CC BY
126
6. Cano M., Hajjeh R. A. The epidemiology of histoplasmosis: a review. Semin. Respir. Infect. 2001; 16: 109-18.
7. Cimponeriu D., LoPresti P., Lavelanet M. Gastrointestinal histoplasmosis in HIV infection: two cases of colonic pseudocancer and review of the literature. Am. J. Gastroenterol. 1994; 89 (1): 129-31.
8. Kasuga T., Taylor J.W., White T.J. Phylogenetic relationships of varieties and geographical groups of the human pathogenic fungus Histoplasma capsulatum Darling. J. Clin. Microbiol. 1999; 37 (3): 653-63.
9. Kasuga T., White T.J., Koenig G. et al. Phylogeography of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum. Molecular. Ecology. 2003; 12: 3383-401.
10. Kauffman C.A. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20 (1): 115-32.
REFERENCES
1. Maleev V.V., ed. Especially Dangerous Mycoses. [Osobo opasnye mikozy]. Volgograd: Volga-Pablisher; 2013. (in Russian)
2. V'yuchnova N.V., Tkachenko G.A., Grishina M.A., Savchenko S.S., Antonov V.A., Lipnitskiy A.V. The comparative analysis of DNA extraction methods from Histoplasma capsulatum Darling cells. Prob-lemy medit.sin.skoy mikologii. 2009; 11 (3): 38-42. (in Russian).
3. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., eds. Laboratory diagnosis of dangerous infectious diseases. Practical Guidance. [Laboratornaya diagnostika opasnykh infektsionnykh bolezney: Prakticheskoe ru-
microbiology
kovodstvo]. 2st ed. processed and added. Moscow: Shiko; 2013. (in Russian)
4. Kashkin P.N., Lisin V. V. Practical Guidance on a Medical Mycology. [Prakticheskoe rukovodstvo po meditsinskoy mikologii]. Leningrad: Meditsina; 1983. (in Russian)
5. Popova A.Yu., Toporkov A.V., Lipnitskiy A.V., Polovets N.V., Vik-torov D.V. Distribution in the world of especially dangerous mycoses. Zhurnalmikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2016; 3: 120-6. (in Russian)
6. Cano M., Hajjeh R. A. The epidemiology of histoplasmosis: a review. Semin. Respir. Infect. 2001; 16: 109-18.
7. Cimponeriu D., LoPresti P., Lavelanet M. Gastrointestinal histoplasmosis in HIV infection: two cases of colonic pseudocancer and review of the literature. Am. J. Gastroenterol. 1994; 89 (1): 129-31.
8. Kasuga T., Taylor J.W., White T.J. Phylogenetic relationships of varieties and geographical groups of the human pathogenic fungus Histoplasma capsulatum Darling. J. Clin. Microbiol. 1999; 37 (3): 653-63.
9. Kasuga T., White T.J., Koenig G. et al. Phylogeography of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum. Molecular. Ecology. 2003; 12: 3383-401.
10. Kauffman CA. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20 (1): 115-32.
Поступила 25.01.17 Принята к печати 30.01.17
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2017 УДК 616.157-078:577.21.083
Щуплова Е.А., Черкасов С.в., Плотников А.О.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА FISH ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ, ЛОКАЛИЗОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТИ И ВНУТРИ ЭРИТРОЦИТОВ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, 460000, Оренбург, Россия
Проникновение бактерий внутрь эукариотических клеток - широко распространенное явление. В последнее время описана способность различных микроорганизмов проникать внутрь эритроцитов, что часто приводит к развитию бактериемии и сепсиса. Существуют разные методы обнаружения бактерий в кровотоке, характеризующиеся различной эффективностью и длительностью процедуры. Общепринятые микробиологические методы диагностики длительны и ограничены в выявлении некультивируемых форм микроорганизмов. Существуют молекулярно-генетические методы диагностики бактериемии и сепсиса, позволяющие сокращать время проведения исследований и выявлять широкий спектр микроорганизмов. Цель данного исследования - разработка оптимального протокола флуоресцентной in situ гибридизации для изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами. Представлены результаты применения молекулярно-генетического метода FISH, адаптированного для выявления бактерий, расположенных на поверхности и внутри эритроцитов. Разработан оптимальный протокол фиксации эритроцитов, исключающий их лизис, на основе тестирования разных видов антикоагулянтов и концентраций фиксирующих растворов. Подобраны температурный режим и оптимальное время гибридизации образцов с флуоресцентными зондами, меченными FITC. С помощью люминесцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии по характерному свечению обнаружены адгезия и внутриэритроцитарная локализация бактерий в исследуемых образцах крови. При использовании FISH время исследования сокращается до 8-12 ч. Одновременно проводят идентификацию микроорганизмов, так как ДНК и рРНК бактерий гибридизуется с ДНК-зондами, комплементарными таксон-специфическим участкам гена 16S рРНК. Другое преимущество FISH - возможность проведения лабораторной диагностики бактериемии и сепсиса в образцах крови больных без выделения гемокультуры.
Ключевые слова: бактерии; эритроциты; внутриклеточное паразитирование; ДНК-зонд; FISH; диагностика; бактериемия; сепсис.
Для цитирования: Щуплова Е.А., Черкасов С.В., Плотников А.О. Применение метода FISH для выявления бактерий, локализованных на поверхности и внутри эритроцитов. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (7): 431-435. DOI: http://dx.doi.org/10.18821m69-2084-2017-62-7-431-435 SchuplovaE.A., CherkasovS.V., PlotnikovaA.O.
THE APPLICATION OF FISH TECHNIQUE FOR DETECTION OF BACTERIA LOCALIZED ON THE SURFACE AND WITHIN ERYTHROCYTES
The institute of cellular and intracellular symbiosis of the Ural branch of the Russian academy of sciences, 460000 Orenburg, Russia
Для корреспонденции: Щуплова Елена Алексеевна, канд. биол. наук, ст. науч.сотр. лаб. экологии микроорганизмов; е-mail: Khanina83@ yandex.ru
микробиология
The penetration of bacteria within eukaryotic cells is a wide spread occurrence. Lately, a capacity of various microorganisms is described related to penetration within erythrocytes that often results in development ofbacteriemia and sepsis. Various techniques exist for detection of bacteria in blood .stream characterizing by different efficiency and duration of procedure. The common microbiological methods of diagnostic are of long duration and limited in detection of non-cultivated forms of microorganisms. There are molecular genetic methods of diagnostic of bacteriemia and sepsis permitting shortening time of analysis implementation and to detect wide spectrum of microorganisms. The purpose of study is to develop optimal protocol of fluorescent in situ hybridization for studying interaction of bacteria with erythrocytes. The results are presented concerning application ofmolecular genetic method FISH adjusted to detect bacteria located on surface and within erythrocytes. The optimal protocol of fixation of erythrocytes is developed excluding their lysis on the basis of testing of various types of anticoagulants and concentrations of fixing solutions. The temperature regimen and optimal time of hybridization of samples with fluorescent probes marked by FITC are selected. The adhesion and within erythrocytes localization of bacteria in analyzed blood samples are detected by distinctive glow using luminescent and confocal laser scanning microscopy. The application ofFISH shortens duration of analysis up to 8-12 hours. Simultaneously, identification of microorganisms is implemented because DNA and pRNA of bacteria are hybridized with DNA-probes complementing taxon-specific sites of gene 16S pRNA. The other advantage of FISH is a possibility of implementing laboratory diagnostic of bacteriemia and sepsis in blood samples of patients without separation of hemoculture.
Keywords: bacteria; erythrocytes; intracellular parasitizing; DNA-probe; FISH; diagnostic; bacteriemia; sepsis. For citation: Schuplova E.A., Cherkasov S.V, Plotnikova A.O. The application of FISH technique for detection of bacteria localized on the surface and within erythrocytes. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (7): 431-435. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-7-431-435
For correspondence: SchuplovaE.A., candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of ecology of microorganisms. e-mail: [email protected]
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Acknowledgment. The authors express their sincere gratitude for technical support in carrying out studies to A.V. Sgibnev, doctor of biological sciences, leading researcher of laboratory on studying mechanisms of development of human microbiocenoses.
Received 21.03.2017 Accepted 31.03.2017
Введение. Паразитирование прокариот в клетках эукариот - широко распространенное явление в живой природе. Около 20 групп бактерий содержат виды, которые являются внутриклеточными паразитами и вызывают серьезные заболевания человека и животных. Разные группы бактерий могут поражать различные типы клеток, в основном эпителиальные и дендритные, а также макрофаги [1]. В последнее время все чаще можно встретить работы, где описывают нахождение микроорганизмов внутри эритроцитов [2], например Bartonella bacilliformis [3], B. quintana [4], Brucella melitensis [5], Streptococcus pneumoniae [6], Mycoplasma suis [7], Staphylococcus epidermidis [8], Leptospira pomona [9]. Описаны механизмы проникновения патогенов внутрь клеток, включая не способных к фагоцитозу (эритроциты) [1]. Нахождение микроорганизмов в крови человека, а также внутри эритроцитов ведет к развитию бактериемии и сепсису с высокой летальностью [10]. Одна из главных причин высокой летальности при инфекциях кровотока - поздняя диагностика возбудителей и неадекватное эмпирическое лечение антибиотиками [11]. Эффективность различных методов обнаружения бактерий в крови зависит от многих факторов и критериев оценки клинической значимости конкретного случая. Для точной и быстрой диагностики бактериемии и сепсиса перспективны новые молекулярно-генетические подходы в изучении взаимодействия про- и эукариот. Известен метод FISH (флуоресцентная in situ гибридизация), в котором используют флуоресцирующие молекулы для детекции специфических фрагментов ДНК и РНК [12-14]. Материалом для исследования методом FISH служат кровь, костный мозг, биоптаты, плацента и др. В исследуемых образцах флуоресцентная гибридизация in situ позволяет выявлять нуклеи-
новые кислоты в клетках, морфологию и одновременно проводить идентификацию микроорганизмов [12].
Цель исследования - разработка оптимального протокола FISH для выявления бактерий, расположенных на поверхности или внутри эритроцитов.
Материал и методы. Проанализировано несколько методик проведения FISH с использованием предметных стекол и пробирок Эппендорф [13, 14]. В основу протокола положена методика ДНК-гибридизации в растворе с олигонуклеотидными зондами, меченными FITC, описанная в работе Sladjana Malic и соавт. [14] и предназначенная для изучения способности микроорганизмов формировать биопленки с использованием FISH. Адаптация протокола флуоресцентной in situ гибридизации для изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами включала эксперименты по подбору оптимального антикоагулянта, вида и концентрации фиксирующих растворов, времени гибридизации, температурного режима.
Использованы штаммы бактерий из рабочей коллекции лаборатории экологии микроорганизмов и дисбиозов ИКВС УрО РАН: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. Все исследуемые штаммы бактерий выращивали на МПА при 37 oC в течение 18 ч и готовили их взвесь в физиологическом растворе в концентрации 109 КОЕ/мл.
Забор крови производили от здорового донора из локтевой вены стерильным одноразовым шприцем и сразу переливали ее в пробирку с антикоагулянтом. Для отделения эритроцитов от других форменных элементов и плазмы брали 2 мл крови, добавляли 8 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (рН - 7,4), трехкратно отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и доводили эритроциты
microbiology
Характеристика олигонуклеотидов, используемых в работе
№ п/п Микроорганизм Последовательность 5'-3' Молекулярная масса Температура отжига, °С
1 Enterobacteria-ceae spp. FAM-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC 6813 53,8
2 Pseudomonas aeruginosa FAM-AACTTGCTGAACCAC 4583 32,5
3 Staphylococcus aureus FAM-GCTTCTCGTCCGTTC 4548 39,3
4 S. epidermidis FAM-ACTCTATCTCTAGAGGGGTCAG 6813 45,5
5 Staphylococcus spp. FAM-TCCTCCATATCTCTGCGC 5424 54,0
до концентрации 106/мл. Смешивали 0,5 мл эритроцитов, 1 мл микробной взвеси исследуемых микроорганизмов и 0,5 мл питательной среды RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург), инкубировали в термостате при 37 oC в течение 24 ч. 1 мл клеточной суспензии осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин.
В качестве фиксаторов использовали 0,5 растворы глутарового альдегида (Sigma), 4 и 10% растворы параформальдегида (Sigma). Фиксаторы добавляли в осадок объемом 400 мкл и выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывали и ресуспендировали в ФСБ. Следующие этапы фиксации эритроцитов проводили в растворах этанола с восходящей концентрацией 50, 80 и 100%, добавляя по 400 мкл каждого раствора с последующей инкубацией при 4 oc в течение 10 мин. Далее эритроциты промывали ФСБ путем центрифугирования в течение 5 мин при 1000 об/мин и ресуспен-дировали. Аликвоты по 100 мкл фиксированных клеток осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 100 мкл буферного раствора для гибридизации (0,9 М NaCl и 20 mM Tris-HCl, рН - 7), содержащего 500 нМ соответствующего ДНК-зонда. Все пробы инкубировали в соответствии с температурой отжига для каждого вида зонда. Для проведения FISH синтезировали зонды, меченные на 5'-конце флуюресцеина изотиоцианатом (FITC) (ООО «ДНК-синтез», Москва). Используемые олигонуклеотиды представлены в таблице.
После гибридизации клетки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин и добавляли 500 мкл промывочного раствора для удаления ДНК-зондов, не связавшихся с ДНК исследуемых бактерий. Инкубировали в течение 30 мин при соответствующей температуре. Операции, связанные с FISH, проводили в темноте. После гибридизации клетки центрифугировали и ресуспендировали в 300 мкл ФСБ. Эритроциты дополнительно окрашивали синим Эванса, обеспечивающей красное свечение клеток. Регистрацию результатов FISH проводили с помощью люминесцентного микроскопа Биомед 6 (Люм) (увеличение 1000) (ООО «Биомед», Санкт-Петербург) или конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus FV 1000 (Olympus Corporation, Япония) с использованием 100-кратного иммерсионного объектива (числовая апертура - 1,4).
Результаты. При изучении взаимодействий бактерий с эритроцитами брали только свежевыделенные эритроциты, так как эритроциты со сроком хранения несколько дней не выдерживали фиксации и изменяли свою форму и размер. На получение качественных эритроцитов решающее влияние оказывали различ-
ные виды антикоагулянтов. Протестировано несколько видов антикоагулянтов: гепарин, цитрат натрия и готовые пробирки для взятия крови, содержащие ЭДТА. Оптимальный антикоагулянт — 3,8% раствор цитрата натрия. При использовании других антикоагулянтов эритроциты плохо выдерживали этапы фиксации, изменялись их форма и размер.
Для достижения качественных результатов при изучении внутриэритроцитарного проникновения бактерий с использованием метода FISH подбирали разные условия. Необходимо было подобрать режим фиксации эритроцитов, для того чтобы они выдерживали температуру нагрева до 60 °С и не лизировались. Использованы четыре разных раствора фиксаторов: 0,5 и 2,5% глутаровый альдегид, 4 и 10% парафор-мальдегид. Время инкубации всех опытных образцов составило 30 мин. Установлено, что выбор фиксатора влияет на качество фиксированных эритроцитов. При фиксации 0,5% раствором глутарового альдегида эритроциты сохраняли четко выраженные контуры и характерное двояковогнутое углубление в середине клетки (рис. 1). Эритроциты оставались красно-розового цвета. Аналогичные результаты получены при использовании 2,5% раствора глутарового альдегида. Полученные результаты подтверждают данные И.А. Лобова и соавт. [15], показавшие отсутствие деформаций эритроцитов при воздействии глутарового альдегида. При использовании в качестве фиксатора параформальдегида в концентрации 4 или 10% качество эритроцитов ухудшалось. При фиксации 4% раствором параформальдегида наблюдали нелизирован-
Рис. 1. Эритроциты, фиксированные 0,5% глутаровым альдегидом. Окраска эритроцитов синим Эванса. Ув. 1000.
микробиология
Рис. 2. Эритроциты, фиксированные 4% параформальдеги-дом. Окраска эритроцитов синим Эванса. Ув. 1000.
ные эритроциты, имеющие слегка размытые контуры клетки (рис. 2). При использовании 10% раствора параформальдегида наблюдали эритроциты с нечетко выраженными контурами клетки.
При изучении взаимодействия эритроцитов с микроорганизмами методом FISH рекомендовано использовать в качестве фиксатора эритроцитов 0,5 или 2,5% раствор глутарового альдегида.
При подготовке эритроцитов к высокой температуре гибридизации необходимо выполнять еще один этап фиксации. После обработки 0,5% раствором глутарового альдегида используют растворы этанола с возрастающей концентрацией. Для того чтобы эритроциты не лизировались, необходимо использовать этиловый спирт с последовательно увеличивающимися концентрациями: 50, 80 и 100% раствор. Время инкубации в каждом растворе составляло 10 мин при 4 °С.
Рис. 3. Результаты FISH для оценки адгезии S. epidermidis на эритроцитах. Ув. 1000.
1 - эритроциты; 2 - стафилококк на поверхности эритроци-
Описано время гибридизации, варьирующее от 45 мин до 12 ч [13, 14]. На следующем этапе подобрано оптимальное время для гибридизации зондов, меченных FITC с ДНК или РНК бактерий, находящихся на поверхности или внутри эритроцитов. При инкубации 45-60 мин наблюдали неспецифическое связывание зонда с бактериями, проявляющееся свечением в контрольных пробах, содержащих бактерии других таксонов. По нашим данным, минимальное время гибридизации для специфического связывания зонда с ДНК и РНК бактерий, исключающее ложноположительные результаты, должно быть не менее 5 ч. В опытных образцах наблюдали эритроциты с типичными для них формой и размером, с четко выраженным углублением в середине клетки. Хорошо была видна адгезия бактерий к эритроцитам (рис. 3), а в некоторых образцах -внутриэритроцитарно расположенные бактерии.
Обсуждение. Разработан протокол, обеспечивающий эффективные условия для фиксации эритроцитов, исключающие их лизис, подобрано время специфического связывания меченного FITc ДНК-зонда с ДНК исследуемых бактерий. Для диагностики бактериемии используют различные методы исследования: ПЦР-анализ гемокультуры; мультиплексный ПЦР-анализ в режиме реального времени; метод матричной лазерной десорбционной ионизационной времяпро-летной масс-спектрометрии (MALDI-ToF MS); метод газовой хроматографии [16]. При использовании указанных методов необходима гемокультура, которая выделяется в 45% случаев [17], исследование занимает не менее 24-48 ч [18], требуется дорогостоящее оборудование [16]. При использовании метода FISH время диагностики сокращается до 8-12 ч, одновременно проводят идентификацию микроорганизмов. В исследуемых образцах ДНК или РНК микроорганизмов гибридизу-ется с флуоресцентно меченными олигонуклеотидны-ми зондами, комплементарными видоспецифическим участкам гена 16S рРНК, после чего образцы исследуют под люминесцентным или конфокальным лазерным сканирующим микроскопом. По наличию бактерий со специфическим свечением делают вывод о таксономической принадлежности бактерий, их локализации на поверхности или внутри эритроцитов. Метод позволяет провести быструю дифференциацию и идентификацию микроорганизмов в образцах крови, что является перспективным для диагностики бактериемии и септических состояний [19]. Результаты исследования могут быть использованы в клинических лабораториях лечебных учреждений для экспресс-диагностики септических состояний пациентов.
Благодарность. Авторы выражают искреннюю признательность за техническую помощь в проведении исследований вед. науч. сотр. лаборатории по изучению механизмов формирования микробиоценозов человека ИКВС УрО РАН, д-ру биол. наук, доц. А.В. Сгибневу.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа проводилась в рамках государственного задания по теме «Роль микробного фактора в функционировании физиологических систем организма человека» № 0420-2015-0005.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 2-7, 9, 11-14, 18,19 см. REFERENCES)
1. Розов С.М., Дейнеко Е.В. Бактериальные внутриклеточные патогены: стратегии нападения и защиты. Успехи современной биологии. 2015; 135 (5): 464-79.
8. Щуплова Е.А., Стадников А.А., Фадеев С.Б. Роль биологических свойств Staphylococcus epidermidis во внутриэритроцитарной инвазии и изменении активности каталазы и супероксиддис-мутазы эритроцитов при экспериментальной генерализованной инфекции. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 159 (1): 79-82.
10. Руднов В.А. Сепсис: современные подходы к диагностике и интенсивной терапии. Вестник анестизиологии и реанимотоло-гии. 2010; 7 (1): 48-57.
15. Лобов И.А., Давлеткильдеев Н.А. Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии. Вестник Омского университета. 2013; 2: 129-32.
16. Попов Д.А., Овсеенко С.Т., Осипов Г.А., Вострикова Т.Ю. Ускоренный способ идентификации возбудителей бактериемий с применением метода газовой хромато-масс-спектрометрии. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 5: 54-8.
17. Гаврилов С.Н., Скачкова Т.С., Шипулина О.Ю., Савочкина Ю.А., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Современные молекулярно-генетические методы, используемые для этиологической диагностики сепсиса. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 2: 91-9.
REFERENCES
1. Rozov S.M., Deineko E.V. Bacterial intracellular pathogens: attack and defense strategies. Uspekhi sovremennoy biologii. 2015; 135 (5): 464-79. (in Russian)
2. Potgieter M., Bester J., Douglas B. Kell, Pretorius E. The dormant blood microbiome in chronic, inflammatory diseases. Microbiology Reviews. 2015; fuv013: 39: 567-91.
3. Dechio C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction. Cell Microbiol. 2008: 10 (8): 1591-8.
4. Rolain J.M., Maurin M., Mallet M.N., Parzy D., Raoult D. Culture and antibiotic susceptibility of Bartonella quintana in human erythrocytes. Antimicrob. Agents Ch. 2003; 47: 614-9.
5. Vitry M.A, Hanot Mambres D., Deghelt M., Hack K., Machelart A., Lhomme F. et al. Brucella melitensis invades murine erythrocytes during infection. Infect. Immun. 2014; 82: 3927-38.
6. Yamaguchi M., Terao Y., Mori-Yamaguchi Y., Domon H., Sakaue Y., Yagi T. et al. Streptococcus pneumoniae invades erythrocytes and utilizes them to evade human innate immunity. PLoS One. 2013; 8: e77282.
7. Zhang Y., Zou Y., Ma P., Muhammad H.M., Li Y., Jiang P. Identi-
microbiology
fication of Mycoplasma suis MSG1 interaction proteins on porcine erythrocytes. Arch. Microbiol. 2014; 80: 7551-60.
8. Shchuplova E.A., Stadnikov A.A., Fadeev S.B. Estimation of the role the biological properties of Staphylococcus epidermidis in their intraerythrocytic bacterial invasion and in change of catalase and su-peroxide-dismutase activity of red blood cells in experimental generalized infection. Byulleten' ehksperimental'noy biologii i meditsiny. 2015; 159 (1): 79-82. (in Russian)
9. Norman G. Miller, Richard B. Wilson. In vivo and vitro observations of Leptospira pomona by electron microscopy. Microbiologe. 1962; 6: 569-74.
10. Rudnov V.A. Sepsis: modern approaches to diagnosis and intensive care. Vestnik anestiziologii i reanimotologii. 2010; 7 (1): 48-57. (in Russian)
11. Schaub N., Frei R., Muller C. Addressing unmet clinical needs in the early diagnosis of sepsis. Swiss Med. Wkly. 2011; 141: w13244.
12. Frickmann H., Zautner A.E., Moter A., Kikhney J., Hagen R.M., Stender H., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in the microbiological diagnostic routine laboratory: a review. Crit. Rev. Microbiol. 2017; 43 (3): 263-93.
13. Torres C. E., Gibello A., Nande M., Martin M., Blanco A. Fluorescent in situ hybridization and flow cytometry as tools to evaluate the treatments for the control of slime-forming enterobacteria in paper mills. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008; 78: 889-97.
14. Malic S., Hill K.E., Hages A., Percival S.L., Thomas D.W., Williams D.W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 2009; 155: 2603-11.
15. Lobov I.A., Davletkildeev N.A. Influence of the method of sample preparation on the morphofunctional characteristics of erythrocytes in the study by atomic force microscopy. Vestnik Omskogo univer-siteta. 2013; 2: 129-32. (in Russian)
16. Popov D.A., Ovseenko S.T., Osipov G.A., Vostrikova T.Yu. Accelerated way to identify pathogens bacteremia using the gas chroma-tography-mass spectrometry method. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2013: 5: 54-8. (in Russian)
17. Gavrilov S.N., Skachkova T.S., Shipulina O.Yu., Savochkina Yu.A., Shipulin G.A., Maleev V.V. Modern molecular genetic methods used for etiologic diagnosis of sepsis. Zhurnal mikrobiologii, epidemi-ologii i immunobiologii. 2016; 2: 91-9. (in Russian)
18. Calderaro A., Martinelli M., Motta F., Larini S., Arcanqeletti M.C., Medici M.C. et.al. Comparison of peptide nucleic acid fluorescen-cein situ hybridization assays with culture-based matrix-assisted laser desorption/ ionization-time of flight mass spectrometry for the identification of bacteria and yeasts from blood cultures and cerebrospinal fluid cultures. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20: o468-75.
19. Laub R.R., Knudsen J.D. Clinical consequences of using PNA-FISH in Staphylococcal bacteraemia. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33: 599-601.
Поступила 21.03.17 Принята к печати 31.03.17
