Разработка и оценка токсических свойств озонированной эмульсии на основе рыбьего жира и гинодиксина Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ЕГЕПШАРНЫЙ

Врач

УДК 619:618.14-002: 615.28:615.9

разработка и оценка токсических свойств озонированной эмульсии на основе рыбьего жира и гинодиксинА

Л.В. Бледных - кандидат ветеринарных наук, доцент; С.В. Николаев - аспирант;

И.Г.Конопельцев - доктор ветеринарных наук, профессор.

ФГБОУ ВО«Вятская государственная сельскохозяйственная академия», г.Киров (610017г. Киров, Октябрьский пр. 133, тел. +7(332) 57-43-04, е-mail: [email protected]).

Одной из главных проблем современного молочного скотоводства с высокой рентабельностью производства молока, является низкая воспроизводительная способность коров, по причине высокой заболеваемостью животных эндометритом, который протекает при наличии в матке различных микроорганизмов, часто устойчивых к антимикробным препаратам. Поэтому целью работы явилась разработка озонированной эмульсии на основе гинодиксина и рыбьего жира и изучение её острой и хронической токсичности. Материалы и методы. Разработка новой эмульсии включала подбор оптимального соотношения рыбьего жира и гинодиксина, насыщение озоно-кислородной смесью, оценку антимикробных свойств в отношении Escherichia coli АТСС № 25922 (F-52) и Staphylococcus aureus АТСС № 25923 (F-49) с концентрацией от U102 до 1x10" микробных тел в мл. Озонированную эмульсию оценивали на величины острой и хронической токсичности. Результаты исследований. Установлено, что максимальной антимикробной активностью озонированная эмульсия обладает при предварительном смешивании части рыбьего жира с 3-4 частями гинодиксина. Однократное внутрибрюшинное введение мышам озонированной эмульсии в максимальной дозе 8000 мг/кг вызвало интоксикацию и гибель 20% животных. Доза 6000 мг/кг вызывала нарушение формирования каловых масс у лабораторных животных, а дозы 4000 и 2000 мг/кг не отражались на клиническом состоянии мышей. Заключение. Озонированная эмульсия, состоящая из рыбьего жира и гинодиксина, вызывает гибель основных микроорганизмов, присутствующих в матке при воспалении. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 озонированная эмульсия относится к 4 классу токсичности и характеризуется как малотоксичная. Однократная доза озонированной эмульсии для внутриаматочного введения при эндометрите коровам массой 600 кг не должна превышать 187,2 мл.

клюЧЕВЫЕ СлоВА: рыбий жир, гинодиксин, озонированная эмульсия, антимикробная активность, острая и хроническая токсичность, мыши, острый эндометрит, коровы.

Нарушение воспроизводительной функции у высокопродуктивных коров в настоящее время представляет собой одну из основных проблем дальнейшего развития молочного скотоводства [2] . К главным причинам, вызывающим бесплодие и снижающим темпы воспроизводства стада, относятся послеродовые осложнения, среди которых наиболее чаще диагностируется послеродовой острый эндометрит [1,3,4,9]. Острое воспаление эндометрия у коров, в основном, проявляется при экзогенном инфицировании слизистой оболочки матки условно-патогенной микрофлорой [2, 5]. Известна проблема устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам, которая возникла после начала их широкого применения в ветеринарной практике. Доказано, что стафилококки, стрептококки, эшерихии, шигеллы крайне быстро приобретают лекарственную устойчивость [7]. В связи с чем, актуальность проблемы терапии воспалительных заболеваний матки у коров, часто вызванных полирезистентными штаммами бактерий, не вызы-ва-ет сомнения. Возможными путями ее решения может явиться либо разработка новых антибактериальных препаратов, либо комбинация известных фармакологических средств в новой форме [3,7].

В последние годы в медицине активно развиваются методики по применению медицинского озона, в

ветеринарии же это направление требует дальнейшего совершенствования и представляет собой важную научно-практическую задачу [3,4.8].

цель работы - разработка озонированной эмульсии на основе гинодиксина и рыбьего жира, изучение её острой и хронической токсичности.

Материалы и методы. Исследования проводились в производственной бактериологической лаборатории ЗАО Агрофирма «Дороничи» (г.Киров) и в лаборатории кафедры хирургии, акушерства и заразных болезней Вятской ГСХА.

Эмульсию получали путем смешивания рыбьего жира с разными объемами гинодиксина (производство ЗАО «Росветфарм»), действующими веществами которого являются диоксидин и трекрезан. В литр полученной смеси добавляли 0,5 мл эмульгатора ТВИН, тщательно взбалтывали, и подвергали барбо-тированию озонокислородной смесью посредством керамического распылителя в течение 3-х часов. Для получения озона использовали сертифицированный медицинский генератор озона «А-с-ГОКСф-5-02-О-ЗОН» (МАЮИ 941714.004 ТУ).

Критерием оценки качества озонированной эмульсии служили ее стабильность и высокие антимикробные свойства, которые определяли методом серийных разведений на музейных штаммах ЕБоИепоЫа

coli АТСС № 25922 (F-52) и Staphylococcus aureus АТСС № 25923 (F-49). Для этого, по стандарту мутности, готовили взвесь бактерий на физиологическом растворе с концентрацией от 1х109 до 1х102 микробных тел в миллилитре и смешивали 1:1с приготовленной озонированной эмульсией, перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре, высевали на плотную питательную среду и инкубировали по общепринятой методике, после чего визуально определяли наличие или отсутствие роста культуры.

Оценку токсического действия озонированной эмульсии на организм лабораторных животных проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [6] на здоровых половозрелых белых мышах-самцах, полученных из вивария Вятской ГСХА. Животные перед началом опыта находились на карантине в течение 14 суток. Содержание лабораторных мышей осуществлялось в условиях оптимальных температурного и светового режимов, в клетках по 10 особей в каждой, рацион был у всех одинаковый, к воде и пище имелся свободный доступ.

Для определения острой токсичности животных разделили на 5 групп по 10 в каждой. Предварительно в асептических условиях готовили разведения озонированной эмульсии на стерильном физиологическом растворе натрия хлорида в убывающей концентрации - 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Каждое разведение озонированной эмульсии вводили однократно внутрибрюшинно в общем объеме 0,5 мл на одно животное. Максимальная доза эмульсии при этом

составила 0,25 мл или в пересчете на массу тела мыши - 8000 мг/кг, минимальная доза - 0,06 мл или 2000 мг/кг. Мышам пятой контрольной группы внутрибрюшинно однократно вводили стерильный физиологический раствор натрия хлорида в дозе 0,5 мл. За животными всех групп вели наблюдение в течение 14 суток, в первый день мыши находились под непрерывным наблюдением. Взвешивание мышей проводили до кормления через 1, 3, 7 и 14 сут от начала опыта. Оценку острого токсического действия озонированной эмульсии на организм экспериментальных животных проводили по клинической картине интоксикации и выживаемости животных в зависимости от дозы введенной эмульсии. Общее состояние мышей оценивали по следующим показателям: изменение поведенческих реакций, прием корма и воды, характер фекальных масс, состояние волосяного и кожного покрова, окраска слизистых оболочек, частота дыхательных движений, изменение массы тела. Павших в ходе опыта животных, а также вынужденно убитых вскрывали и оценивали макроскопическую картину их внутренних органов.

Определение хронической токсичности озонированной эмульсии проводили на трех группах белых мышей (п=10) - двух опытных и одной контрольной, сформированных по принципу аналогов (самцы, живая масса 24-29 г.).

Результаты исследований. На первом этапе эксперимента провели оценку антимикробной активности различных вариантов изготовления озонированной эмульсии с учетом её стабильности (табл. 1).

Таблица 1

Величина антимикробной нагрузки озонированной эмульсии при различных соотношениях рыбьего жира и

гинодиксина

Показатель Соотношение рыбьего жира и гинодиксина

1:1 1:1,5 1:2 1:2,5 1:3 1:3,5 1:4 1:4,5 1:5

Escherichia coli 1х106 1X107 1X108 1X108 1X109 1X109 1X109 1X108 1X107

Staph. aureus 1х105 1X1Q6 1x107 1X108 1X109 1X109 1X109 1X107 1X106

Было установлено (табл.1), что наибольшей антибактериальной активностью, при выбранном режиме озонирования обладает эмульсия, в которой соотношение рыбьего жира и гинодиксина составляет от 1:3 до 1:4. При этих вариантах не происходило и расслоения эмульсии. Свежеприготовленная озонированная эмульсия при данном соотношении составных частей эмульсии проявляет максимальные антимикробные свойства и ингибирует рост музейных штаммов при их концентрации 1х109 микробных тел в миллилитре.

Для дальнейших исследований, исходя из антимикробной активности и удобства приготовления, была выбрана озонированная эмульсия, в которой соотношение рыбьего жира и гинодиксина составляло 1:4 (200,0 мл рыбьего жира и 800,0 мл гинодиксина). Ре-

зультаты эксперимента по определению острой токсичности представлены в таблицах 2 и 3.

Однократное внутрибрюшинное введение мышам озонированной эмульсии в максимальной дозе 0,25 мл (8000 мг/кг) вызвало следующую клиническую картину интоксикации (табл. 2), характеризующуюся изменением поведенческих реакций и снижением двигательной активности: через 3-5 минут после введения препарата у всех мышей отмечалось кратковременное возбуждение, переходящее в угнетение, учащение дыхания до 205,6±12,3 дыхательных движений в минуту, взъерошенность шерсти, мыши сидели сгорбившись, глаза полузакрыты, спустя 15-20 минут проявлялся рефлекс умывания. Такое состояние у животных длилось в течение часа, после чего двигательная

ЕГЕПШАРНЫЙ

Врач

Таблица 2

проявления острого токсического действия озонированной эмульсии (п=10)

Количество животных с проявлениями общетоксического действия

Группа Количество эмульсии (разовая доза) снижение массы тела и аппетита изменение поведенческих реакций,снижение двигательной активности учащение дыхания, взъерошивание шерсти не оформленный стул Количество погибших животных

1 0,25 мл (8000 мг/кг) 10 10 10 10 2

2 0,17 мл (6000 мг/кг) 0 0 0 5 0

3 0,10 мл (4000 мг/кг) 0 0 0 0 0

4 0,06 мл (2000 мг/кг) 0 0 0 0 0

5 контрольная группа (физ. раствор) 0 0 0 0 0

Таблица 3

изменение массы тела мышей при однократном введении озонированной эмульсии (п=10)

Группа Количество Масса тела, г

эмульсии исходная через 1 сут через 3 сут через 7сут через 14сут

1 0,25 мл (8000 мг/кг) 29,06+2,66 27,79+2,38 29,75+2,38 29,31+1,23 28,97+1,82

2 0,17 мл (6000 мг/кг) 26,84+2,56 26,59+3,15 28,15+2,94 28,54+1,67 28,18+2,34

3 0,10 мл (4000 мг/кг) 28,50+1,62 28,24+1,89 29,05+2,03 29,56+1,99 29,54+2,02

4 0,06 мл (2000 мг/кг) 27,54+1,41 27,16+1,68 27,41+1,58 28,46+1,72 28,66+1,39

5 Контрольная группа (физ. раствор) 27,31+1,98 27,76+1,67 28,77+2,43 28,32+1,59 28,24+1,75

активность постепенно восстанавливалась. При дальнейшем наблюдении отмечалось незначительное угнетение, снижение массы тела на вторые сутки (табл. 3), отказ от корма, неоформленные каловые массы желтого цвета. Из 10 мышей на вторые сутки погибли две. Через трое суток у остальных мышей масса тела возвращалась к исходной, аппетит и двигательная активность полностью восстановились.

При вскрытии погибших и вынужденно убитых на второй день животных из первой группы у всех отмечалась одинаковая патологоанатомическая картина: сосуды брыжейки переполнены кровью, на капсуле селезенки и печени очаговые неснимающиеся наложения серого цвета, состояние брюшины без патологических изменений. В желудке и тонком кишечнике содержимого не обнаружено, имелось незначительное количество слизи. Признаки воспаления отсутствовали. В толстом отделе кишечника содержалось большое количество каловых масс жидкой консистенции, ин-

тенсивно-желтого цвета, слепая кишка переполнена. Признаков воспалительного процесса также не установлено. Со стороны органов грудной полости патологии не выявлено.

При введении мышам озонированной эмульсии в дозе 0,17 мл (6000 мг/кг) каких-либо изменений в поведении и двигательной активности не происходило. На протяжении последующих двух суток в клетке наряду с нормальными каловыми массами имелось незначительное количество слабо оформленных фекалий желтого цвета. Погибших во второй группе мышей не было. При вскрытии вынуждено убитых животных, изменений со стороны внутренних органов не установлено. У отдельных особей в толстом отделе кишечника - жидкое содержимое желтого цвета.

При внутрибрюшинном введении эмульсии в более низких дозах, а также у мышей в контрольной группе, которым вводили физиологический раствор натрия хлорида, клинических признаков интоксикации и

каких-либо макроскопических изменений со стороны внутренних органов не наблюдалось.

При выборе доз для исследования на хроническую токсичность руководствовались результатами, полученными при определении острой токсичности. Продолжительность введения препарата экспериментальным животным с учетом его предполагаемой длительности применения в клинической практике (2-6 дней) составила 14 суток [6]. Первой опытной группе препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 6000 мг/кг (минимальная токсическая доза), второй группе в дозе 4000 мг/кг (переносимая доза). Третьей группе (контроль) вводили физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Во всех случаях препараты вводили семикратно с интервалом между введениями 1сутки. Наблюдение за лабораторными животными осуществляли в течение всего срока введения, а также 7 суток после последней инъекции. Учитывали все возможные проявления общетоксического действия эмульсии, а также макроскопическую картину внутренних органов.

При длительном введении озонированной эмульсии первой опытной группе мышей, разовая доза которым составляла 6000 мг/кг, изменений в поведении и двигательной активности, а также со стороны кожи и волосяного покрова не наблюдалось. Снижения аппетита и гибели животных не было. Масса тела оставалась стабильной на всем протяжении опыта. В клетке, где содержались опытные мыши, обнаруживали наряду с нормальными каловыми массами слабо оформленные фекалии желтого цвета. У отдельных вынужденно убитых животных на 7-е и 14-е сутки от начала опыта в толстом

отделе кишечника наблюдали умеренное количество жидких каловых масс желтого цвета. Со стороны других внутренних органов грудной и брюшной полостей патологии не выявлено.

Введение препарата в дозе 4000 мг/кг мышам второй опытной не оказало влияния на массу тела животных, на их поведение и двигательную активность. Характер каловых масс, состояние шерстного покрова соответствовали нормативным характеристикам. Макроскопическое исследование внутренних органов не выявило патологических изменений: они были обычными по цвету, консистенции и размерам. Все показатели не отличались от аналогичных у контрольных животных, которым вводили физиологический раствор натрия хлорида.

Заключение. Наибольшей антимикробной активностью, при выбранном режиме барботирования озонокислородной смесью, обладает озонированная эмульсия, полученная путем смешивания 1-ой части рыбьего жира с 3 - 4-мя частями гинодиксина. При парентеральном введении озонированной эмульсии переносимая доза для мышей составила 4000 мг/кг, токсическая доза - 6000 мг/кг, а ЛД20 - 8000 мг/кг. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 озонированная эмульсия относится к 4 классу токсичности и характеризуется как малотоксичная. С учетом коэффициентов межвидового пересчета доз лекарственных препаратов в зависимости от массы тела рекомендуемая разовая доза озонированной эмульсии для клинических испытаний при остром эндометрите у коров составила не более 312 мг/кг, что соответствует 187,2 мл эмульсии для животного с живой массой 600 кг.

Литература

1. Гнётов, А.Н. Фармакотоксикологические свойства и эффективность норадина при профилактике и лечении послеродового эндометрита коров: автореф. дис. ... канд. вет. наук / А.Н.Гнётов. - Воронеж, 2008. - 22 с.

2. Коба, И.С. Этиология и патогенез послеродового эндометрита у коров / И.С.Коба, М.Б.Решетка, М.С.Дубо-викова // Вестник АПК Ставрополля. - 2015. - № 4 (20). - С. 95-98.

3. Конопельцев, И.Г. Озонотерапия и озонопрофилактика воспалительных заболеваний и функциональных расстройств матки у коров: автореф. дис. ... д-ра вет. наук / И.Г.Конопельцев. - Воронеж, 2004. - 40 с.

4. Муравина, Е.С. Разработка и эффективность способа терапии больных послеродовым эндометритом коров с применением озонированной эмульсии: дис. ... канд. вет. наук / Е.С.Муравина. - Воронеж, 2013. - 149 л.

5. Скоморова, М.Н. Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах коров, вызванных условно-патогенной микрофлорой: автореф. дис. ... канд. вет. наук / М.Н.Скоморова. - Новосибирск, 2013. - 20 с.

6. Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У.Хабриев. - М.: Изд-во «Медицина», 2005. - 832 с.

7. Чернов, В.В Фармако-токсикологическая характеристика тетраголда: автореф. дис. ... канд. вет. наук / В.В.Чернов. - Воронеж, 2008. - 22 с.

8. Чучалин, С.Ф. Применение озонированного оливкового масла при послеродовом эндометрите у коров-первотёлок: автореф. дис. ... канд. вет. наук / С.Ф.Чучалин. - Воронеж, 2004. - 20 с.

9. Noakes, David E. Veterinary Reproduction and Obstetrics / David.E.Noakes; еdited by David.E.Noakes, Timothy. J.Parkinson, Gary.C.W. - ninth еdition. - England, 2009 // W.B.Saunders Elsevier. Ltd. - 2009. - P. 407-425, 198-201.

DEVELOPMENT AND EVALUATION OF TOXIC PROPERTIES OF OZONATED EMULSION BASED ON FISH OIL AND GINODIXIN

Blednikh L.V. - Candidate of Veterinary Sciences; Nikolaev S.V. - postgraduate fellow;

Konopeltsev I.G. - Doctor of Veterinary Medicine, professor.

Vyatka State Agricultural Academy, Kirov (tel.: +7(332) 57-43-04, e-mail [email protected]).

Providing the population with dairy products depends on the development of agricultural enterprises with high profitability of milk production and increase of livestock herds and their and productivity. However, one of the main problems is low reproductive ability of cows because of high sickness rate of endometritis caused by different microorganisms in the uterus and their resistance to antimicrobial drugs. Therefore, the aim of this work was to develop an ozonized emulsion based on Ginodixin and fish oil and to study its acute and chronic toxicity. Materials and methods: the development of novel emulsion included the selection of the optimum ratio of fish oil and Ginodixin, saturation of ozone-oxygen mixture, evaluation of antimicrobial properties against Escherichia coli(ATCC No. 25922 (F-52)) and Staphylococcus aureus(ATCC No. 25923 (F-49))in a concentration of from U102 to U109 microbial cells per ml. Ozonized emulsion was evaluated by dividing the counts into acute and chronic toxicity. To evaluate acute toxicity of 0.5 ml of dilution with ozonized emulsion (1:1, 1:2, 1:4, 1:8) was injected intraperitoneally into mature laboratory mice. The maximum dose of the emulsion was 8000 j/kg and the minimum was 2000 j/kg. Acute toxic action of ozonized emulsion was evaluated using experimental animals according to clinical sign of intoxication and survival rate of animals which depended on dosage rate of the injected emulsion. Chronic toxicity of ozonized emulsion evaluated using three groups of mice. Results of investigation: ozonized emulsion showed its maximum antimicrobial activity at content of one part of fish oil with 3 - 4 parts of Ginodixin. A single intraperitoneally introduction of ozonized emulsion at maximal dosage of 8000 j/kg caused intoxication and death in 20% of animals. Dosage of 6000 j/kg induced unformed fecal masses in laboratory animals and dosages of 4000 and 2000 j/kg did not reflected in clinical state of the laboratory mice. Conclusion: at intraparenteral introduction of ozonized emulsion maximal tolerated dose for mice was 4000 j/kg, toxic dose - 6000 j/kg, and LD20 - 8000 j/kg, LD50 more than 1000 j/kg accordingly. Ozonized emulsion consisted from fish oil and ginodixin causes destruction of microorganisms present in uterus at inflammation. According to the State standard 12.1.007-76 the ozonized emulsion belongs to the 4th class of toxicity and is characterized as low-toxic. A single introduction of ozonized emulsion to into uterus of cow endometritis weighing 600 kg at acute endometritis the dosage should not be higher than 187.2 ml.

KEYwORDS: fish oil, Ginodixin, ozonized emulsion, antimicrobial activity, acute and chronic toxicity, mouse acute endometritis, cows.

References

1. Gnyotov,A.N .Farmakotoksicheskiye svoystva i effektivnost noradina pri profilaktike i lechenii poslerodovogo endometrita korov [Noradine pharmacological and toxicological properties and its efficiency to prevent and treat postpartum endometritisin cows]: abstract from dissertation thesis for Candidate of vet. Sciences /A. N. Gnyotov. -Voronezh, 2008. -22 p.

2. Koba, I.S. Etiologiya i patogenez poslerodovogo endometrita u korov [Etiology and pathogenesis of postpartum endometritis in cows] / I.S.Koba, M.B.Reshetka, M.S.Dubovikova // Vestnik APK Stavropolya.- 2015.-№4(20). -P. 95-98.

3. Konopeltsev, I.G. Ozonoterapiya i ozonoprofilaktika vospalitelnyh zabolevaniy i funktsionalnyh rasstroystv matki u korov [Ozone-based therapy and prevention of uterus inflammatory diseases and functional disorders in cows]: abstract from posdoc. dissertation thesis for Doctor vet. medicine /I. G. Konopeltsev.- Voronezh, 2004.-40 p.

4. Muravina, E. S. Razrabotka i effektivnost sposoba terapii bolnyh poslerodovym endometritom korov s primeneniyem ozonirovannoy emulsii [Development and therapeutic efficiency of ozonized emulsion-based method to treat cows with postpartum endometritis]: dissertation thesis for Candidate of vet. Sciences /E. S. Muravina. -Voronezh, 2013. - 149 p.

5. Skomorova, M. N. Terapevticheskaya effektivnost ginodiksina pri endometritah i mastitah korov, vyzvannyh uslovno-patogennoy mikrofloroy [Therapeutic efficacy ginodixineto treatcow endometritis and mastitiscaused by opportunistic pathogenic microflora]: abstract from dissertation thesis for Candidate of vet. Sciences /M. N. Skomarova.- Novosibirsk, 2013.- 20 p.

6. Khabriev, R.U. Rukovodstvo po eksperimentalnomu (doklinicheskomu) izucheniyu novyh farmakologicheskih veschestv [Guideline on experimental (preclinical) studies of novel pharmacological substances] /R. U. Khabriev. -Moscow: "Meditsina", 2005.- 832 p.

7. Chernov, V.V. Farmako-toksikologicheskaya harakteristika tetragolda [Tetragold drug. Pharmacological and toxicological characterization]: abstract from dissertation thesis for Candidate of vet. Sciences / V.V.Chernov. - Voronezh, 2008. - 22 p.

8. Chuchalin, S. F.Primeneniye ozonirovannogo olivkovogo masla pri poslerodovom endometrite u korov-pervotelok [Application of ozonized olive oil in treatment of heifer postpartum endometritis]: abstract from dissertation thesis for Candidate of vet. Sciences / S. F. Chuchalin. - Voronezh, 2004.- 20 p.

8. David, E. Noakes Veterinary reproduction and obstetrics. Ninth edition / edited by. David E. Noakes, Timothy J. Parkinson, Gary C.W. England // W.B.Saunders Elsevier. LTD., 2009. - P. 407-425, 198-201.