CC BY
21
TIME REGULATIONS FOR CARRYING OUT PREVENTIVE ANTIEPISOOTIC MEASURES
IN ORNAMENTAL AND EXOTIC ANIMALS
Nikiforova N.A. Summary
The article presents materials on the regulation of labor of veterinary specialists providing services to decorative and exotic animals. As an example, the calculations of the time norms for vaccination of ferrets against infectious diseases, deworming of rabbits, treatment of raccoons and rats against ectoparasites are given. Scientifically grounded norms of time of veterinarians for carrying out preventive antiepizootic measures among decorative and exotic animals have been established.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-245-1-131-137 УДК636.2.034:618.19:002.1:615.012.6:615.038
ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ КОРОВ МАСТИТОМ И СВОЙСТВА НОВОГО СРЕДСТВА
ДЛЯ ЕГО ТЕРАПИИ
Норкин А.Г.1 - аспирант, Конопельцев И.Г1. - д.вет.н., профессор, Николаев С.В.1'2 - к.вет.н., доцент, Глухова М.В1. - к. вет. н, доцент
1ФГБОУ ВО «Вятский государственный агротехнологический университет» 2Институт агробиотехнологий им. А.В. Журавского Коми НЦ УрО РАН
Ключевые слова: коровы, мастит, наносеребро, бактерицидность, токсичность Keywords: cows, mastitis, nanosilver, bactericidal activity, toxicity
Производство экологически безопасных продуктов питания является одним из приоритетных направлений развития отечественной молочной перерабатывающей промышленности, что предусматривает получение исходного сырья высокого качества [7]. Однако острой остается проблема мастита в промышленном молочном скотоводстве, которой присущ мировой масштаб [3, 6]. В настоящее время к одной из быстро развивающихся областей современной нанотехнологии относится создание и применение в условиях производства наноразмерных частиц различных металлов [4]. Бактерицидные свойства молекул серебра характеризуются выраженным эффектом, как по отношению к аэробным, так и анаэробным микроорганизмам. При этом установлено, что патогенные микробы более чувствительны к молекулам серебра, чем непатогенные. Принцип его антимикробного воздействия заключается в том, что ионы данного метала, поглощаются клеткой микроорганизма, в результате чего нарушаются некото-
рые физиологические функции клетки, включая размножение. Известно, что диапазон противомикробного действия серебра намного шире многих антибиотиков и сульфаниламидов [2]. Выбор нанокомпо-зитов серебра имеет преимущество перед многими существующими антимикробными средствами, поскольку ему не присуща проблема резистентности патогенных микроорганизмов [8]. Следовательно, молочное скотоводство является перспективным направлением в использовании наночастиц серебра в качестве антимикробного агента. Прежде всего, с позиции разработки на его основе новых фармакологических средств и включения их в состав комплексных схем терапии животных с воспалением вымени. Однако, предшествующим клиническому использованию испытуемого лекарственного средства, должна быть его оценка по биологической безопасности, которая устанавливается на этапе доклинических испытаний [1, 5].
Целью работы явились анализ заболеваемости коров маститом на предприя-
тиях АПК Кировской области и изучение бактерицидных и токсических свойств у нового разработанного препарата на основе наночастиц серебра с протеолитическим ферментом.
Материал и методы исследований. Доклиническое исследование растворов с наносеребром выполнено в 2020 году в лаборатории болезней органов размножения и молочной железы Вятской ГСХА. Динамику маточного поголовья и формы проявления болезней молочной железы у коров осуществляли на основании статистической отчетности хозяйств Кировской области. В работе использовали серебро-содержащие растворы (Ag) (2000 ррm) и Ag+глицерин ^1у), а также тест микроорганизмы E.coli и S.aureus. Их концентрация в испытуемых растворах при проведении опытов составила: 1х109, 1х108 и 1х107 КОЕ/мл. Использовали в работе диско-диффузионный и суспензионный методы. При диско-диффузионном методе на плотную питательную среду в чашках Петри наносили культуры клеток E.coli и S.aureus, после чего на подсушенную поверхность питательной среды выкладывали квадраты из бязи, пропитанные исходными и в разведениях растворами Ag и Ag+Gly. После инкубирования чашек Петри, с посевами тест микроорганизмов, при температуре 37 0С определяли наличие зон ингибирования их роста. При суспензионном методе тест микроорганизмы в тех же концентрациях вносили в пробирки с растворами исходными и в разведениях Ag и Ag+Gly [10].
Исследование комплексного препарата на острую и хроническую токсичность проведено на клинически здоровых половозрелых аутбредных белых мышах-самцах живой массой 20-24 г [9]. На первом этапе исследований, путем интраже-лудочного и внутрибрюшинного введения, была проведена оценка острой токсичности препарата. Для этого сформировали 4 группы мышей по 7 животных в каждой (2 подопытных и 2 контрольных). Комплектование групп осуществляли по принципу аналогов. Каждому животному подопытных групп, тем или иным способом, вводили изучаемый раствор в дозе 1,0 мл,
контрольным - в идентичном количестве 0,9 % раствор натрия хлорида. После введения препарата за мышами осуществляли наблюдение на протяжении 2-х недель. В течение первых 6-ти часов лабораторные животные находились под непрерывным наблюдением. На втором этапе исследований провели токсикологическую оценку нового разработанного средства при его длительном применении. Для этого мышам подопытной группы (n=12) каждый день в течение 14-ти суток интрабрюшинно назначали в дозе 1,0 мл, животным контрольной группы (n=12) вводили физиологический раствор натрия хлорида в идентичной дозировке.
У лабораторных животных всех групп определяли массу до кормления перед началом эксперимента, на 1, 3, 7 и 14 сутки опыта. Уровень интоксикации организма определяли по изменениям клинической картины и смертности экспериментальных животных. Через две недели по окончании опыта выживших животных всех групп наркотизировали эфиром, проводили декапитацию и оценивали макрокартину изменений внутренних органов. При оценке токсичности препарата при длительном применении, часть мышей (n=6) подвергали эвтаназии через 24 часа после последней инъекции испытуемых растворов. От мышей получали кровь, стабилизировали ЭДТА и проводили гематологические исследования на анализаторе URIT-3020.
Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики на достоверность различия сравниваемых показателей в программе Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента.
Результат исследований. Цифровой материал статистической отчетности за 2017, 2018 и 2019 гг. по распространенности воспаления вымени у коров на сельскохозяйственных предприятиях Кировской области представлен в таблице 1.
Из представленных данных таблицы 1 видно, что поголовье коров на сельскохозяйственных предприятиях с каждым годом увеличивается. Так в 2018 году численность коров составила 88664, что на 1,9 % больше по сравнению с предыдущим
годом. В 2019 году коров насчитывалось анализируемый период маточное поголо-
уже 90610 или на 2,1 % больше, чем их вье увеличилось с 86960 до 90610 или на было в 2018 году. Следует отметить, что за 4,0 %.
Таблица 1 - Динамика численности коров в сельскохозяйственных организациях предприятиях Кировской области и их заболеваемость воспалением молочной железы_
Показатель 2017 г. 2018 г. 2019 г.
Количество подконтрольного поголовья коров 86960 88664 90610
Выявлено коров больных субклиническим маститом 26503 30498 32512
Выявлено коров больных клиническим маститом 18380 17268 18624
На фоне повышения численности коров отмечали и увеличение случаев заболеваемости их субклиническим маститом. В 2017 году данную патологию вымени диагностировали у 26503 коров (30,5 %), в 2018 году - у 30498 (34,4 %), в 2019 году - у 32512 (35,9 %). При этом с 18380 до 18624 (на 1,3 %) увеличилась численность больных клиническим маститом животных, но, тем не менее, общее количество коров с патологией вымени оставалось достаточно высоким и по годам наблюдения составило соответственно
44883 (51,6 %), 47766 (53,9 %) и 51136 (56,4 %). На следующем этапе научной работы провели блок микробиологических исследований. Было установлено, что исходные растворы Ag и Ag+Gly вызывают задержку роста бактерий тест-штаммов, а в разведениях - только под квадратами пропитанными испытуемыми средствами.
Суспензионный метод позволил провести количественное определение гибели бактерий тест-штаммов во времени. Результаты данных микробиологических исследований приведены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2 - Влияние серебросодержащих растворов и их разведений на выживаемость E.coli
Показатель Количество жизнеспособных бактерий в серебросодержащих растворах и их разведениях (КОЕ/мл)
Ag Ag(1:10) Ag(1:100) Ag+Gly Ag+Gly(1:10) Ag+Gly (1:100)
До опыта 1х109 1х109 1х109 1х109 1х109 1х109
10 мин 1,5х104 1х108 1х108 1х108 1х108 1х108
20 мин 3000 1х108 1х108 1х108 1х108 1х108
30 мин 29 1х105 1х108 1х106 1х108 1х108
4 ч 0 180 112 0 96 1,1х108
24 ч 0 0 12 0 0 1х108
48 ч 0 0 0 0 0 1х108
Из представленных в таблице 2 данных по антибактериальной активности в отношении E.coli следует, что исходный раствор с содержанием частиц наносереб-ра уже через 30 мин снижает численность микроорганизмов до единичных клеток, а полностью вызывает их гибель через 4 ч. Следовательно, бактерицидные свойства нативного раствора начинают проявляться через 24 часа. Раствор в разведении 1:10 вызывает существенную нейтрализацию изучаемой культуры клеток микроорганизма уже через 4 ч, когда их концентрация снижается на 8 порядков. Полная гибель E.coli в этом случае проявлялась че-
рез 24 ч, а бактерицидные свойства этого раствора были установлены через 48 часов. Раствор Ag в разведении 1:100 в первые 24 часа снижает на 8 порядков численность тест-микроорганизма, бактерицидные свойства при этом проявляются у данного раствора через 48 часов инкубации E.coli. Исходный раствор Ag+Gly бактериостати-ческий эффект проявляет через 24 часа, а бактерицидный через 48 часов. Заслуживают внимания и антимикробные свойства Ag+Gly (1:10), которые через 24 часа справляются с нагрузкой в 108 и проявляют бактерицидные свойства в отношении E.coli спустя 48 часов после совместного
культивирования. Результаты микробиоло- Ag+Gly на S.aureus в различных их разве-
гических исследований по влиянию Ag и дениях представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Влияние серебросодержащих растворов и их разведений на устойчивость S.aureus
Показатель Количество жизнеспособных бактерий в серебросодержащих растворах и их разведениях (КОЕ/мл)
Ag Ag(1:10) Ag(1:100) Ag+Gly Ag+Gly(1:10) Ag+Gly (1:100)
До опыта 1х109 1х109 1х109 1х109 1х109 1х109
10 мин 1,7х105 1,2х108 1,3х108 1,2х108 1,2х108 1х108
20 мин 12500 1х108 1,1х108 1х108 0,9 х108 1х108
30 мин 21 1х107 1х108 1х106 1х108 1х108
4 ч 0 380 1010 0 106 107
24 ч 0 0 18 0 Е. к. 1,6х107
48 ч 0 0 0 0 Е. к. 1,5х107
Результаты испытаний S.aureus в растворах Ag (таблица 3) показали, что исходный раствор Ag уже через 30 мин снижает численность S.aureus до единичных клеток, а его бактериостатический эффект проявляется через 4 ч. Раствор Ag в разведении 1:10 снижает исходную численность S.aureus на 8 порядков уже через 4 часа совместного инкубирования. Раствор Ag (1:100) подобные свойства проявляет через 24 часа. Исходный раствор Ag+Gly бакте-риостатический эффект проявляет через 4 часа инкубирования S.aureus Следует отметить, что растворы Ag, Ag (1:10), Ag+Gly через 48 часов проявляли бактерицидный эффект в отношении S.aureus при исходной концентрации 1х109. Разведения раствора Ag+Gly с шагом 10 обладали значительно меньшими антибактериальными свойствами в отношении S.aureus.
На следующем этапе провели оценку острой токсичности раствора с наносе-ребром и трипсином при внутрижелудоч-ном введении, которая показала, что в течение первых 10-15 минут после манипуляции, животные как подопытной, так и контрольной групп были незначительно угнетены, после чего у них возникал рефлекс умывания, а по истечению первого часа двигательная активность и аппетит у них полностью восстанавился. Изменения массы тела мышей в подопытной и контрольной группе не отражали достоверно значимой разницы. При однократном вну-трибрюшинном введении препарата установили, что у мышей подопытной группы
в течение первого часа отсутствовал аппетит, наблюдалось снижение двигательной активности, животные находились в сидячем положении сгорбившись, глаза были полузакрыты. У отдельных животных наблюдалась кратковременная одышка. У мышей контрольной группы была зарегистрирована идентичная картина. Динамика изменений массы тела животных в обеих группах не имела достоверного отличия, также не было зарегистрировано значительного падения массы тела у отдельных мышей. При наблюдении за лабораторными животными в течение двух недельного периода, после однократного введении исследуемого препарата, летального исхода не было зарегистрировано.
Результаты исследования крови от животных подопытной и контрольной группы не имели достоверных отличий.
Таким образом, однократное, как внутрижелудочное, так и внутрибрюшин-ное назначения в максимально разрешенном количестве для введения (1,0 мл) раствора с наносеребром, не вызывало гибели объекта исследования, что в пересчете составило 40000 мг/кг массы одной особи.
При длительном применении исследуемого средства, после каждой инъекции у подопытных животных наблюдалось кратковременное угнетение, и исчезновение аппетита в первые 30-60 минут, затем способность к движению восстанавливалась, и животные начинали поедать корм. Динамика изменений массы тела у животных подопытной и контрольной групп
(Таблица 4) не имела достоверного различия, однако у 2-х мышей, которым назначали испытуемое средство, и у одной, получавшей физиологический раствор
Таблица 4 - Изменения массы тела мышей
По истечении 8-ми суток одна мышь подопытной группы отказалась потреблять корм и погибла, а масса оставшихся животных восстановилась до исходного значения. При вскрытии погибшего лабораторного животного установили покраснение и гиперемию органов брюшной полости, обширные кровоизлияния на брыжейке толстой кишки, что, по-видимому, явилось следствием механиче-
натрия хлорида, через 7 суток, после начала эксперимента отмечали снижение массы тела более чем на 5 % от исходного значения.
огократном назначении раствора с наносе-
ского воздействия иглы при процедуре инъекции. У мышей, подвергнутых эвтаназии через сутки и истечению 2-х недель после последней инъекции, макроскопических изменений внутренних органов установлено не было. Результаты исследования крови, полученной от лабораторных мышей, при определении хронической токсичности раствора с наносеребром и трипсином приведены в таблице 5.
Показатель Через 24 часа Через 14 суток
физиологический раствор №0 раствор с наносеребром физиологический раствор №0 раствор с наносеребром
Эритроциты, 1012/л 7,4±0,8 7,7±0,1 7,2±0,7 8,1±0,2
Средний объем эритроцитов, фл 55,0±1,2 58,7±1,1 54,1±1,1 55,9±1,7
Гемоглобин, г/л 78,0±3,6 86,8±2,8 74,2±9,4 85,3±1,3
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг/мл 8,6±0,7 10,9±0,3* 9,8±0,7 10,5±0,2
Гематокрит, % 40,3±3,7 45,2±1,0 41,5±2,8 45,3±0,7
Показатель анизоцитоза эритроцитов, % 12,9±0,2 15,6±0,5** 13,3±0,4 13,2±0,5
Лейкоциты, 109/л 9,8±1,3 8,7±1,3 11,7±2,1 13,0±4,1
Тромбоциты, 109/л 548,0±126,3 769,2±45,6 639,6±138,8 722,5±128,9
Средний объем тромбоцита, фл. 5,7±0,2 6,2±0,2 5,9±0,2 5,3±0,2
Показатель анизоцитоза тромбоцитов, % 7,7±0,4 7,9±0,3 7,7±0,4 6,9±0,5
*Р < 0,05; **Р < 0,001 по отношению к контролю
ребром и трипсином
Количсетво мышей со
Средняя масса животных снижением массы тела Погибло мышей
Показатель более чем на 5 %
Раствор с наносеребром Раствор с наносеребром Раствор с наносеребром
Исходная масса 21,5±0,5 22,3±0,6 - - - -
Через 24 часа 21,5±0,5 22,3±0,6 0 0 0 0
Через 3-ое суток 21,4±0,4 22,2±0,6 0 0 0 0
Через 7 суток 21,3±0,4 22,1±0,6 1 2 0 0
Через 2 недели 21,4±0,3 22,3±0,7 0 0 0 1
Через 4 недели 22,2±0,3 23,4±0,5 0 0 0 0
Таблица 5 - Изменения гематологических показателей экспериментальных лабораторных животных при применении раствора с наносеребром в течение двух недель
Аналитическая оценка исследуемых показателей крови, показала, что у мышей подопытной группы через сутки после последней инъекции раствора с наносереб-ром и трипсином наблюдался более выраженный анизоцитоз эритроцитов - на 2,7 % (Р<0,001), а также была более высокой концентрация гемоглобина в эритроците на 2,3 пг/мл (Р<0,05). Морфологические показатели крови по окончанию эксперимента не имели достоверного отличия.
Заключение. Раствор наночастиц серебра (2000 ррт) и его разведение 1:10 проявляет бактерицидные свойства в отношении полевых штаммов микроорганизмов, вызывающих воспаление вымени у коров, через 30 минут, 48 часов при совместной инкубации и результат зависит от КОЕ/мл. На основании результатов токсикологических исследований комплексного препарата можно заключить, что переносимая доза данного лекарства составляет более 40000 мг/кг массы тела, что в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 позволяет его отнести к 4 классу токсичности (более 5 000 мг/кг при введении в желудок). Применение раствора с наносеребром и трипсином на протяжении двух недель вызывает гиперхромию и анизоцитоз эритроцитов. При этом макроскопических изменений внутренних органов не происходит.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бледных, Л.В. Антимикробные и токсикологические свойства озонированного льняного масла / Л.В. Бледных, С.В. Николаев, И.Г. Конопельцев // Ветеринарный врач, 2017. - № 3. - С.44-51.
2. Брызгунов, В.С. Сравнительная оценка бактерицидных свойств серебряной воды и антибиотиков на чистых культурах микробов и их ассоциациях / В.С. Брызгунов, В.Н. Липин, В.Р. Матросова // Научн.тр. Казанского мед. института. -1964. - Т.14. - С.121-122.
3. Варганов, А.И. Распространение и этиология мастита и эндометрита у коров /А.И. Варганов, И.Г. Конопельцев, А.В. Филатов //Актуальные проблемы ветеринарной науки: Тез. докл. МГАВМиБ. -Москва. - 1999. - С. 7-8.
4. Глухова, М.В. Оценка антибактериальной активности и токсичности нового наноструктурного препарата / М.В. Глухова, И.П. Погорельский, М.Б. Тарасов // Международный научный журнал «Символ науки». - 2015. - № 4. -С. 215-218.
5. Грицюк, В.А. Исследование профиля безопасности диомаста-КРС на коровах как потенциального противомаститно-го препарата / В.А. Грицюк, Г.А. Вострои-лова, Н.Т. Климов [и др.] // Ветеринарный фармакологический вестник. - 2020. - № 3. (12). - С. 33-45.
6. Елесин, А.В. Распространение заболеваний сосков в хозяйствах с различным уровнем продуктивности / А.В. Еле-син, А.С. Баркова // Аграрный вестник Урала. - 2007. - № 6. - С. 76-79.
7. Климов, Н.Т. Мастит коров. Симптомы, профилактика и лечение / Н.Т. Климов // Био. - 2020. - № 4 (235). -С. 16-19.
8. Муха, Ю.П. Антимикробная активность стабильных наночастиц серебра заданного размера / Ю.П. Муха, А.М. Еременко, Н.П. Смирнова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. - 2013. -Т. 49. - № 2. - С. 215.
9. Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. — Москва: Изд. «Медицина», 2005. - 832 с.
10. Jorgensen, J.H. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. Manual of clinical microbiol ogy / J.H. Jorgensen, J.D. Turnidge // 9th-ed ASM Press Washington. - 2007. - P. 1152-1172.
ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ КОРОВ МАСТИТОМ И СВОЙСТВА НОВОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЕГО
ТЕРАПИИ
Норкин А.Г., Конопельцев И.Г., Николаев С.В., Глухова М.В.
Резюме
В настоящее время проблемы воспаления вымени у коров и получение качественной молочной продукции не потеряли своей актуальности. При незначительном росте маточного поголовья продолжает оставаться высоким процент больных маститом животных в стаде. Разработана технология получения наночастиц серебра (2000 ррт). Микробиологические исследования показали, что нативные растворы Ag проявляют бактерицидные свойства к E.coli и S.aureus через 24 часа, а в разведении 1:10 через 48 часов. Разведения раствора Ag глицерином обладали значительно меньшими антибактериальными свойствами в отношении E.coli и S.aureus. В рамках доклинических исследований было установлено, что разовая доза (1,0 мл) раствора наносеребра и протеолитического фермента не вызывает летального исхода у лабораторных мышей. Применение препарата в течение двух недель вызывало у мышей гиперхромию и анизоцитоз эритроцитов, без каких-либо макроскопических изменений внутренних органов.
THE INCIDENCE OF MASTITIS IN COWS AND THE PROPERTIES OF A NEW REMEDY
FOR ITS THERAPY
Norkin AG., Konopeltsev I.G., Nikolaev S.V., Glukhova M.B.
Summary
Currently, the problems of udder inflammation in cows and obtaining high-quality dairy products have not lost their relevance. With a slight increase in the breeding stock, the percentage of animals with mastitis in the herd continues to be high. A technology for producing silver nanoparti-cles (2000 ppm) has been developed. Microbiological studies have shown that native Ag solutions exhibit bactericidal properties to museum strains of E.coli and S.aureus after 24 hours, and in a 1:10 dilution after 48 hours. Dilutions of the Ag solution with glycerin had significantly lower antibacterial properties against E.coli and S.aureus. As part of preclinical studies, it was found that a single dose (1.0 ml) of a solution of nanosilver and a proteolytic enzyme does not cause a fatal outcome in laboratory mice. The use of the drug for two weeks caused hyperchromia and anisocytosis of red blood cells in mice, without any macroscopic changes in internal organs.
