Научная статья на тему 'Роль микробов-ассоциантов в процессах взаимодействий бактерий с эритроцитами'

Роль микробов-ассоциантов в процессах взаимодействий бактерий с эритроцитами Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
1004
69
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МИКРОБЫ-АССОЦИАНТЫ / ЭКЗОМЕТАБОЛИТЫ / ЭРИТРОЦИТЫ / ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ / МICROBES-ASSOCIATES / EXOMETABOLITES / ERYTHROCYTES / INTERACTION

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Щуплова Елена Алексеевна

В последнее время все чаще встречаются работы, описывающие нахождение бактерий внутри эритроцитов. У разных микроорганизмов выработались различные типы стратегий взаимодействия с мембраной клетки-хозяина и различные механизмы проникновения внутрь клетки. Нахождение микроорганизмов в крови человека и животных, а также внутри эритроцитов приводит к развитию бактериемии и сепсису с высокой летальностью. В качестве гемокультуры при бактериемии в основном выделяют грамположительные микроорганизмы коагулазонегативные стафилококки, второе место занимают энтеробактерии и другие условно-патогенные микроорганизмы, причем, выделенные гемокультуры представляют собой как моноинфекцию, так и ассоциацию из двух, трех и даже четырех возбудителей. Необходимо отметить, что изучение биологических свойств у микроорганизмов особенно актуально при обнаружении их в ассоциациях и тем более при взаимодействии бактерий с клетками организма человека, в частности с эритроцитами. Использование современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии позволило изучить особенности взаимодействия эритроцитов с клетками Staphylococcus epidermidis, предварительно обработанных экзометаболитами микробов-ассоциантов. Результаты исследования показали, что экзометаболиты патогенного штамма S.aureus, а также супернатанты Candida albicans и Klebsiella pneumoniaе усиливали процессы адгезии к эритроцитам клеток S. epidermidis и их внутриэритроцитарную локализацию. Под действием экзометаболитов условно-патогенных микрооргнизмов таких, как S.saprophyticus, Escherichia coli и Corinebacterium spp. наблюдали снижение изучаемых процессов. Таким образом, под влиянием экзометаболитов бактерий-ассоциантов было обнаружено разнонаправленное действие на процессы адгезии и проникновения в эритроциты клеток Staphylococcus epidermidis.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Щуплова Елена Алексеевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE ROLE OF MICROBIAL ASSOCIENTS IN THE PROCESSES OF INTERACTIONS BACTERIA WITH ERYTHROCYTES

Recently, more and more often there are works describing the presence of bacteria inside the red blood cells. Different microorganisms developed different types of strategies for interaction with the host cell membrane and various mechanisms of penetration into the cell. The presence of microorganisms in the blood of humans and animals, as well as inside erythrocytes, leads to the development of bacteremia and sepsis with high mortality. As a hemoculture in bacteremia, gram-positive microorganisms, coagulase-negative staphylococci, are mainly isolated, second place is occupied by enterobacteria and other conditionally pathogenic microorganisms, and the isolated hemocultures are both a monoinfection and an association of two, three or even four pathogens. It should be noted that the study of biological properties in microorganisms is especially important when they are found in associations and even more so when bacteria interact with the cells of the human body, in particular with erythrocytes. Using the modern method of confocal laser scanning microscopy, it was possible to study the features of the interaction of erythrocytes with Staphylococcus epidermidis cells, pretreated with exometabolites of microbial associates. The results of the study showed that the exometabolites of the pathogenic S. aureus strain, as well as supernatants of Candida albicans and Klebsiella pneumoniae, strengthened the adhesion processes to the erythrocytes of S. epidermidis cells and their intra-erythrocyte localization. Under the influence of exometabolites conditional-pathogenic microorganisms such as S.saprophyticus, Escherichia coli and Corinebacterium spp. observed a decrease in the studied processes. Thus, under the influence of exometabolites of bacterial associates, a multidirectional effect on the processes of adhesion and penetration into the erythrocytes of Staphylococcus epidermidis cells was observed.

Текст научной работы на тему «Роль микробов-ассоциантов в процессах взаимодействий бактерий с эритроцитами»

УДК 576.8.097.29; 616.988.76

Щуплова Е.А.

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г Оренбург, Россия

E-mail: [email protected]

РОЛЬ МИКРОБОВ-АССОЦИАНТОВ В ПРОЦЕССАХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БАКТЕРИЙ С ЭРИТРОЦИТАМИ

В последнее время все чаще встречаются работы, описывающие нахождение бактерий внутри эритроцитов. У разных микроорганизмов выработались различные типы стратегий взаимодействия с мембраной клетки-хозяина и различные механизмы проникновения внутрь клетки. Нахождение микроорганизмов в крови человека и животных, а также внутри эритроцитов приводит к развитию бактериемии и сепсису с высокой летальностью. В качестве гемокультуры при бактериемии в основном выделяют грамположительные микроорганизмы - коагулазонегативные стафилококки, второе место занимают энтеробактерии и другие условно-патогенные микроорганизмы, причем, выделенные гемокультуры представляют собой как моноинфекцию, так и ассоциацию из двух, трех и даже четырех возбудителей. Необходимо отметить, что изучение биологических свойств у микроорганизмов особенно актуально при обнаружении их в ассоциациях и тем более при взаимодействии бактерий с клетками организма человека, в частности с эритроцитами.

Использование современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии позволило изучить особенности взаимодействия эритроцитов с клетками Staphylococcus epidermidis, предварительно обработанных экзометаболитами микробов-ассоциантов. Результаты исследования показали, что экзометаболиты патогенного штамма S.aureus, а также супернатанты Candida albicans и Klebsiella pneumoniaе усиливали процессы адгезии к эритроцитам клеток S. epidermidis и их внутриэритроцитарную локализацию. Под действием экзометаболитов условно-патогенных микрооргнизмов таких, как S.saprophyticus, Escherichia coli и Corinebacterium spp. наблюдали снижение изучаемых процессов.

Таким образом, под влиянием экзометаболитов бактерий-ассоциантов было обнаружено разнонаправленное действие на процессы адгезии и проникновения в эритроциты клеток Staphylococcus epidermidis.

Ключевые слова: микробы-ассоцианты, экзометаболиты, эритроциты, взаимодействия.

Проникновение одноклеточных организмов внутрь клеток других - явление, достаточно широко распространенное у бактерий, простейших и грибов. Около 20 бактериальных таксонов содержат виды, которые являются внутриклеточными паразитами и вызывают такие серьезные заболевания человека и животных, как туберкулез, бруцеллез, дизентерию и др. [7]. В последнее время все чаще можно встретить работы, где описывают нахождение микроорганизмов внутри эритроцитов, например, такие бактерии, как Bartonella bacilliformis [9], B. quintana [9], Streptococcus pneumoniae [11], Mycoplasma suis [10], Staphylococcus epidermidis [8]. У разных бактерий выработались различные типы стратегий взаимодействия с мембраной клетки-хозяина и различные механизмы проникновения внутрь клетки. Разные группы бактерий могут поражать различные типы клеток, в основном эпителиальные, дендритные клетки и макрофаги [7]. Розов С.М. и Дейнеко Е.В. в обзоре представили два механизма проникновения патогенов внутрь клеток, включая неспособных к фагоцитозу (эритроциты) [7]. При проникновении по механизму застежки-молнии

(zipper) происходит тесное связывание бактерий с мембраной клетки-хозяина (эритроцит) и дальнейшее ее скольжение по мембране, которое заканчивается формированием вакуоли, переносящей бактерию внутрь клетки. Триг-герный механизм инвазии запускается бактериальными эффекторами, впрыскиваемыми в цитозоль клетки-хозяина [7]. Нахождение микроорганизмов в крови человека, а также внутри эритроцитов приводит к развитию бактериемии и сепсису с высокой летальностью [10]. Чаще встречаются работы, описывающие роль коагулазонегативных стафилококков, энте-робактерий и других условно-патогенных бактерий в развитии бактериемии [3], [10], причем выделенные гемокультуры представляют собой как моноинфекцию, так и ассоциацию из двух, трех и даже четырех возбудителей [3]. Ранее [8] были получены данные о взаимодействии эритроцитов с клетками S. epidermidis и Escherichia coli, однако, влияние микробов-ассоциантов на процессы взаимодействия бактерий с эритроцитами изучено недостаточно. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей взаимодействия эритроцитов с клетками S. epidermidis,

предварительно обработанных экзометаболита-ми микробов-ассоциантов.

Материалы и методы

В данном исследовании использовали штаммы S. epidermidis 7 и 13, отличавшиеся уровнем антигемоглобиновой активности (АнтиНЬА), взятые из рабочей коллекции лаборатории экологии микроорганизмов ИКВС УрО РАН. Штамм S. epidermidis 7 характеризовался высоким уровнем (18,3 г/л) АнтиНЬА, тогда как S. epidermidis 13 - низким уровнем (0,5 г/л) данной активности [2]. Для создания модели ассоциаций микроорганизмов были отобраны ассоцианты (штаммы S.aureus, S.saprophyticus, Escherichia coli, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae и Corynebacterium spp). Бактерии выращивали на Шедлер-агаре (HiMedia, India) при 37 0С в течение 24 ч. Далее в полученные бактериальные взвеси S.epidermidis 7 и 13 (1 млрд. КОЕ/мл) добавляли стерильные супернатанты (экзометаболиты) штаммов-ассоциантов и инкубировали 24 ч при 37 0С. Для изучения процессов взаимодействия бактерий с эритроцитами, в частности, адгезии исследуемых бактериальных клеток S. epidermidis 7 и 13 к эритроцитам и их внутриэритроцитарное проникновение добавляли взвесь эритроцитов. Для этого полученные исследуемые образцы объемом 1 мл отмывали фосфатно-солевым буфером с помощью центрифугирования и смешивали с отмытыми буферным раствором эритроцитами в концентрации 106 кл/мл объемом 0,5 мл. После чего во все пробы добавляли по 1 мл питательной среды RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург). В качестве контроля I использовали смесь эритроцитов (0,5 мл) со стафилококками (по 1 мл) в 1 мл среды RPMI-1640; контроль II -эритроциты (0,5 мл) в 1 мл физиологического раствора и 1 мл среды RPMI-1640; контроль III - эритроциты (0,5 мл), 1 мл супернатантов бактерий-ассоциантов и 1 мл среды RPMI-1640. Опытные и контрольные пробы инкубировали в течение 24 ч при 37 0С. Затем исследуемые образцы подготавливали [8] для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), которую проводили на базе Rhodococcus--центра Пермского государственного национального исследовательского университета. Визуализацию клеток эритроцитов осуществляли с по-

мощью микроскопа Olympus FV 1000 (Olympus Corporation, Япония) с использованием 100 х иммерсионного объектива (числовая апертура 1,4). Для возбуждения флуоресценции флюо-ресцеинизотиоцианада и синьки Эванса применяли аргоновый лазер (X = 488 нм) с 505/525-нм барьерным фильтром и гелий-неоновый лазер (X = 543 нм) с 560/660-нм барьерным фильтром, соответственно. Изображения размером 0,12 х 0,12 мм (с разрешением 512 х 512 пикселей) получали с использованием 1,4 мегапиксельной цифровой камеры со скоростью 12,5 нм/пиксель. Обработку полученных изображений осуществляли с помощью программ FV10-ASW 3.1 (Olympus Corporation, Япония). Адгезивную активность клеток S. epidermidis 7 и 13 определяли по аналогии с фагоцитарным показателем [6], а внутриэритроцитарное расположение рассчитывали по формуле фагоцитарного числа [6].

Полученные результаты статистически обработали c вычислением средней арифметической (M); стандартной ошибки (m). Для установления доказательности различий (р) использовали критерий значимости (t) Стьюдента, различия считались значимыми (достоверными) при р<0,05 [5].

Результаты и обсуждение

В результате работы было выявлено, что самый высокий процент адгезии к эритроцитам оказался у клеток S. epidermidis как с высоким, так и с низким уровнем АнтиНЬА, обработанных экзометаболитами S.aureus, что составило 40,3±2,8 и 32,5±2,4 (%). Под действием экзоме-таболитов C.albicans и K.pneumoniae наблюдали усиление в 2,5 раза адгезивной активности штамма S. epidermidis 7 к эритроцитам, чем штамм S. epidermidis 13, что составило 31,7±2,3 и 28,5±2,2 (%) против 13,5±1,6 и 11,6±1,5 (%) соответственно. Под действием экзометаболитов S.saprophyticus, E.coli (рис. 1) и Corynebacterium spp. у клеток S.epidermidis 7 и 13 наблюдали снижение показателей адгезии к эритроцитам, даже ниже контрольных значений.

Аналогичные результаты были получены при изучении внутриэритроцитарной локализации клеток S. epidermidis 7 и 13, обработанных экзометаболитами S.aureus (рис. 2) и C. albicans. Необходимо отметить, что под действием эк-

Щуплова Е.А._Роль

Рисунок 1 - КЛСМ-изображения эритроцитов с адгезированными клетками 5. ергйетшЫгз 7, обработанными экзометаболитами ассоцианта Е.еоИ". 'Примечание: Клетки, светящиеся красным цветом (синька Эванса) - эритроциты, зеленым (флюоресцеинизотиоцианад) - стафилококки

-ассоциантов в процессах взаимодействий...

Рисунок 2 - КЛСМ-изображения эритроцитов с расположенными внутри клетками 5. ерЫетшгйк 13, обработанными экзометаболитами ассоцианта Б.аитеж"

'Примечание: Клетки, светящиеся красным цветом (синька Эванса) - эритроциты, зеленым (флюоресцеинизотиоцианад) - стафилококки. Белые линии на КЛСМ-изображении соответствуют графикам флюоресцентных сигналов (слева и сверху)

зометаболитов патогенного штамма S.aureus, в эритроцитах наблюдали до четырех кокков, что ранее не было отмечено.

Клетки S. epidermidis 7 с высоким уровнем АнтиНЬА, обработанные экзометаболитами S.saprophyticus и E.coli в 1,5 раза реже проникали в эритроциты, чем обработанные суперна-тантом S.aureus. Штамм S. epidermidis 13, обработанный экзометаболитами S.saprophyticus в 3,2 раза реже наблюдали внутри эритроцитов, чем клетки, обработанные супернатантом S.aureus и в контроле. Необходимо отметить, что после обработки клеток S. epidermidis 7 и 13 экзометаболитами Corynebacterium spp. внутри эритроцитов их не обнаружили.

Заключение

Таким образом, полученные результаты в данном исследовании показали, что межмикробные взаимодействия оказывают разнонаправленное влияние на процессы адгезии и проникновения в эритроциты. После воздействия экзометаболитами условно-патогенных штаммов таких, как S.saprophyticus, E.coli и Corinebacterium spp. на клетки стафилококков выявили понижение их адгезивной активности

к эритроцитам, а также внутргоритроцитарную локализацию. Под действием экзометаболитов C.albicans и K.pneumoniae, напротив, наблюдали усиление адгезии к эритроцитам, причем только одного штамма S.epidermidis 7 - с высоким уровнем антигемоглобиновой активности. Необходимо отметить, что экзометаболиты патогенного штамма 8.аигеш значительно повышали не только адгезию клеток X epidermidis как с высоким, так и с низким уровнем АнтиНЬА, но и наблюдали более частое их внутриэри-троцитарное проникновение. Под действием экзометаболитов Corynebacterium spp. внутриэ-ритроцитарного проникновения клеток стафилококков не обнаружено. Полученные данные нашли подтверждение в работах других авторов [1], [4].

Коэволюция прокариот и эукариотических организмов привела к возникновению большого числа бактериальных факторов, способных манипулировать функциями хозяина. В конечном итоге, относительно простые микроорганизмы разработали сложные, порой изощренные стратегии проникновения в клетку организма человека, выживания в ней и пере страивания клетки под свои нужды [7].

06.10.2017

Список литературы:

1. Ассоциативный симбиоз. / О.В. Бухарин [и др.] Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 264 с.

2. Бухарин, О.В. Определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина // Патент РФ № 2262705 - C. 2.

3. Каргальцева, Н.М. Полимикробность гемокультур - современная тенденция в этиологии инфекции кровотока / Н.М. Каргаль-цева, В.И. Кочеровец, А.М. Иванов // Инфекционные болезни и антимикробная терапия. - 2012. - Т. 56. - № 1. С. 56-61.

4. Значимость факторов патогенности условно-патогенных микроорганизмов при оценке их этиологической роли в развитии заболевания / Е.С. Кунилова [и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2. - № 4. - С. 699-704.

5. Ланг, Т.А. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов / Т.А. Ланг, М. Сесик / пер. с англ. под ред. В.П. Леонова. М. Практическая медицина, 2011. - 245 с.

6. Карпищенко, А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. проф. А.И. Карпищенко. С-Пб. Интермедика, 1999. - 656 с.

7. Розов, С.М. Бактериальные внутриклеточные патогены: стратегии нападения и защиты / С.М. Розов, Е.В. Дейнеко // Успехи современной биологии. - 2015. - Т. 135. - № 5. - С. 464-479.

8. Щуплова, Е.А. Роль биологических свойств Staphylococcus epidermidis во внутриэритроцитарной инвазии и изменении активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов при экспериментальной генерализованной инфекции / Е.А. Щуплова, А.А. Стадников, С.Б. Фадеев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159. - № 1. - С. 79-82.

9. Dechio, C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction / С. Dechio // Cell Microbiol. - 2008. - No. 10(8). - Р. 1591-1598.

10. Marnie Potgieter, J. The dormant blood microbiome in chronic, inflammatory diseases / Marnie Potgieter, J. Bester, D. B. Kell // Microbiology Reviews. - 2015. - Vol. 13. - No. 39. - Р. 567-591.

11. Streptococcus pneumoniae invades erythrocytes and utilizes them to evade human innate immunity / M. Yamaguchi [et al.] // PLoS One. - 2013. - No. 8. - Р. 77282.

Сведения об авторе:

Щуплова Елена Алексеевна, старший научный сотрудник лаборатории экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН,

кандидат биологических наук 460000, г Оренбург, ул. Пионерская, 11; тел. 8 (3532) 77-54-17, e-mail: [email protected]

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.