CC BY
1010. Карташова О.Л., Норкина А.С., Чайникова И.Н. и др. Фенотипическая характеристика стафилококков и местный иммунитет при бактерионосительстве. Журн. микробиол. 2009, 4: 99-103.
11. Крамарь В.О. Эколого-гигиенические аспекты бактерионосительства стафилококков у детей, проживающих в районах крупного промышленного города с различной антропогенной нагрузкой. Автореф. дис. канд. мед. наук. Волгоград, 2008.
12. Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение. Журн. микробиол. 2011, 1: 101-108.
13. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04). Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2004, 6 (4): 306-359.
14. Прохоров В.Я., Флуер Ф.С., Кудрявцева А.В. и др. Влияние энтеротоксинов Staphylococcus aureus и epidermidis на течение атопического дерматита у детей. Педиатрия. 2009, 2: 43-48.
15. Флуер Ф.С. Стафилококковые энтеротоксины, их свойства и роль в качестве факторов патоген-ности. Журн. микробиол. 2012, 2: 99-108.
16. Шаркова В.А., Лайман Е.Ф. Генетические маркеры патогенности и антибиотикорезистентности штаммов S.epidermidis и S.aureus, изолированных из различных биотопов. Дальневосточный медицинский журнал. 2013, 3: 28-31.
17. Эрдынеева Б.С. Особенности биологического профиля стафилококков в ассоциативном симбиозе носоглоточного биотопа в динамике носительства. Автореф. дис. канд. биол. наук. Иркутск, 2011.
18. Alonzo F., Benson M.A., Chen J. et al. Staphylococcus aureus leukocidin ED contributes to systemic infection by targeting neutrophils and promoting bacterial growth in vivo. Mol. Microbiol. 2012, 83 (2): 423-435.
19. Kluytmans J., van Belkum A., Verbrugh H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin. Microbiol. Rev. 1997, 10 (3): 505-520.
20. Mulcahy M.E., Geoghegan J.A., McLoughlin R.M. et al. Nasal colonisation by Staphylococcus aureus depends upon clumping factor B binding to the squamous epithelial cell envelope protein loricrin. PLoS Pathog. 2012, 8 (12): e1003092.
21. Novick R.P., Geisinger E. Quorum sensing in staphylococci. Anu. Rev. Genet. 2008, 42: 541-564.
22. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 2000, 54: 49-79.
23. van Rijen M.M., Kluytmans J.A. New approaches to prevention of staphylococcal infection in surgery. Curr. Opin. Infect. Dis. 2008, 21 (4): 380-384.
24. Wertheim H.F., Damian C.M., Margreet C.V. et al. The role of nasal carriage in Staphylococcus aureus infections. Lancet Infect. Dis. 2005, 5 (12): 751-762.
25. Wertheim H.F., Walsh E., Choudhurry R. et al. Key role for clumping factor B in Staphylococcus aureus nasal colonization of humans. PloS Med. 2008, 5 (1): 17.
Контактная информация: Карташова О. Л.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, д. 11, р.т. (3532)77-44-63
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Е.А.Щуплова, С.Б.Фадеев, О.В.Бухарин
ВНУТРИЭРИТРОЦИТАРНАЯ ИНВАЗИЯ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI С РАЗЛИЧНЫМ УРОВНЕМ АНТИГЕМОГЛОБИНОВОЙ АКТИВНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург.
Цель. Исследование внутриэритроцитарной инвазии штаммов Escherichia coli с различным уровнем антигемоглобиновой активности на модели генерализованной инфекции. Материалы и методы. Эксперименты проводили на 72 мышах-самцах. Генерализованную инфекцию вызывали внутривенным введением взвеси суточной культуры штаммов E.coli с различными значениями гемолитической (ГА) и антигемоглобиновой (АнтиHbA) активности. Уровень гемоглобина крови животных определяли гемиглобинцианидным методом. Внутриэритроцитарную инвазию E.coli исследовали с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Результаты. Выявлено наибольшее снижение (p<0,05) уровня гемоглобина у животных, инфицированных штаммами Exoli с высоким уровнем АнтиHbA или ГА (58,3±0,6 г/л и 69,7+1,1 г/л). С помощью ЛСКМ было установ-
лено, что микроорганизмы с высоким уровнем АнтиHbA (70±3,4%) чаще, чем с низким (5,5±1,7%), проникали в эритроциты. Заключение. Наибольшая частота выявления бактерий внутри эритроцитов и максимальное снижение уровня гемоглобина крови было отмечено при инфицировании животных штаммами E.coli с высокой антигемоглобиновой активностью.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 40—44
Ключевые слова: эритроциты, Escherichia coli, внутриклеточная инвазия, гемолитическая активность, антигемоглобиновая активность
E.A.Schuplova, S.B.Fadeev, O.V.Bukharin
INTRA-ERYTHROCYTE INVASION OF ESCHERICHIA COLI STRAINS WITH VARIOUS LEVELS OF ANTI-HEMOGLOBIN ACTIVITY IN EXPERIMENT
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Study of intra-erythrocyte invasion of Escherichia coli strains with various levels of anti-hemoglobin activity on a model of generalized infection. Materials and methods. Experiments were carried out on 72 male mice. Generalized infection was induced by intravenous administration of E.coli strain day culture suspension with various values of hemolytic and anti-hemoglobin activity. The levels of hemoglobin in animal blood was determined by hemoglobin-cyanide method. Intra-erythrocyte invasion of E.coli was studied by using laser scanning confocal microscopy (LSCM). Results. The largest decline (p<0.05) of hemoglobin levels was detected in animals, infected with E.coli strains with a high levels of antiHbA and HA (58.3±0.6 g/l and 69.7±1.1 g/l). Using LSCM, microogranisms with a high levels of antiHbA were established to penetrate erythrocytes more frequently (70±3.4%), than with a low (5.5±1.7%). Conclusion. The largest frequency of bacteria detection in erythrocytes and the highest decline of blood hemoglobin levels were noted during infection of animals with E.coli strains with high anti-hemoglobin activity.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 40—44
Key words: erythrocytes, Escherichia coli, intra-cellular invasion, hemolytic activity, anti-hemoglobin activity
ВВЕДЕНИЕ
Одним из типов взаимодействия бактерий с эукариотическими клетками является внутриклеточная персистенция микроорганизмов [11]. Инвазия бактерий в эритроциты как вариант таких взаимодействий описан при некоторых инфекционных процессах [8]. Также известно, что бартонеллы способны к длительной внутриэритроцитарной перси-стенции при бактериемии, приводящей к развитию гемолитической анемии с летальным исходом [10]. Экспериментально установлено, что штаммы Staphylococcus epidermidis, обладающие высокой антигемоглобиновой активностью, способны проникать в эритроциты [1]. Однако механизмы этого явления изучены недостаточно.
Один из важнейших этиологических агентов инфекций кровеносного русла Escherichia coli может обладать гемолитической и антигемоглобиновой активностью [3], однако вопрос о возможности внутриэрицитарной инвазии E. coli и роли указанных свойств в этом процессе остается открытым.
Целью работы явилось исследование внутриэритроцитарной инвазии штаммов E. coli с различным уровнем антигемоглобиновой активности на модели генерализованной инфекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали штаммы E. coli №№ 214-1, 214-18 и 214-23, выделенные из клинического материала, отличающиеся по уровню гемолитической (ГА) и антигемоглобиновой (АнтиНЬА) активности, определенных фотометрическими методами [1, 3].
Эксперименты in vivo проводили на 72 мышах-самцах массой 18 — 20 г с использованием модели генерализованной инфекции [1]. Были выделены 3 опытных и одна контрольная группы животных по 18 особей в каждой. Заражение осуществляли введением в хвостовую вену 0,1 мл взвеси (на 0,9% растворе хлорида натрия) суточной агаровой культуры бактерий в концентрации 85 млн микробных клеток на 1 мл, животным контрольной группы вводили 0,1 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия. Для инфицирования животных первой группы использовали штамм E. coli № 214-1, обладающий высокой АнтиHbA (6,2 г/л) и низкой ГА (26,1% гемолиза), второй группы — штамм E. coli № 214-18 с низкой АнтиHbA (1,7 г/л), но высокой ГА (73,6% гемолиза), для инфицирования животных третьей группы использовали штамм E. coli № 214-23, характеризующийся низкими значениями АнтиHbA (0,5 г/л) и ГА (10,5% гемолиза). При наблюдении за состоянием животных обращали внимание на появление учащенного дыхания, снижения двигательной активности, отказа от еды, повышения температуры тела, избыточного потребления воды, общего вида животного.
Через 24 часа после инфицирования забирали у животных кровь из хвостовой вены для определения уровня гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом [7], выявления бактериемии стандартным бактериологическим методом [5] и для изучения эритроцитов с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ).
Из прижизненно полученных образцов крови подготавливали микропрепараты для ЛСКМ по следующей методике. В пластиковую чашку Петри помещали круглое покровное стекло (диаметр 23 мм), на поверхность стекла наносили 2 мл среды культивирования RMPI-1640 (ООО «Биолот», Россия) и 0,02 мл крови опытного животного, параллельно готовили препарат крови контрольного животного. После инкубации в течение 10 мин при 4°C и осаждения взвеси клеток на покровное стекло из чашки пипеткой удаляли среду культивирования RMPI-1640, добавляли 4% раствор параформальдегида и инкубировали 30 мин при 4°C. После удаления параформальдегида на покровное стекло наносили 1 мл 96% этанола для инкубации при 25°C в течение 7 мин. Затем клетки крови отмывали фосфатно-солевым буфером [4] и обрабатывали специфической сывороткой эшерихиозной группы ОКА (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова), 4 мкл в течение 60 мин при 4°C. После промывания покровного стекла фосфатно-солевым буфером препараты обрабатывали антиглобулиновой сывороткой, меченной флуоресцеин изо-тиоцианатом («Имтек», Россия), 20 мкл в течение 60 мин при 4°C. Для визуализации эритроцитов использовали синьку Эванса. В каждом микропрепарате было исследовано по 10 полей зрения, каждое поле просканировано в 9 параллельных плоскостях, толщина оптического среза 0,36 — 0,37 мкм (микроскоп Axiovert 200M, конфокальная сканирующая приставка LSM510META, Carl Zeiss, Германия). При сравнительной оценке взаимодействия с эритроцитами штаммов бактерий, отличающихся уровнем ГА и АнтиНbA, определяли адгезивную активность кишечной палочки к эритроцитам, долю (процент) микробных клеток, проникших внутрь эритроцита, от общего числа обнаруженных бактерий, а также долю эритроцитов, внутри которых находились микроорганизмы, по отношению к общему числу эритроцитов.
Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке c вычислением средней арифметической и стандартной ошибки. Для установления доказательности различий использовали критерий t Стьюдента, различия считались значимыми при р<0,05 [4].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Через 24 часа после заражения у всех опытных животных появлялись следующие признаки развития генерализованного процесса: снижение двигательной активности, отказ от еды и избыточное потребление воды, учащенное дыхание, повышение температуры тела, шерсть животных была мокрой и взъерошенной. При бактериологическом исследовании крови у всех опытных животных были выделены штаммы E.coli, идентичные по свойствам культурам бактерий, использованным для инфицирования. Состояние животных контрольной группы было идентично изначальному удовлетворительному, ни у одной из контрольных особей не было выявлено бактериемии.
При оценке динамики уровня гемоглобина в крови у животных при экспериментальной инфекции было установлено, что у мышей контрольной группы значения этого показателя (от 90,3±2,0 г/л до 96±2,1 г/л) существенно не отличались от нормы (96 г/л) [6].
У животных третьей группы, инфицированных штаммом с низкими ГА и АнтиНЬА, через 24 часа от начала эксперимента и в последующие сроки наблюдалось незначительное снижение гемоглобина крови (p>0,05). У мышей первой и второй групп, инфицированных штаммами с высокими уровнями АнтиНЬА или ГА, наблюдали существенное снижение уровня гемоглобина через 24 часа и, особенно, через 48 часов (58,3±0,6 г/л и 69,7±1,1 г/л) от начала эксперимента (p<0,05).
Таким образом, наибольшее снижение уровня гемоглобина крови было выявлено у животных, инфицированных штаммами Е.соИ с высоким уровнем АнтиНЬА или ГА.
Для проведения сравнительной оценки взаимодействия с эритроцитами штаммов E. coli, отличающихся уровнем экспрессии ГА и АнтиНЬА, были изучены с помощью ЛСКМ 72 образца крови, полученных из хвостовой вены экспериментальных животных. В образцах крови мышей, зараженных штаммом № 214-1 с высоким уровнем АнтиНЬА (I группа), выявлена адгезия кишечной палочки к поверхности 98,5+0,9% эритроцитов. В крови второй группы животных, зараженных штаммом № 214-18 с низким уровнем АнтиНЬА, адгезия E.coli к эритроцитам наблюдалась реже (р<0,05), в 83,3+2,7% случаях. У мышей третьей опытной группы, зараженных штаммом № 214-23 с низким уровнем как ГА, так и АнтиНЬА, адгезию кишечной палочки на эритроцитах не обнаружили. При исследовании образцов крови контрольной группы животных микробные клетки не были обнаружены.
Полученные результаты демонстрируют, что адгезия бактерий к эритроцитам чаще наблюдалась при инфицировании животных штаммами E. coli с высоким уровнем антиге-моглобиновой активности.
При изучении внутриэритроцитарного расположения кишечной палочки было выявлено, что в образцах крови мышей первой группы, инфицированных E. coli с высокой АнтиНЬА, инвазия бактерий в эритроцит (рис.) наблюдалась в 13 раз чаще, чем при инфицировании животных штаммами с низкой АнтиНЬА и высокой ГА (70+3,4% против 5,5+1,7% пораженных эритроцитов соответственно, р<0,05). Следует отметить, что в образцах крови животных первой группы внутри эритроцитов находилось 15,9+2,6% микробных клеток (от общего количества визуализированных бактерий во всех срезах и плоскостях), а в крови животных второй группы — только 7,2+1,8% (p<0,05). В крови контрольных животных и экспериментальных мышей третьей группы случаев инвазии кишечной палочки внутрь эритроцитов не было обнаружено.
Таким образом, в условиях экспериментальной генерализованной инфекции штаммы E. coli с высоким уровнем антигемоглобиновой активности чаще, чем с низким, выявлялись внутри эритроцитов.
о*
ОТО
опо
Взаимодействие E.coli с эритроцитами. ЛСКМ. Ув. 100. Изображения получены с каналов, детектирующих сигнал от ФИТЦ и синьки Эванса.
Стрелки указывают на сигнал от ФИТЦ в срединных срезах эритроцита, подтверждая внутри-эритроцитарную локализацию E. coli.
ОБСУЖДЕНИЕ
Развитие генерализованного инфекционного процесса подразумевает взаимодействие микроорганизмов не только с иммунокомпетентными клетками крови, но и с эритроцитами. Одним из вариантов взаимодействия эритроцитов с бактериями может быть вну-триэритроцитарная инвазия микроорганизмов [1, 8, 10]. Ранее было показано, что штаммы E. coli проникали внутрь эритроцитов [2], а у детей с гнойно-воспалительными заболеваниями, сопровождавшимися развитием анемии, чаще выделялись возбудители с высоким уровнем антигемоглобиновой активности [2]. Наши исследования подтвердили вышеуказанные результаты и выявили изменения уровня гемоглобина у мышей, зараженных штаммами E. coli с разными показателями ГА и АнтиНЬА. Причем, у животных, инфицированных штаммами Exoli с высоким уровнем АнтиНЬА или ГА, чаще наблюдали внутриэритроцитарную инвазию и большее снижение уровня гемоглобина крови, чем у мышей, зараженных штаммом Exoli с низким уровнем АнтиНЬА и ГА. Возможно, при инвазии в эритроциты наиболее вероятной мишенью E. coli может быть гемоглобин, причем как гемовое железо, так и протеиновая часть гемоглобина [9].
Представленные результаты свидетельствуют, что наряду с гемолитической активностью бактериальных патогенов еще и антигемоглобиновая активность может способствовать снижению уровня гемоглобина крови. Полученные данные расширяют представление о вариантах эритроцитарно-бактериальных взаимодействий при инфекционном процессе [1, 2, 8].
Применительно к условиям экспериментальной инфекции внутриэритроцитарное расположение микроорганизмов может расцениваться как феномен «укрытия» от факторов неспецифической бактерицидной защиты крови макроорганизма. С другой стороны, в клинической практике внутриэритроцитарная инвазия бактерий может способствовать снижению эффективности антибиотикотерапии. В итоге острый инфекционный процесс может принять черты хронического, рецидивирующего заболевания. Вопрос о природе антигемоглобинового фактора и способах его регуляции диктует необходимость продолжения исследований в этом направлении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Стадников А.А., Усвяцов Б.Я., Ханина Е.А. Особенности взаимодействия бактерий с эритроцитами и их роль в развитии инфекционной анемии. Журн. микробиол. 2006, 4: 25-28.
2. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Щуплова Е.А. Антигемоглобиновая активность бактерий при взаимодействии с эритроцитами и ее роль в патогенезе анемии при инфекции. Гематол. и трансфузи-ол. 2011, 56 (1): 3-6.
3. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Ханина Е.А. Определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов. Патент России № 2262705, 2005, Бюл.19.
4. Ланг ТА., Сесик М. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов. Пер. с англ. под ред. В.П. Леонова. М., Практическая медицина, 2011.
5. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II. Под ред. Лабинской А.С. М., БИНОМ, 2012.
6. Сахаров П.П. Лабораторные животные их болезни, некоторые биологические особенности и зоотехнические основы содержания, кормления и разведения. Гос. изд-во биологической и медицинской литературы. М.-Л., 1937.
7. Смирнов И.В., Контуганов Н.Н., Майорова В.В. Инструкция по применению набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом. М., Агат-Мед, 2000.
8. Федорова В.А., Девдариани З.Л. Механизм взаимодействия Yersinia pestis с эритроцитами и его значение для патогенеза чумы. Вестник РАМН. 2007, 1: 13-21.
9. Щуплова Е.А., Фадеев С.Б. Спектральный анализ гемоглобина под действием микроорганизмов с разным уровнем антигемоглобиновой активности. Современные проблемы науки и образования. 2013, 2; URL: www.science-education.ru/108-8791.
10. Dechio C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction. Cell Microbiol. 2008, 10 (8): 1591-1598.
11. Kerrn M. B. et al. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. J. Antimicrobial Chemotherapy. 2005, 55: 383-386.
Контактная информация: Щуплова Е.А.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
