CC BY
20
ЭЛЕКТРОННЫЙ ЖУРНАЛ
Оп-1 I пе версия жу рнала на сайте
http://www.elmag.uran.ru
ОРЕНБУРГСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН
Ьуеаепа ШегБатоп (ЕБрег, 1784) Червонец блестящий Шовкун Д.Ф.
»
ОРЕНБУРГСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УрО РАН
© О.А. Гоголева, Е.А. Щуплова, 2019 УДК 579.873.2:579.84:576.851.252.616 О.А. Гоголева, Е.А. Щуплова
ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS И ESCHERICHIA COLI
Оренбургский федеральный исследовательский центр УрО РАН (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН), Оренбург, Россия
Цель. Изучить влияние супернатантов Mycobacterium iranicum и M. rutilum на биологические свойства Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli.
Материалы и методы. В работе использовали музейные штаммы нетуберкулезных микобактерий Mycobacterium iranicum, M. rutilum и условно-патогенных бактерий Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli. С использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации изучали процессы адгезии к поверхности эритроцитов и внутриэритроци-тарное проникновение клеток S. epidermidis и E. coli под влиянием супернатантов НТМБ. Для исследований изменений в молекуле гемоглобина под действием супернатантов НТМБ применяли спектральный анализ. Статистическую обработку проводили с помощью STATISTIKA 6.0.
Результаты. Супернатанты М. iranicum и M. rutilum в 3-4 раза повышали адгезию к поверхности эритроцитов клеток условно-патогенных бактерий с низким уровнем АнтиНЬА, а также усиливали внутриэритроцитарное проникновение клеток S. epidermidis и E. coli относительно контрольных значений. В результате изучения спектра гемоглобина эритроцитов под влиянием M. iranicum отмечено снижение значений оптической плотности оксигемоглобина в 2 раза относительно значений в контрольной пробе.
Заключение. Нетуберкулезные микобактерии оказывают разнонаправленное влияние на процессы взаимодействия клеток S. epidermidis и E. coli с эритроцитами, усиливая адгезивную активность, проникновение клеток внутрь эритроцитов, а также снижая значения оптической плотности оксигемоглобина.
Ключевые слова: нетуберкулезные микобактерии, условно-патогенные микроорганизмы, эритроциты, адгезия, проникновение в эритроциты, гемоглобин.
O.A. Gogoleva, E.A. Shchuplova.
THE EFFECT OF SUPERNATANTS OF NON-TUBERCULOUS MYCOBACTERIA ON THE BIOLOGICAL PROPERTIES OF STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS AND ESCTERICHIA COLI.
Orenburg Federal Research Сenter, UB RAS (Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, UB RAS), Orenburg, Russia
Objective. To study the effect of the supernatants Mycobacterium iranicum and M. rutilum on the biological properties of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli.
Materials and methods. The work used museum strains Mycobacterium iranicum, M. rutilum, as well as museum strains of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli. The processes of adhesion to the surface of erythrocytes and intra-erythrocyte penetration of S. epidermidis and E. coli cells under the influence of ntmb supernatants were studied using the method of fluorescent in situ hybridization. Spectral analysis was used to study changes in the hemoglobin molecule under the action of ntmb supernatants. Statistical processing was performed using STATISTIKA 6.0.
Results. The supernatants of M. iranicum and M. rutilum 3-4 times increased adhesion to the surface of red blood cells of cells of conditionally pathogenic bacteria with low АнтиHbA, as well as increased penetration of erythrocytes of the cells of S. epidermidis and E. coli relative to control values. As a result of the study of the spectrum of hemoglobin under the influence of M. iranicum observed decrease in the optical density of oxyhemoglobin in 2 times relative to the values in the control sample.
Conclusion. Non-tuberculosis mycobacteria have a multidirectional effect on the processes of interaction of S. epidermidis and E. coli cells with erythrocytes, increasing adhesive activity, penetration of cells into erythrocytes, as well as reducing the optical density of oxyhemoglobin.
Key words: Non-tuberculosis mycobacteria, opportunistic microorganisms, erythrocytes, adhesion, erythrocyte penetration, hemoglobin.
Введение
Долгое время нетуберкулезные микобактерии (НТМБ) считались типичными сапрофитами, не представляющими опасности для здоровья человека. Впервые о микобактериозах заговорили в 1954 г., когда A. Timpe и E. Runyon, выделили от больных большое количество атипичных кислотоустойчивых бактерий [1], и в классификации болезней человека появился микобактериоз.
В настоящее время во всём мире отмечается рост пациентов с подтверждённым диагнозом микобактериоз, что связано с совершенствованием методов диагностики и идентификации микобактерий, а также с увеличением больных с поражениями иммунной системы и хроническими заболеваниями лёгких [2-4]. В последнее время всё чаще описывают случаи заболеваний, вызванных микобактерией M. iranicum, которая недавно была признана оппортунистическим патогеном человека [5-7].
Взаимодействия НТМБ с макроорганизмом и его микрофлорой практически не изучены, однако с увеличением заболеваний микобактериозами исследования данных взаимодействий приобретают особую значимость.
Цель работы - изучить влияние супернатантов Mycobacterium iranicum и M. rutilum на биологические свойства Staphylococcus epidermidis и Esche-richia coli.
Материалы и методы
В работе использовали музейные штаммы нетуберкулезных микобак-терий Mycobacterium iranicum и Mycobacterium rutilum, которые были выделены из природных вод. Указанные микроорганизмы и музейные штаммы условно-патогенных бактерий (Staphylococcus epidermidis №№7 и 13, а также Escherichia coli №№1 и 18) предоставлены лабораторией микробной эколо-
гии и дисбиозов ИКВС УрО РАН. Изоляты условно-патогенных бактерий отличались уровнем антигемоглобиновой активности (АнтиНЬА) - штаммы S. epidermidis 7 и E. coli 1 характеризовались высокими значениями АнтиНЬА (15,7 и 8,9 г/л соответственно), тогда как S. epidermidis 13 и E. coli 18 - низким уровнем АнтиНЬА (2,0 и 0,7 г/л соответственно). Уровень антигемоглобиновой активности определяли по методике Бухарина О.В. с соавт. [8].
У исследуемых клеток S. epidermidis и E. coli изучали процессы адгезии к поверхности эритроцитов и внутриэритроцитарное проникновение под влиянием супернатантов НТМБ по методу Е.А. Щупловой с соавт. [9]. При изучении процессов адгезии и внутриэритроцитарного проникновения использовали эритроцитарную взвесь донора (I) группы, приобретенную на ГБУЗ «Оренбургской областной клинической станции переливания крови».
Изменения спектра молекулы гемоглобина под действием супернатан-тов нетуберкулезных микобактерий исследовали по методу, описанному в работе Е.А. Щупловой, С.Б. Фадеева [10]. Статистическую обработку проводили с помощью программы STATISTIKA 6.0. Для установления доказательности различий (р) использовали критерий значимости (t) Стьюдента; различия считались значимыми (достоверными) при р<0,05.
Результаты и обсуждение
На модели «эритроциты - бактерии» нами изучено влияние суперна-тантов M. iranicum и M. rutilum на процессы адгезии к поверхности эритроцитов клеток S. epidermidis и E. coli. Результаты проанализированы и отображены на рисунках 1 и 2.
Как видно из рисунка 1, под воздействием супернатанта M. iranicum через 24 ч инкубации у штаммов с низким уровнем антигемоглобиновой активности (S. epidermidis 13 и E. coli 18) наблюдали усиление адгезии к поверхности эритроцитов относительно контрольных значений в 3,6 раза и 4,0 соответственно (при р<0,05).
У штаммов с высоким уровнем АнтиНЬА под действием супернатанта M. iranicum изменения в процессах адгезии были менее выражены, по сравнению со штаммами с низким уровнем АнтиНЬА. Усиление адгезии наблюдалось только у S. epidermidis 7 через 3 и 24 часа инкубации адгезия увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с контрольными значениями. У штамма E. coli 1 показатели адгезии не отличались от контрольных значений.
35 30 25 20 15 10 5 0
S.epidermidis 7 S.epidermidis 13
E.coli 1
E.coli 18
□ опыт 3 Ч
I контроль Зч □ опыт 24 ч И контроль 24ч
Примечание: * - р<0,05. Рис. 1. Влияние супернатанта Mycobacterium iranicum на процессы адгезии к поверхности эритроцитов клеток S. epidermidis и E. coli.
%
35
30
25
20
15
10
S.epidermidis 7 S.epidermidis 13 E.coli 1 E.coli 18
EI опыт Зч El контроль 3 ч □ опыт 24 ч И контроль 24ч
Примечание: * - р<0,05. Рис. 2. Влияние супернатанта Mycobacterium rutilum на процессы адгезии к поверхности эритроцитов клеток S. epidermidis и E. coli.
Под действием супернатанта M. rutilum через 3 ч инкубации усиление процесса адгезии к поверхности эритроцитов наблюдали только у клеток S.
*
*
*
*
epidermidis 13 в 2,3 раза относительно контрольных значений. У остальных исследуемых микроорганизмов, не зависимо от уровня антигемоглобиновой активности, через 3 ч инкубации наблюдали подавление адгезии. Через 24 ч культивирования штаммов S. epidermidis 7 и 13 под влиянием супернатанта M. rutilum происходило увеличение процента адгезированных клеток соответственно в 2,0 и 2,7 раза относительно контрольных значений (рис. 2).
При исследовании влияния супернатанта M. rutilum на способность к адгезии у клеток E. coli, в варианте со штаммом с низким уровнем ArnrcHbA (E. coli 18) через 24 ч инкубации наблюдали увеличение адгезированных клеток на поверхности эритроцитов в 4,2 раза относительно контроля, а у штамма с высоким уровнем АнтиHbA (E. coli 1) значения адгезии были сопоставимы с контрольными.
В настоящее время в связи с ростом заболеваний, вызванных НТМБ, интерес представляют исследования, направленные на изучение взаимодействий НТМБ с нормофлорой. Исследования, проведённые в данной работе, показали, что супернатанты НТМБ увеличивают адгезию клеток условно-патогенных бактерий с низким уровнем AffrnHbA к поверхности эритроцитов. На штаммы с высоким уровнем ArnrcHbA влияние супернатантов НТМБ различно - в варианте с клетками S. epidermidis 7 адгезия к поверхности эритроцитов увеличивалась, а в варианте с E. coli 1 - снижалась. Такое разнонаправленное действие НТМБ на колонизацию и адгезию в присутствии гемоглобина отмечалось ранее в работе Т.В. Полюдовой с соавт. [11].
На следующем этапе нами было изучено влияние супернатантов M. iranicum и M. rutilum на проникновение клеток S. epidermidis 7, 13 и E. coli 1, 18 в эритроциты (табл. 1).
Таблица 1. Влияние супернатантов Mycobacteria iranicum и M. rutilum на проникновение клеток Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli в эритроциты
Контроль M. iranicum M. rutilum
24 ч (у.е.) 3 ч (у.е.) 24 ч (у.е.) 3 ч (Уе) 24 ч (у.е.)
S. epidermidis 7 1 2 8 4 10
S. epidermidis 13 1 0 9 6 7
E. coli 1 1 0 5 0 3
E. coli 18 1 4 7 2 6
Под действием супернатантов НТМБ наблюдали усиление проникновения клеток по сравнению с контрольными значениями.
В варианте с клетками штаммов S. epidermidis как с высоким, так и низким уровнем АнтиНЬА увеличение внутриэритроцитарного проникновения наблюдали под влиянием супернатанта M. rutilum. Под действием супер-натанта M. iranicum на штаммы S. epidermidis усиление проникновения в эритроциты наблюдали только через 24 ч инкубации.
При сокультивировании клеток E. coli 18 (штамм с низким уровнем АнтиНЬА) под влиянием супернатанта M. iranicum наблюдали более интенсивное внутриэритроцитарное проникновение клеток через 3 и 24 часа, чем при воздействии супернатанта M. rutilum. В варианте со штаммом с высоким уровнем АнтиНЬА (E. coli 1) через 3 часа не наблюдали проникновение клеток в эритроциты как под воздействием супернатанта M. iranicum, так и при влиянии супернатанта M. rutilum. Через 24 часа воздействия супернатантов НТМБ на клетки штамма E. coli 1 увеличение внутриэритроцитарного проникновения клеток наблюдали под влиянием M. iranicum, а в варианте с су-пернатантом M. rutilum значения были сопоставимы с контрольными.
По данным литературы известно, что многие микроорганизмы способны к проникновению в эритроциты, например, Bartonella bacilliformis [12], Streptococcus pneumoniaе [13], Staphylococcus epidermidis [14], а также описаны механизмы их проникновения [15]. При проникновении бактерий в клетки, неспособные к фагоцитозу, по механизму застежки-молнии (zipper) наблюдается тесное связывание бактерий с мембраной клетки-хозяина и дальнейшее ее скольжение по мембране, которое заканчивается формированием вакуоли, переносящей бактерию внутрь клетки. Такое проникновение характерно для исследуемых микроорганизмов - S. epidermidis и E. coli.
В проведённом исследовании отмечено, что к 24 ч инкубации происходило усиление внутриэритроцитарного проникновения исследуемых штаммов S. epidermidis и E. coli с низким уровнем АнтиНЬА под действием супер-натантов НТМБ. В вариантах со штаммами бактерий с высоким уровнем Ан-тиНЬА, наблюдалось усиление проникновения в эритроциты S. epidermidis под воздействием супернатантов НТМБ. В опыте со штаммом E. coli 1 увеличение внутриэритроцитарного проникновения клеток наблюдали под влиянием M. iranicum через 24 часа воздействия, а при влиянии супернатанта M. rutilum значения не отличались от контрольных.
Известно, что гемоглобин эритроцитов имеет несколько форм: окси-, карбокси-, дезокси-, метгемоглобин и др., которые отличаются функциональными свойствами [16]. Среди них наиболее показательными для нашего исследования являются значения оксигемоглобина. Спектр оксигемоглобина характеризуется наличием двух полос поглощения - максимум а-полосы находится в области длин волн 575-579 нм, максимум Р-полосы - 540-544 нм, что характерно для группы гемма [17].
В результате изучения спектра гемоглобина эритроцитов под влиянием супернатантов исследуемых НТМБ, отмечено, что под действием M. iranicum происходило снижение оптической плотности спектра оксигемоглобина в 2 раза относительно значений в контрольной пробе (при длине волны 540 нм и 576 нм). Под действием M. rutilum также наблюдали снижение значений оптической плотности относительно контроля, но не такое значительное как в случае с M. iranicum. Возможно, полученные данные связаны с наличием у микобактерий сидерофоров, способствующих захвату железа из гемоглобина [18], что позволяет им конкурировать с другими микроорганизмами по захвату гемового железа и со временем может приводить к развитию гипоксии в организме человека. Заключение
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что нетуберкулезные микобактерии, попадая из окружающей среды в организм человека, способны взаимодействовать с нормофлорой, оказывая влияние на ее биологические свойства. При этом отмечено разнонаправленное влияние НТМБ на процессы взаимодействия условно-патогенных микроорганизмов с эритроцитами, при котором может наблюдаться усиление адгезивной активности, проникновения клеток внутрь эритроцитов, а также снижение значений оптической плотности оксигемоглобина.
ЛИТЕРАТУРА
1 Timpe A., Runyon E.H. The relationship of «atypical» acid-fast bacteria to human disease; a preliminary report. J Lab Clin Med. 1954: 2: 202-209.
2 Prevots D.R., Loddenkemper R., Sotgiu G., Migliori G.B. Nontuberculous mycobacterial burden with substantial costs. Eur Respir J. 2017: 49: 4: pii: 1700374.
3 Winthrop K.L., Baxter R., Liu L. et al. Mycobacterial diseases and antitumour necrosis factor therapy in USA. Ann Rheum Dis. 2013: 72(1): 37-42.
4 Andrejak C., Nielsen R., Thomsen V. et al. Chronic respiratory disease, inhaled corticosteroids and risk of non-tuberculous mycobacteriosis. Thorax. 2013: 68(3): 256-262.
5 Varghese B, Enani M, Shoukri M, Al Thawadi S, Al Johani S, Al-Hajoj S. Emergence of Rare
Species of Nontuberculous Mycobacteria as Potential Pathogens in Saudi Arabian Clinical Setting. PLoS Negl Trop Dis. 2017: 11(1): DOI: 10.1371/journal.pntd.0005288.
6 Ruiz-Garcia М., Parra Grande M., Zamora M.L., Gonzalo J.N. First male's Mycobaterium iranicum clinical isolation in Spain. Rev Esp Quimioter. 2018: 31(2): 170-172.
7 Lapierre S.G., Toro A., Drancourt M. Mycobacterium iranicum bacteremia and hemophago-cytic lymphohistiocytosis: a case report. BMC Res Notes. 2017: 10: 372 (doi: 10.1186/s 13104-017-2684-8).
8 Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Ханина Е.А. Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов. Патент РФ № 2262705. 2005. Бюл. №19.
9 Щуплова Е.А., Черкасов С.В., Плотников А.О. Применение метода FISH для выявления бактерий, локализованных на поверхности и внутри эритроцитов. Клиническая лабораторная диагностика. 2017. 7 (62): 431-435.
10 Щуплова Е.А., Фадеев С.Б. Спектральный анализ гемоглобина под действием микроорганизмов с разным уровнем антигемоглобиновой активности. Современные проблемы науки и образования. 2013: 2 (URL: www.science-education.ru/108-8791).
11 Юркина Н.О., Ерошенко Д.В., Коробов В.П., Полюдова Т.В. Влияние компонентов крови на адгезионную активность нетуберкулезных микобактерий. Вестник ОГУ. 2017: 9: 85-90.
12 Dechio C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction. Cell Microbiol. 2008: 10(8): 1591-1598.
13 Yamaguchi M. Streptococcus pneumoniae invades erythrocytes and utilizes them to evade human innate immunity. PLoS One. 2013: 8: 77282.
14 Щуплова Е.А., Стадников А.А., Фадеев С.Б. Роль биологических свойств Staphylococcus epidermidis во внутриэритроцитарной инвазии и изменении активности каталазы и супе-роксиддисмутазы эритроцитов при экспериментальной генерализованной инфекции. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015: 159 (1): 79-82.
15 Розов С.М., Дейнеко Е.В. Бактериальные внутриклеточные патогены: стратегии нападения и защиты. Успехи современной биологии. 2015: 135(5): 464-479.
16 Зинчук В.В., Гацура С.В., Глуткина Н.В. Коррекция кислородтранспортной функции крови при патологии сердечно-сосудистой системы. Гродно: ГрГМУ, 2016. 312с.
17 Кочубей В.И. Определение концентрации веществ при помощи спектрофотометрии. Руководство к лабораторной работе. Саратов. 2008.
18 Лямин А.В., Халиулин А.В., Исматуллин Д.Д., Козлов А.В., Балдина О.А. Железо как эссенциальный фактор роста микобактерий. Известия Самарского научного центра РАН. 2016: 18: 5(2).
Поступила 24 июня 2019 г.
(Контактная информация: Щуплова Елена Алексеевна - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории микробной экологии и дисбиозов Института клеточного и
внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11;
тел. 8 (3532) 77-54-17; e-mail: Khanina83@yandex.ru)
LITERATURA
1. Timpe A., Runyon E.H. The relationship of «atypical» acid-fast bacteria to human disease; a preliminary report. J Lab Clin Med. 1954: 2: 202-209.
2. Prevots D.R., Loddenkemper R., Sotgiu G., Migliori G.B. Nontuberculous mycobacterial burden with substantial costs. Eur Respir J. 2017: 49: 4: pii: 1700374.
3. Winthrop K.L., Baxter R., Liu L. et al. Mycobacterial diseases and antitumour necrosis factor therapy in USA. Ann Rheum Dis. 2013: 72(1): 37-42.
4. Andrejak C., Nielsen R., Thomsen V. et al. Chronic respiratory disease, inhaled corticoster-
oids and risk of non-tuberculous mycobacteriosis. Thorax. 2013: 68(3): 256-262.
5. Varghese B, Enani M, Shoukri M, Al Thawadi S, Al Johani S, Al-Hajoj S. Emergence of Rare Species of Nontuberculous Mycobacteria as Potential Pathogens in Saudi Arabian Clinical Setting. PLoS Negl Trop Dis. 2017: 11(1): DOI: 10.1371/journal.pntd.0005288.
6. Ruiz-Garcia М., Parra Grande M., Zamora M.L., Gonzalo J.N. First male's Mycobaterium iranicum clinical isolation in Spain. Rev Esp Quimioter. 2018: 31(2): 170-172.
7. Lapierre S.G., Toro A., Drancourt M. Mycobacterium iranicum bacteremia and hemophago-cytic lymphohistiocytosis: a case report. BMC Res Notes. 2017: 10: 372 (doi: 10.1186/s 13104-017-2684-8).
8. Bukharin OV, Usvyatsov B.Ya., Khanina EA. A method for determining the antihemoglobin activity of microorganisms. RF patent No. 2262705. 2005. Bull. No. 19.
9. Schuplova EA, Cherkasov SV, Plotnikov A.O. Application of the FISH method for the detection of bacteria localized on the surface and inside of red blood cells. Clinical laboratory diagnostics. 2017.7 (62): 431-435.
10. Schuplova EA, Fadeev S.B. Spectral analysis of hemoglobin under the influence of microorganisms with different levels of antihemoglobin activity. Modern problems of science and education. 2013: 2 (URL: www.science-education.ru/108-8791).
11. Yurkina N.O., Eroshenko D.V., Korobov V.P., Polyudova T.V. The effect of blood components on the adhesive activity of non-tuberculous mycobacteria. Bulletin of OSU. 2017: 9: 85-90.
12. Dechio C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction. Cell Microbiol. 2008: 10(8): 1591-1598.
13. Yamaguchi M. Streptococcus pneumoniae invades erythrocytes and utilizes them to evade human innate immunity. PLoS One. 2013: 8: 77282.
14. Schuplova EA, Stadnikov AA, Fadeev S.B. The role of the biological properties of Staphylococcus epidermidis in intraerythrocytic invasion and changes in the activity of erythrocyte cat-alase and superoxide dismutase in experimental generalized infections. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2015: 159 (1): 79-82.
15. Rozov S.M., Deineko E.V. Bacterial intracellular pathogens: attack and defense strategies. Successes of modern biology. 2015: 135 (5): 464-479.
16. Zinchuk V.V., Gatsura S.V., Glutkina N.V. Correction of the oxygen transport function of the blood in the pathology of the cardiovascular system. Grodno: State State Medical University, 2016. 312p.
17. Kochubey V.I. Determination of the concentration of substances using spectrophotometry. Manual for laboratory work. Saratov. 2008.
18. Lyamin A.V., Khaliulin A.V., Ismatullin D.D., Kozlov A.V., Baldina O.A. Iron as an essential growth factor for mycobacteria. Bulletin of the Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences. 2016: 18: 5 (2).
Образец ссылки на статью:
Гоголева О.А., Щуплова Е.А. Влияние супернатантов нетуберкулезных микобактерий на
биологические свойства Staphylococcus epidermidis и Escherichia coli. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2019. 3. 8с. [Электр. ресурс] (URL:
http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2019-3/Articles/GOA-2019-3.pdf).
DOI: 10.24411/2304-9081-2019-13004
