CC BY
77
ВЕСТНИК Югорского ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
2009 г. Выпуск 3 (14). С. 58-61
УДК 577; 579
изменение среднесуточной гемолитической и каталазной активности госпитальных штаммов ассоциативной микробиоты под действием экзометаболитов Candida albicans в эксперименте
В. В. Костерина, А. П. Рябинина, В. В. Леонов, В. В. Варницына,
М. В. Николенко, Я. И. Паромова, Т. Х. Тимохина
Введение
В природе не существует так называемых чистых биосистем и подавляющее большинство явлений, наблюдаемых в естественных условиях, является результатом эволюционно сложившихся форм существования различных ассоциаций [10]. Эта область в последнее время привлекает большое внимание, поскольку природные популяции микроорганизмов в большинстве случаев представляют собой симбиотические ассоциации, смешанные культуры или культуры микроорганизмов, находящихся в конкурентной борьбе за какой-либо фактор, ограничивающий рост популяции.
В ассоциациях микробные продукты могут действовать синергически, способствуя росту и размножению бактерий, экспрессии факторов патогенности [2]. Наряду с синергизмом среди микроорганизмов широко распространены антагонистические взаимодействия, которые зависят от принадлежности микроорганизма к какому-либо семейству или биовару [9]. В литературе описаны случаи симбиоза бактерий имеющих важное медицинское значение, так установлено, что дрожжеподобные грибы рода Candida способны усиливать свои патогенные свойства в ассоциации с бактериями, приводя к отягощению состояния пациента вплоть до летального исхода [1, 6]. Кроме того, возбудители при ассоциированной инфекции чаще характеризуются антибиотикорезистентностью, гемолитической, антилизоцимной, ле-цитовителазной, ДНК-азной активностями, ЛТ-энтеротоксигенностью и др. [7]. Несмотря на обилие информации о роли микробных ассоциаций в инфекционной патологии человека, до сих пор остаются не изученными механизмы их формирования и устойчивости.
В настоящее время убедительно показано, что биохимические и биологические свойства микроорганизмов подвержены суточным колебаниям [11], в связи с этим целесообразно изучение межмикробных взаимодействий в хронобиологическом аспекте. Создание экспериментальной модели для изучения влияния экзометаболитов на среднесуточную биохимическую активность ассоциантов позволит установить новые механизмы межклеточных взаимодействий, направленных на поддержание и формирование устойчивых микробных ассоциаций.
Целью данной работы явилось изучение среднесуточной гемолитической и каталазной активности госпитальных штаммов Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) и Escherichia coli (E. coli), под действием экзометаболитов Candida albicans (C. albicans) в эксперименте.
объекты и методы исследования
Для исследования были использованы госпитальные штаммы Staphylococcus aureus 2888, Escherichia coli 2336, Pseudomonas aeruginosa 2364 и Candida albicans 1760 полученные из раневого отделяемого больных ожогового центра ОКБ №1 г. Тюмень. Госпитальные штаммы были идентифицированы общепринятыми методиками по совокупности морфоло-
гических, тинкториальных и биохимических признаков. Вид микроорганизма был определен с помощью коммерческих тест-систем «Entero-test», «Staphytest» (Lachema, Чехия). В качестве эталонных использовали, штаммы, полученные из американской коллекции типовых культур АТСС (S. aureus 25923, E. coli 35218, P. aeruginosa 27853, C. albicans 24433).
Бактерии культивировали в мясопептонном бульоне (МПБ), дрожжеподобные грибы в бульоне Сабуро (НПО «Питательные среды», Махачкала).
Экзометаболиты от микробных клеток отделяли центрифугированием при 3000 g в течение 15 мин 33-х часовой культуры дрожжеподобных грибов C. albicans выращенных в 10 мл бульона Сабуро. Супернатанты стерилизовали добавлением хлороформа, в соотношении супернатант : хлороформ - 20 : 1.
Экзометаболиты добавляли в МПБ (1 : 10) и инокулировали по 0,2 мл культуральной жидкостью, контролем служили посевы в бульон не содержащий экзометаболитов. Посевы выращивали в течение 12 ч при 37 °С.
Определение каталазной и гемолитической активности микроорганизмов проводили в течение суток с 3-х часовым интервалом, перед началом определения во всех случаях оптическую плотность исследуемой культуры стандартизировали при X = 591 нм до 0,2 опт. ед.
Активность каталазы и гемолитическую активность определяли фотометрическим методом по убыли пероксида водорода [3] и лизису эритроцитов крови барана соответственно [8].
Все результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента [13].
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований по влиянию экзометаболитов C. albicans на госпитальные и эталонные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, обнаружен ингибирующий эффект экзометаболитов на среднесуточную гемолитическую и каталазную активность эталонных и госпитальных штаммов S. aureus и E. coli (рис. 1 и 2). Стимулирующий эффект экзометаболиты C. albicans оказывали только на среднесуточную гемолитическую и каталазную активность эталонного и госпитального штамма P. аeruginosa.
П контроль П опыт
S
=
ч
о
я
ч
я
н
я
а
л
н
®
=
£
И
<
5,59
4,50
2,65
2,11
1,41
1,57
3,59
2,29
1,91
1,38
0,92
0,64
1 2 3 4 5 6
Рисунок 1. Влияние экзометаболитов С. albicans на среднесуточную активность каталазы эталонных и госпитальных штаммов ассоциативной микробиоты:
1 - S. aureus 2888; 2 - E. coli 2336; 3 - P. aeruginosa 2364;
4 - S. aureus 25923; 5 - E. coli 35218; 6 - P. aeruginosa 27853
6
5
4
3
2
0
При оценке влияния экзометаболитов C. albicans на E. coli выявлено снижение среднесуточной активности каталазы и гемолитической активности как эталонного, так и госпитального штамма. Наибольшее уменьшение гемолитической активности на 29,4% происходит у госпитального штамма E. coli.
В случае S.aureus выявлено наибольшее ингибирующее действие экзометаболитов
C. albicans на активность каталазы: госпитальный штамм - в 1,8 раз, эталонный штамм -в 2,6 раза по сравнению с контролем. Гемолитическая активность всех штаммов S. aureus также уменьшается, однако в меньшей степени, чем для штаммов E. coli.
При определении влияния экзометаболитов C. albicans на P. aeruginosa показано увеличение среднесуточной каталазной и гемолитической активности: на 1,09 мкмоль/мин и 3,5% (эталонный штамм), на 0,38 мкмоль/мин и 5,1% (госпитальный штамм) соответственно.
70
60
о 50 о = я =
Н U «
И «
И
U « у =
Н =
Ч о
40
30
20
—
10
0
59,4
4,7
3,0
30,0
13,6
17,1
20,3
20,7
14,2
10,7
10,3
5,2
1 2 3 4 5 6
Рис. 2. Влияние экзометаболитов С. albicans на среднесуточную гемолитическую активность эталонных и госпитальных штаммов ассоциативной микробиоты:
1 - S. aureus 2888; 2 - E. coli 2336; 3 - P. aeruginosa 2364;
4 - S. aureus 25923; 5 - E. coli 35218; 6 - P. aeruginosa 27853
Полученные результаты можно расценивать как один из возможных механизмов меж-микробных взаимодействий, определяющих формирование и стабилизацию микробных ассоциаций [4]. Каталаза микроорганизмов отвечает за утилизацию активных форм кислорода, образующихся в результате респираторного взрыва при фагоцитозе [5] и ее можно рассматривать как фактор персистенции. Гемолизины различных типов относят к числу ферментов патогенности бактерий, позволяющих им преодолевать защитные механизмы макроорганизма. Экзометаболиты C. albicans обладают ингибирующим эффектом на активность каталазы эталонных и госпитальных штаммов S. аигеш и E. coli. Ингибирование активности каталазы экзометаболитами C. а1Ысяш приводит к увеличению повреждающего эффекта активных форм кислорода, что может влиять на выживание и численность микробной ассоциации. Увеличение среднесуточной активности каталазы и гемолитической активности P. aeruginosa под действием экзометаболитов C. а1Ысяш как с эталонным, так и с госпитальным штаммами, может говорить о высоком персистентном и патогенном потенциале ассоциации P. aeruginosa с C. аlbicans. Действительно по данным Е. В. Шаталовой [12] ассоциация P. aeruginosa и C. аlbicans приводит к наиболее тяжелым смешанным инфекциям ожоговой травмы.
Таким образом, экзометаболиты C. Elbicans могут оказывать влияние на ферментативные системы ассоциативной микробиоты. Выявленные закономерности можно рассматривать как один из механизмов взаимодействия бактерий, определяющих формирование,
устойчивость и регулирование микробных ассоциаций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бельский В. В. Структура популяций синегнойной палочки при ассоциации со стафилококком и эшерихиями / В. В. Бельский, Е. В. Шаталова, К. С. Прадиуман // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. -1994. - № 6. - С. 37-38.
2. Бухарин О.В. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р / О. В. Бухарин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - Т. 130, № 7.
3. Бухарин О. В. Межбактериальные взаимодействия / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов, Л. М. Хуснутдинова // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.
- 2003. - № 4. - С. 3-8.
4. Бухарин О. В. Изменение активности каталазы Staphylococcus aureus ATCC 6538 Р под влиянием метаболитов микроорганизмов, выделенных из разных экотопов / О. В. Бухарин [и др.] // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 2. - С. 183-186.
5. Брудастов Ю. А. Активность каталазы и супероксиддисмутазы Staphylococcus aureus при их персистировании в макроорганизме / Ю. А. Брудастов, Т. С. Сборец, Д. Г. Дерябин // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - № 2. - С. 13-16.
6. Валышев А. В. Механизмы формирования бактериально-грибковых ассоциаций в кишечнике человека / А. В. Валышев, Н. Б. Перунова, О. В. Бухарин // Проблемы медицинской микологии. - 2004. - № 6 (2). - С. 65-69.
7. Габидуллин З. Г. Характеристика свойств, определяющих персистенцию моно- и ассоциированных культур условно-патогенных энтеробактерий / З. Г. Габидуллин [и др.] // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. - № 4. - С. 62-64.
8. Габидуллин З. Г. Биологическая характеристика штаммов Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации // Автореф. дис. ... д-ра. мед. наук.
- Саратов, 1990.
9. Егоров Н. С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н. С. Егоров, И. П. Баранова // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - Т. 44, № 6. - С. 33-40.
10. Миллер Г. Г. Биологическое значение ассоциаций микроорганизмов // Вестник РАМН.
- 2000. - С. 45-51.
11. Тимохина Т. Х. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов / Т. Х. Тимохина [и др.] // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - № 4. - С. 3-5.
12. Шаталова Е. В. Смешанные инфекции ожоговой травмы / Е. В. Шаталова, В. В. Бель-ский. - Курск : КГМУ, 1998. - 94 с.
13. Fisher R. A. Statistical methods for research workers. - London, 1954.
