CC BY
23
УДК: 579.61; 579.62
Полюдова Т.В.1, 2, Юркина Н.О.3, Ерошенко Д.В.1, 3, Коробов В.П.13
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г Пермь, Россия 2 Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. академика Прянишникова, г. Пермь, Россия 3 Пермский национальный исследовательский политехнический университет, г. Пермь, Россия E-mail: dasha.eroshenko@gmail.com; poludova@iegm.ru; optimistka-01@mail.ru
ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ КРОВИ НА АДГЕЗИОННУЮ АКТИВНОСТЬ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ
В настоящее время все чаще у людей со сниженной иммунной компетентностью диагностируются заболевания, вызванные нетуберкулезными видами микобактерий (НТМБ). Наиболее распространенной формой заболеваний, связанных с НТМБ, являются инфекции, вызванные образованием биопленок на поверхности долговременных медицинских устройств. Однако, механизмы адгезии НТМБ на абиотических поверхностях при контакте с внутренними средами организма до сих пор остаются неясными.
Изучено влияние плазмы и гемоглобина крови человека, бычьей фетальной сыворотки (ФБС), сывороточного альбумина (БСА), фибронектина, ДНК, а также лизоцима и лактоферрина на адгезию Mycobacterium smegmatis mc2 155, M. smegmatis ГИСК 607, M. avium ГИСК 168 к полистиролу. Результаты показали, что присутствие в среде плазмы (10%), сыворотки (10%), альбумина (0,5 мг/мл), лизоцима (0,1 мг/мл) и лактоферрина (0,1 мг/мл) существенно снижали количество закрепленных на полистироле клеток микобактерий всех исследованных штаммов. Наибольший эффект подавления адгезионной активности микобактерий был выявлен в присутствии БСА и ФБС. Внесение ДНК крупного рогатого скота (0,5 мг/мл) в среду инкубации также приводило к значительному снижению количества закрепленных на полистироле бактерий. Однако, внесение в среду фибронектина (2,5 мкг/мл) и гемоглобина выявило гетерогенность среди НТМБ по способности связываться с поверхностью полистирола. Так, адгезия M. smegmatis ГИСК 607 и M. avium ГИСК 168 усиливалась в присутствии фибронектина и не изменялась для бактерий M. smegmatis mc2 155. Гемоглобин оказывал как ингибирующее (M. smegmatis mc2 155 и M. avium ГИСК 168), так и стимулирующее (M. smegmatis ГИСК 607) действие на адгезию НТМБ.
Выявленные данные о влиянии компонентов крови на прикрепление НТМБ к абиотической поверхности позволяют косвенно судить о процессах образования биопленок в условиях in vivo.
Ключевые слова: адгезия, альбумин, ДНК, нетуберкулезные микобактерии, сыворотка крови.
Микобактерии широко распространены в природе, часто встречаются в воде и почве. Долгое время считалось, что нетуберкулезные виды микобактерий (НТМБ) являются типичными сапрофитами. Однако в настоящее время все чаще диагностируются заболевания, вызванные бактериями этой группы [1], [2]. Есть предположение, что заражение человека и животных нетуберкулезными микобактериями происходит из окружающей среды. При этом НТМБ, содержащиеся в пылевых частицах воздуха и аэрозолях над природными водоемами могут играть важную роль в возникновении респираторных заболеваний. Источником распространения НТМБ является почва [3]. Представители НТМБ часто встречаются в водных источниках, бассейнах, а также в питьевой воде [2], [4]. Вследствие их, практически, повсеместного распространения, контакты человека и животных с представителями НТМБ неизбежны. Довольно часто происходит инфицирование этими бактериями
людей, входящих в определенные группы риска. К ним относятся люди со сниженной иммунной компетентностью в результате ВИЧ-инфекции, химиотерапии или иммуносупрессии, связанной с трансплантацией и ранее перенесенными заболеваниями легких.
Особенности строения наружных оболочек клеток микобактерий дает им дополнительные преимущества для выживания в агрессивных средах. Миколовые кислоты, окружающие клетки определяют их гидрофобность, слабую проницаемость и замедленный рост. В то же время, высокая гидрофобность способствует прикреплению к поверхностям и устойчивости к дезинфицирующим средствам и антибиотикам. Способность НТМБ формировать биопленки [5] имеет принципиальное значение для их успешного выживания в окружающей среде. Эта свойство также является ведущим фактором, способствующим патогенезу инфекций, связанных с долговременными медицинскими
устройствами (катетеры, имплантаты). Катетер-ассоциированные инфекции являются наиболее распространенной формой заболеваний, связанных с микобактериями [6], [7].
Инфекции, вызываемые НТМБ, имеют общее название - микобактериозы, и развиваются они в ослабленном организме. Известно, что для успешной колонизации тех или иных ниш, бактерии используют различные механизмы закрепления клеток на твердых поверхностях. Вместе с тем, в научной литературе практически отсутствуют данные, касающиеся механизмов адгезии НТМБ на абиотических поверхностях при контакте с внутренними средами организма человека или животных. В условиях in vivo непосредственное взаимодействие между бактериями и потенциально колонизируемой ими абиотической поверхностью играет минимальную роль, так как после контакта с кровью поверхность субстрата почти мгновенно покрывается белками сыворотки или тканей [8], [9]. В других природных средах бактерии, также прикрепляются, не непосредственно к субстрату, а к слою адсорбированных на его поверхности молекул, так называемой «кондиционной пленке». Кондиционная пленка из ионов, мономеров или полимеров изменяет свойства поверхностей и определяет степень бактериальной адгезии.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния некоторых компонентов крови человека и животных на адгезию НТМБ к полистиролу.
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали штаммы бактерий Mycobacterium smeg-matis mc2 155,M. smegmatis ГИСК 607,M. avium ГИСК 168. Выращивание бактерий проводили в колбах на питательной среде Luria-Bertani (LB) при перемешивании на шейкере при 150 об/мин и температуре 37°С в течение 40-48 ч. Культивирование микобактерий на жидкой среде LB сопровождалось образованием агрегатов клеток, для гомогенизирования которых применяли встряхивание на Multi Vortex V-32 в течение 15-20 мин с добавлением к культуре твина 60 до концентрации 0,1%. Затем готовили суспензию бактерий в свежей среде LB с оптической плотностью 0,15 при длине волны 600 нм (PD-303, "Apel", Япония). После чего полученные
суспензии разводили в 10 раз этой же питательной средой. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) в полученных суспензиях соответствовало 1-1,5 х 108 КОЕ/мл.
Исследовали количественные показатели адгезии бактериальных клеток на поверхности полистироловых чашек Петри диаметром 40 мм («Медполимер», Санкт- Петербург).
Для исследования влияния компонентов крови в чашки Петри вносили по 200 мкл следующих растворов: бычий сывороточный альбумин (5 мг/мл, БСА, «Sigma»), гемоглобин (0,5 мг/мл), ДНК из селезенки крупного рогатого скота (5 мг/мл, «Олайнский завод хим-реактивов»), лактоферрин (1 мг/мл, «Sigma»), лизоцим из яичного белка (1 мг/мл, «Реахим»), плазмы крови человека, фетальной бычьей сыворотки («Биолот») и фибронектин (25 мкг/мл, «Sigma»). Гемоглобин получали из донорской крови путем гемолиза осадка эритроцитов в воде. Концентрацию гемоглобина определяли гемиглобиназидным методом [10]. Для получения плазмы цельную кровь здоровых доноров собирали в пробирки с ЭДТА («Improvacuter», Китай) и форменные элементы крови отделяли центрифугированием (3500g, 5 мин, 5415R, «Eppendorf»). Надосадочную жидкость использовали для эксперимента. После внесения исследуемых растворов в чашки Петри вносили по 1,8 мл приготовленной бактериальной суспензии. Инкубацию проводили в термостате при 37оС в течение 30 мин. По окончании инкубации удаляли жидкость с несвязавшимися клетками и чашки Петри трижды промывали бидисти-лированной водой. Количество сорбированных клеток оценивали с помощью микровизора ^Viso-103 («Ломо») после окрашивания 0,1%-ным раствором кристаллического фиолетового, просматривая не менее 10 полей зрения в каждой чашке при увеличении х1000 раз. Подсчет количества бактерий в скоплениях клеток производили при увеличении х2000. Высчитывали среднее значение количества закрепленных бактерий в поле зрения микроскопа.
Результаты исследований
Результаты проведенных нами экспериментов показали, что из трех исследованных штаммов НТМБ бактерии M. smegmatis ГИСК 607 обладали наименьшей адгезионной актив-
Полюдова Т.В. и др.
Влияние компонентов крови на адгезионную активность..
ностью к поверхности полистирола. Среднее количество клеток в поле зрения микроскопа не превышало 10, тогда как бактерии штамма M. smegmatis mc2 155 отличались равномерным распределением по поверхности и значительным сродством к полистиролу. Отдельных клеток M. avium ГИСК 168 не было обнаружено на поверхности полистирола, наблюдалась адгезия небольших агрегатов сцепленных между собой бактериальных клеток (рис. 1).
При добавлении в среду инкубации бактерий компонентов крови человека или животных, в ряде случаев, происходило существенное снижение количества адгезированных клеток (рис. 2).
Исключение составило лишь внесение в среду инкубации фибронектина, растворимого гликопротеина, который выполняет важную функцию при межклеточном взаимодействии в макроорганизме. Фибронектин повсеместно встречается в жидкостях организма человека и межклеточном пространстве разных типов клеток всех тканей и органов, включая клетки эпителия кишечника. Бактериальные патогены для успешного инфицирования имеют на поверхности клеток фибронектинсвязывающие белки, которые позволяют им успешно закрепляться во внутренних средах человека или животных [11]. Фибронектинсвязывающие белки обнаружены и у некоторых микобактерий, как туберкулезных, так и нетуберкулезных видов [12]. Выявленный нами эффект, связан с тем, что фибронектин не приводит к изменению ги-дрофобности поверхностей полистирола или бактериальных клеток [13].
Вероятнее всего, в данном случае проявляется гетерогенность по способности к свя-
зыванию различными микобактериями данного белка. Возможное наличие у M. smegmatis ГИСК 607 и M. avium ГИСК 168 фибронек-тинсвязывающих белков приводит к незначительному увеличению числа адгезированных бактерий.
Кроме того, наблюдалась активация адгезии бактерий M. smegmatis ГИСК 607 к полистиролу в присутствии гемоглобина (рис. 2, Б). Стимуляция колонизации гемоглобином показана для бактерий рода Staphylococcus [14]. Известно, что гемоглобин имеет области с высоким положительным зарядом, которые могут взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами на поверхности бактериальных клеток и, меняя активность поверхностных белков [15], влиять на интенсивность сродства бактерий к каким-либо материалам. В то же время, имеются данные, свидетельствующие о том, что гемоглобин может подавлять адгезию и колонизацию бактериями пространств посредством проявления антибактериального действия фрагментов гемоглобина [16].
В присутствии этого белка адгезияM. smegmatis mc2 155 иM. avium ГИСК 168 на полистироле снижалась более, чем в 2 раза (рис. 2 А, В). Однако, возможность антибактериального действия гемоглобина и его фрагментов на мико-бактерии требует специальных исследований.
Результаты, полученные при добавлении в среду инкубации НТМБ плазмы, сыворотки крови и её основного белка - альбумина - согласуются с известным данными о том, что эти компоненты значительно снижают бактериальную адгезию [13], [17]. Адгезия микобактерий всех исследованных нами штаммов существенно подавлялась в присутствии компонентов кро-
А V
V | \ ч \ S Л_ "t.«-'
А Б В
Рисунок 1 - Расположение клеток микобактерий в поле зрения микроскопа ^Viso-103 (х!000). А - M. smegmatis mc2 155, Б - M. smegmatis ГИСК 607, В - M. avium ГИСК 168
ви, наибольший подавляющий адгезию, эффект был выявлен в отношении M. avium ГИСК 168 (рис. 2 В).
Известно, что после контакта с кровью поверхность полимера практически мгновенно покрывается белками плазмы [18]. В исследованиях Ерошенко с соавт. убедительно показано, что наслоение растворов плазмы и альбумина на поверхность полистирола приводят к существенному снижению его гидрофобности [13]. Адгезия микобактерий на полистироле вероятно, находится в выраженной зависимости от степени его гидрофобности. Это согласуется с утверждением о том, что основные механиз-
мы действия альбумина и плазмы на адгезию бактериальных клеток обусловлены сорбцией белковых соединений на поверхностях полимеров, сопровождающейся снижением их свободной энергии.
Внеклеточные нуклеиновые кислоты также обнаруживают в человеческой крови. Среднее количество ДНК, циркулирующей в плазме варьирует от 10 нг/мл до 1500 нг/мл и более [19]. Положительное влияние экзогенной бактериальной ДНК на адгезию к различным поверхностям продемонстрирована в отношении бактерий Staphylococcus, Pseudomonas, Microbacterium и Serratia [20]. Однако, практи-
контроль-
БСА-Ге Мо глобин ДНК-лактоф еррин -лиюцим-ппдзма-сыворотка крови КРС-фиЭронехтин-
3
Зн
го 4«
Количество клеток в поле зрения
контроль БСА гемоглобин ДНК
лакгоф еррин лшоцим пл аама
сыворотка крови КРС фи броней тин'
Зн
3'
—I— 10
15
Количество клеток в поле зрения
контроль БСА гемоглобин ДНК
лактоф еррин лшоцмм плазма
сыворотка крови КРС флбронектин
Ш
в
1
3
□
>
!
Ы-ч
о « ео ю 100
Количество клеток в поле зрения
Рисунок 2 - Адгезия микобактерий к полистиролу в присутствии компонентов крови. А - M. smegmatis mc2 155, Б - M. smegmatis ГИСК 607, В - M. avium ГИСК 168
Влияние компонентов крови на адгезионную активность...
Полюдова Т.В. и др.
чески отсутствуют данные о влиянии чужеродной ДНК на процессы бактериальной адгезии. В экспериментах, проведенных с бактериями рода Rhodococcus, чужеродная ДНК лосося оказывала такое же стимулирующее действие, как и собственная [21], тогда как ДНК крупного рогатого скота не усиливала или подавляла адгезию стафилококков к полистиролу [22]. В наших экспериментах показано, что внесение ДНК крупного рогатого скота в среду инкубации бактерий приводит к существенному подавлению связывания микобактерий с полистиролом.
В настоящей работе было исследовано антиадгезионное действие факторов врожденного иммунитета человека и животных - лак-тоферрина и лизоцима. Субингибиторные концентрации этих белков оказывали выраженное,
ингибирующее действие на адгезию микобак-терий к полистиролу. Эффекты лактоферрина хорошо изучены и показаны для предупреждения бактериальной адгезии на абиотических поверхностях [23]. Также активно изучается и действие лизоцима для предотвращения бактериальной колонизации абиотических поверхностей. В частности предложены варианты предобработки контактных линз для снижения адгезии стафилококков и псевдомонад на их поверхности [24].
Адгезия бактерий на биотических и абиотических поверхностях в организме хозяина является важнейшим шагом на пути к инфекции, поэтому антиадгезионная направленность воздействия на бактерий представляет собой потенциально перспективный путь лечения и профилактики микобактериозов.
04.10.2017
Список литературы:
1. Rapidly growing mycobacterial bloodstream infections / G. El. Helou, G.M. Viola, R.Hachem [et al] // Lancet Infect. Dis. - 2013. - V. 13. - P. 166-174.
2. Литвинов, В.И. Нетуберкулезные микобактерии в «Неживой и живой природе», заражение человека / В.И. Литвинов // Туберкулез и социально-значимые заболевания. - 2015. - № 2. - С. 28-33.
3. Relationships between Mycobacterium isolates from patients with pulmonary mycobacterial infection and potting soils / M.A. De Groote, N.R. Pace, K. Fulton [et al] // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - No. 72. - Р. 7602-7606.
4. Mullis, S.N. Adherence and biofilm formation of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare and Mycobacterium abscessus to household plumbing materials / S.N. Mullis, J.O. Falkinham // J. Appl. Microbiol. - 2013. - V. 115, № 3. - P. 908-914.
5.Structural analysis of biofilm formation by rapidly and slowly growing non-tuberculous mycobacteria / M.M. Williams, M.A. Yakrus, M.J. Arduino [et al] // Appl. Environ. Microbiol. - 2009. - V.75. - No. 7. - P. 2091-2098.
6. Mycobacterium fortuitum prosthetic valve endocarditis: a case for the pathogenetic role of biofilms / S. Bosio, S. Leekha, S.I. Gamb [et al] // Cardiovasc. Pathol. - 2011. - V. 21. - P. 361-364.
7. Venous catheter-associated bacteremia caused by rapidly growing mycobacteria at a medical center in central Taiwan / C.Y. Chang, R.W. Tsay, L.C. Lin [et al] // J. Microbiol. Immunol. Infect. - 2009. - V. 42. - P. 343-350.
8. Fibronectin, fibrinogen, and laminin act as mediators of adherence of clinical staphylococcal isolates to foreign material / M. Herrmann, P.E. Vaudaux, D. Pittet [et al] // J. Infect. Dis. - 1988. - V. 158. - No. 4. - P. 693-701.
9. Modes of conformational changes of proteins adsorbed on a planar hydrophobic polymer surface reflecting their adsorption behaviors / R. Ishiguro, Y. Yokoyama, H. Maeda [et al] // J. Colloid Interface Sci. - 2005. - V. 290. - P. 91-101.
10. Турна А. А. Проблемы определения гемоглобина в лабораторной диагностике и меры её решения / А. А. Турна // Лабораторная диагностика. Спецвыпуск «Лаборатория». - 2013. - №3. - С. 48-53.
11. Hymes, J.P. Stuck in the Middle: Fibronectin-Binding Proteins in Gram-Positive Bacteria/ J.P. Hymes, T.R. Klaenhammer // Front. Microbiol. - 2016. - V. 7. - Р. 1504-1513.
12. Fibronectin-binding proteins secreted by Mycobacterium avium / H. Kitaura, N. Ohara, M. Naito [et al] // APMIS. - 2000. - V.107. - No. 9. - P. 558-564.
13. Eroshenko, D. The Role of Plasma, Albumin, and Fibronectin in Staphylococcus epidermidis Adhesion to Polystyrene Surface / D. Eroshenko, I. Morozov, V. Korobov // Curr. Microbiol. - 2015. - V.70. - P.846-853.
14. Hemoglobin promotes Staphylococcus aureus nasal colonization / M. Pynnonen, R.E. Stephenson, K. Schwartz [et al] // PLoS Pathog. - 2011. - V. 7. - No. 7. - Р. 1-11.
15. Alpha and beta chains of hemoglobin inhibit production of Staphylococcus aureus exotoxins / P.M. Schlievert, L.C. Case, K.A. Nemeth [et al] // Biochemistry. - 2007. - V. 46. - No. 50. - Р. 14349-58.
16. Antibacterial hemoglobin peptides in human menstrual blood / P. Mak, K. Wöjcik, L. Wicherek [et al] // Peptides. - 2004. - V. 25. -No. 11. - Р. 1839-1847.
17. Bacterial adherence to titanium surface coated with human serum albumin / T.J. Kinnari, L.I. Peltonen, P. Kuusela [et al] // Otol. Neurotol. 2005. - V. 26. - No. 3. - P. 380-384.
18. Quantitation and characterization of competitive protein binding to polymers / C.N. Cottonaro, H.V. Roohk, G. Shimizu [et al] // Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. - 1981. - V. 27. - P. 391-395.
19. Gahan, P.B. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments / P.B. Gahan, R. Swaminathan // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2008. - V. 1137. - P.1-6.
20. Extracellular DNA in adhesion and biofilm formation of four environmental isolates: a quantitative study / L. Tang, A. Schramm, T.R. Neu [et al] // FEMS Microbiol Ecol. - 2013. - V.86. - No. 3. - P. 394-403.
21. Gilan, I. Extracellular DNA Plays an Important Structural Role in the Biofilm of the Plastic Degrading Actinomycete Rhodococcus ruber / I. Gilan, A. Sivan // Adv. Microbiol. - 2013. - V. 3. - P. 543-551
22. Ерошенко, Д.В. Влияние факторов внешней среды на первые этапы образования биопленок бактериями Staphylococcus epidermidis: дис. ... канд. биол. наук. ИЭГМ УрО РАН, - Пермь, 2015. - 137 с.
23. Inhibition of initial bacterial adhesion on titanium surfaces by lactoferrin coating / F. Nagano-Takebe, H. Miyakawa, F. Nakazawa [et al] // Biointerphases. - 2014. - V. 9. - No.2. - P. 029006.
24. Influence of protein deposition on bacterial adhesion to contact lenses / L.N. Subbaraman, R. Borazjani, H. Zhu [et al] // Optom. Vis. Sci. - 2011. - V.88. - No. 8. - P. 959-966.
Сведения об авторах:
Полюдова Татьяна Вячеславовна, научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов, доцент кафедры экологии факультета почвоведения, агрохимии, экологии и товароведения Пермской государственной сельскохозяйственной академии им. акад. Д.Н, Прянишникова, кандидат биологических наук, доцент г Пермь, ул. Голева, д. 13, e-mail: poludova@iegm.ru
Юркина Наталья Олеговна, студент кафедры химии и биотехнологии химико-технологический факультета Пермского национального исследовательского политехнического университета г Пермь, Комсомольский проспект, 29А, e-mail: optimistka-01@mail.ru
Ерошенко Дарья Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов, Институт экологии и генетики микроорганизмов, доцент кафедры химические технологии химико-технологического факультета Пермского национального исследовательского политехнического университета, кандидат биологических наук, доцент г. Пермь, ул. Голева, д. 13, e-mail: dasha.eroshenko@gmail.com
Коробов Владимир Павлович, заведующий лабораторией биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов, доцент кафедры химии и биотехнологии химико-технологического факультета Пермского национального исследовательского политехнического университета, кандидат медицинских наук, доцент г Пермь, ул. Голева, д. 13, e-mail: korobov@iegm.ru
