was prepared from collagen type I, which was obtained from rat tendons. FG was obtained from an average fraction of fresh blood of animals after centrifugation (12 min, 1500 g).
Samples of seminiferous tubules were obtained mechanically from both testes of immature rats (n = 50, weighing 50 ± 15 g, aged 7-8 weeks), incubated in media for 30 min (4°C) and cryopreserved according to the program: ramp to 0°C at a rate of 1°C/min; hold for 5 min at 0°С; ramp to -8°С at a rate of 1°C/min; hold for 1 min at -8°C; ramp to -40°C at a rate of 1°C/min and up to -70°C at a rate of 10°C/min; transferred to liquid nitrogen. After heating the histological structure and the metabolic activity (MTT test and LDH activity) of spermatogenic epithelium cells was evaluated.
Results. Histologically, testicular tissue of intact rats had a normal structural organization. Cryopreservation without cryoprotectants (negative control) caused gross damages of structure of seminiferous tubules: a sharp retraction of cells with the formation of large cracks inside the spermatogenic epithelium, its complete desquamation, lysis and picnosis of almost 90% of nuclei. The spermatogenic epithelium after cryopreservation under protection of BSA + 5% DMSO had moderately pronounced changes: the degree of retraction and desquamation, the number and size of the cavities decreased. The use of FG with 5% DMSO (as opposed to CG) led to a decrease in the severity of desquamation and retraction of spermatogenic cells, as well as in the number of cells with pyknotic nuclei, compared to the use of BSA instead biopolymer gel.
According to the MTT-test, cryopreservation under the protection of FG with 5% DMSO was in 3.9 times more effective compaid to the negative control, exceeding by 27% the result of application of BSA as the basis of the cryoprotective medium. A similar trend was observed during LDH activity determination: in the group of FG + 5% DMSO application LDG activity was increased in 1.6 times in relation to negative control. The use of CG was less effective by both parameters.
In general, the obtained data indicate that the use of FG as a basis of cryoprotective medium increases the resistance of the cells of the seminiferous tubules of immature rats to the action of factors of cryopreservation.
Conclusion. Cryopreservation of fragments of the seminiferous tubules under the protection of a cryoprotective medium based on FG allows preserving their histostructure and metabolic activity and is more effective than the use of BSA or CG.
Key words: testicular tissue, immature rats, dimethyl sulfoxide, cryopreservation, bovine serum albumin, collagen gel, fibrin gel.
Рецензент - проф. брошенко Г. А.
Стаття наджшла 13.03.2019 року
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-70-75 УДК 612.172: 611.127-018
1Загоруйко Ю. В., Загоруйко Г. Е., Марциновский В. П., 2Филатова В. Л.
ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАРДИОМИОГЕНЕЗА У КРЫС WISTAR: РОСТ СУММАРНОЙ ЧИСЛЕННОСТИ КАРДИОМИОЦИТОВ И ОБРАЗОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ ДВУЯДЕРНЫХ МИОЦИТОВ В ПАРЕНХИМЕ МИОКАРДА КОМПЛЕКСА (ЛЖ + МЖП) Ровненский государственный гуманитарный университет (г. Ровны) Харьковский национальный медицинский университет (г. Харьков) 2Украинская медицинская стоматологическая академия (г. Полтава)
prof.zagoruykoGE@gmail.com
Связь публикации с плановыми научно-исследовательскими работами. Исследование проведено в соответствии с тематикой НИР «Морфофункцюналь-ний стан оргашв I тканин експериментальних тварин та людини в онтогенез! в норм1 та шд впливом зовшш-шх I внутр1шн1х чиннишв», № государственной регистрации 0117и003181.
Вступление. Проблемы миогенеза скелетной мышечной ткани [1] и кардиомиогенеза [2-6] привлекают пристальное внимание ученых на протяжении многих
десятилетий. Одной из проблем кардиомиогенеза является исследование закономерностей пролифе-ративных процессов, развивающихся в миокарде в период эмбрионального и постнатального онтогенеза позвоночных животных и человека [2-6]. Пролиферация кардиомиоцитов (КМЦ) способствует росту массы и объема миокарда, формированию четырехкамер-ного сердца, которое начинает активно сокращаться с 15 суток пренатального развития крысят Wistar. По данным [6,7] в миокарде 19-ти суточных эмбрионов
