CC BY
5INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL VOLUME 1 ISSUE 8 UIF-2022: 8.2 | ISSN: 2181-3337
ЁД ГЕННИ PICHIA PASTORIS АЧИТЩ ^УЖАЙРАСИГА КЛОНЛАШ
О.Н. Аширов Т.Х. Садуллаев А.М. Ярилкаганова А.М. Норматов С.А. Сасмаков Ш.С. Азимова УзР ФА Усимлик моддалари кимёси институти Тошкент кимё-технология институти https://doi.org/10.5281/zenodo.7441236 Аннотация. Гепатит В вирусининг юза антигенини кодловчи S ген pPIC9 трансфер вектори орцали Pichia pastoris ачитцисига клонланди. Бунда pPIC9- S рекомбинант плазмидаси SacI рестриктаза ферменти билан кесилиб Pichia pastoris ачитцисига электропорация усулида киритилди. Ачитци клонлари гистидинсиз озуца мущтда устирилиб селекция цилинди. Натижада Pichia pastoris ачитцисининг S сацловчи Mut+ клонлари олинди.
Калит сузлар: Pichia pastoris, рекомбинант ДНК, S ген, трансфер вектор, электропорация, рестрикция, трансформация
КЛОНИРОВАНИЕ ЧУЖЕРОДНЫЙ ГЕН В ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS Аннотация. Ген S, кодирующий поверхностный антиген вируса гепатита В, клонирован в дрожжи Pichia pastoris с помощью трансферного вектора pPIC9. При этом рекомбинантную плазмиду pPIC9-S обрабатывали рестрикционным ферментом SacI и встраивали в дрожжи Pichia pastoris методом электропорации. Клоны дрожжей отбирали, выращивая без гистидиновой питательной среде. В результате были получены Mut+ фенотипы Pichia pastoris, содержащие S ген.
Ключевые слова: Pichia pastoris, рекомбинантная ДНК, ген S, трансфер вектор, электропорация, рестрикция, трансформация.
CLONING A FOREIGN GENE IN THE YEAST PICHIA PASTORIS Abstract. The S gene encoding the hepatitis B surface antigen was cloned into the yeast Pichia pastoris using the pPIC9 transfer vector. The recombinant plasmid pPIC9-S was treated with the restriction enzyme SacI and inserted into the yeast Pichia pastoris via electroporation. Yeast clones were selected by growing in a medium without histidine. As a result, Mut+ phenotypes of Pichia pastoris containing the S gene were obtained.
Keywords: Pichia pastoris, recombinant DNA, S gene, transfer vector, electroporation, restriction, transformation.
Кириш
Pichia pastoris ачитци тизими х,озирги кунда рекомбинант оксилларни олишда куп ишлатилаёфтган экспрессион тизимлардан бири х,исобланади. Арзон озука мух,итда куп биомасса йигиши, эндотоксин ва пирогенларнинг йуклиги, анчайин юкори рекомбинант оксил синтези ва рекомбинант оксилни озука мух,итга чикариш хусусиятлари ушбу экспрессион тизимнинг асосий афзалликларидир [1-3]. Бугунги кунда Pichia pastoris экспрессион тизимида терапевтик ва саноат микёсида ишлатиладиган 70 дан ортик оксил мах,сулотлари бозорга чикарилган [4].
INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL VOLUME 1 ISSUE 8 UIF-2022: 8.2 | ISSN: 2181-3337
Pichia pastoris экспрессия тизимдан фойдаланишнинг асосий максади сут эмизувчилар учун талаб килинадиган хафталар урнига бир неча кун давом этувчи ферментация жараёни оркали юкори самарадор рекомбинант оксиллар олишдан иборатдир. Бугунги кунда P. pastoris тизими оркали олинган биотехнология, фармацевтика, эмлаш, хайвонлар саломатлиги ва озик-овкат саноатидаги махсулотлар учун 160 дан ортик компанияларга лицензиялар берилган. Ушбу тизимда 500 дан ортик гетероген оксиллар олинган булиб, ушбу оксиллардан биринчиси 1996 йилда инсоннинг клиник синовларига киритилди ва ундан сунг эса терапевтик оксиллар ва антигенларнинг кулланилиши бошланди [5-7].
Ачиткиларга асосланган барча биофармацевтика махсулотлари хозирги кунда А^Ш ва Европада Sacharomyces serevisia тизимида ишлаб чикарилади. Шунингдек, Р. pastorisдан олинган рекомбинант гепатит B вакцинаси ва интерферон алфа Х,индистонда 1999 ва 2002 йилларда Shanta Biotech тамонидан сотилган (-^^^вЬа^аЫ^есЬ.сом). Шу каби, рекомбинант инсон инсулини Х,индистонда 2003 йилда тасдикланган ва Shanta Biotech ва Biosan (www.biosan.cом) кушма корхонаси тамонидан сотила бошланган.
Бегона геннинг геном ДНК га интеграция жараёни Saccharomyces cerevisiae да булгани каби, вектор ва Pichia pastoris геноми томонидан ухшаш кетма-кетликлар уртасида гомологик рекомбинация натижасида содир булади [8]. Pichia pastoris га ДНКни киритишнинг асосан туртта усули таркалган булиб, улар кулайлик, трансформация тезлиги ва бошка хусусиятлари билан фаркланади (1-жадвал).
1-жадвал
P. pastoris трансформация усулининг умумий хусусиятлари
Усуллар Трансформация ^улайлиги *Мултикопи
унуми/мкг ДНК интеграция
Сферопласт 105 Паст Бор
Электропорация 105 Юкори Бор
PEG1000 103 Юкори Иук
LiCl 102 Юкори Иук
*- хужайра геномига бир неча нусха геннинг кириши.
Туртта трансформация процедураларининг хар бири билан векторларни P. pastoris геномига киритиш мумкин. Сферопласт усули энг яхши урганилган булиб, унумдорлиги юкори хисобланади (~105/мкг, днк), аммо агарли мухитга экилгандан сунг хужайраларнинг тикланиш даражаси анча паст хисобланади [9]. Долган учта усул ёрдамида хужайралар агароза гелининг юзасида бузилмаган ёки бутун холда сакланади ва хужайраларни экиш ва кейинги тахлилларда ишлатишда кулайлик тугдиради. Бундан ташкари PEG 1000 ва LiCl усулларида трансформация унуми нисбатан паст ва мултикопи интеграция мавжуд эмас. Электропорация усулида бу каби камчиликлар кузатилмайди. Шу билан биргаликда бу усул осон, кулай ва арзон хисобланиб, хозирги кунда купчилик олимлар томонидан кулланилаётган усул хисобланади [8].
Материал ва методлар
Тадкикотларимизда SacI рестрикция ферменти (Invirtogen, А^Ш), GS115 P. Pastoris ачитки штами (Invirtogen, А^Ш), pPIC9 трансфер векторлари (Invirtogen, А^Ш),
INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL VOLUME 1 ISSUE 8 UIF-2022: 8.2 | ISSN: 2181-3337
MD (1% глюкоза, 1Х YNB, 1,5% агар-агар), RBD (1% глюкоза, 1Х YNB, 1,5% агар-агар, 1M сорбитол) озука мухитларидан фойдаланилди.
Рестрикция жараёни. Рестрикция ферменти SacI мос равишдаги 1Х буферларда 1 мкг ДНК га 1 unit фермент хисобида олинади. Аралашма 37°C да 2-4 соат мобайнида инкубация килинади. Жараённинг унуми электрофорез усулида текширилади.
Рекомбинант плазмидаларнинг P. pastoris %ужайраларига трансформациям. Тайёр пробиркадаги хужайраларга 1-5 мкг занжир холатига келтирилган ДНК кушилади, 0.2 см кюветага жойланади ва муз хаммомида 5 мин давомида ушланади. Electroporator 2510 (Eppendorf company) курилмаси 1.5 kV га созланиб, кювета жойланади ва "pulse" тугмаси икки марта босилади. Жараён тугаганлиги хакидаги сигналдан сунг секинлик билан 1 мл 1М сорбитол кушилади. Суюклик кюветадан янги 2 мл пробиркага олиниб, 30°C да 1 соат давомида тебранишсиз инкубация килинади. Суюкликдан 100-500 мкл олиниб, янги тайёрланган RDB агар ликопчасининг юза кисмига махсус ясалган ясси шиша найча ёрдамида суриб шимдирилади. Pichia pastoris GS115 HIS4 гени буйича мутацияга учраганлиги сабабли колониялар гистидинсиз мухитда уса олмайдилар. Хужайрадаги his4 гени вектор плазмидадаги натив HIS4 гени билан алмаштирилганлиги сабабли, колонияларни селекция килиш максадида гистидинсиз озука мухитида (RDB) устирилди. Ликопчалар колониялар хосил булгунга кадар 2-3 кун, 30°C да инкубация килинди.
Олинган натижалар ва уларнинг мухокамаси
pPIC3.5-S ва pPIC9-S рекомбинант плазмидаларини Pichia pastoris %ужайрасига интеграция цилиш (киритиш). Тадкикотимизнинг асосий мксади гепатит В вирусининг юза антигени S оксилини кодловчи генини Pichia pastoris хужайрасига pPIC9 тансфер вектори оркали киритишдан иборат. Бунинг усун халкасимион шакилдаги ДНК махсус рестриктазалар билан кесилиб чизиксимон холатга олиб келиниши керак. Pichia Expression Kit (Invitrogen, USA) маьлумотларига кура рекомбинант плазмидаларни чизиксимон (линейный) холга келтиришда ишлатилган рестриктаза ферментларининг турига караб Mut+ ва MutS каби фенотиплар олинади (2-жадвал).
2-жадвал
Олинадиган фенотипларнинг рестриктаза ферментларига боFликлиги
Рестриктаза ферменти Интеграция сохаси Фенотип
Sal I ва Stu I his4 буйича His+ Mut+
Sac I 5' AOX1 кисми буйича His+ Mut+
Bgl II AOX1 буйича алмашиниш. His+ MutS
Биз P. рastorisнинг Mut+ фенотипини олиш максадида pPIC9-S рекомбинант плазмидани SacI рестриктаза ферменти билан кесиб чизиксимон холга келтирдик. Мазкур фермент билан ишлов бериш оркали асосий углерод манбаи ва максадли геннинг инициатори булган метанолни юкори даражада утилизация хусусиятли Mut+ фенотипи хосил булади. Pichia pastoris GS115 штаммида гистидиннинг синтезига жавоб берувчи гистидинол дегидрогеназа гени (his4) мутация килинган. Натижада мазкур штаммлар
INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL VOLUME 1 ISSUE 8 UIF-2022: 8.2 | ISSN: 2181-3337
гистидинсиз озука мухитда уса олмайдилар. Тадкикот доирасида ишлатилаётган трансфер векторлар натив HIS4 генини саклайди. Рекомбинант плазмидалар Pichia pastoris хужайрасига киритилганда S ген билан биргаликда мазкур HIS4 гени хам рекомбинацияга учрайди. Натижада хужайрадаги мутация килинган his4 ген натив HIS4 ген билан алмашинади ва рекомбинант хужайралар гистидинсиз озука мухитда усиш кобилиятига эга буладилар (1-расм).
1-расм. Pichia pastoris ачитки геномига бегона геннинг кириш жараёни (гомологик
рекомбинация).
Шу сабабдан хам трансформация жараёнидан сунг хужайралар гистидинсиз селектив озука (RDB) мухитда 30 °С да 3-7 кун давомида устирилди (2-расм).
2-расм. pPIC9-S рекомбинант плазмидаси асосида олинган Pichia pastoris колонияларининг гистидинсиз селектив озука мухитида устириш. Х,ар бир катакчаларга ажратилган колониялардан биттадан олиниб, кейинги жараёнлар учун янги тайёрланган гистидинсиз MD мухитига кайта экилди (3-расм).
INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL VOLUME 1 ISSUE 8 UIF-2022: 8.2 | ISSN: 2181-3337
3-расм. рР1С9-8 рекомбинант плазмидаси асосида олинган РгеМа ра^^ош колонияларининг гистидинсиз селектив МО озука мухитига кайта экилиши.
Юкоридаги иккала МО мухитига кайта экилган штаммларнинг барчаси 10мл суюк МО мухитига экилиб, 30 °С да тун давомида инкубация килинди. Барча усган култураларнинг оптик зичлиги спектрофатометрнинг 600нм тулкин узунлигида улчанди. Улар ичидан 4 та энг юкори оптик зичлик намоён этганлари танлаб олинди. Шундан сунг ачитки хужайрасидан геном ДНК си ажратилди ва киритилган геннинг мавжудлигини текшириш максадида ПЗР (полимераза занжир реаксияси) усули кулланди (4-расм).
4-расм. 1% агароза гелидаги ПЗР натижалари.
Бунда: 1-4 танлаб олигинган ачиткиларнинг ДНК фрагментлари; М-маркер; К-мусбат намуна.
Олинган натижалардан шуни хулоса килиш мумкинки, танлаб олинган 4 та Р. рastoris рекомбинант штаммларининг барчаси уз таркибида максадли S генини тутиши ва киритилган геннинг улчами 681 жн (жуфт нуклеотид) эканлиги аникланди. Мусбат намунада сифатида S ген сакловчи рекомбинант плазмида фойдаланилди. Шундан сунг, якка холдаги рекомбинант штаммни гистидинсиз MD агар мухитига кайта штрихлаб экилди.
Шундай килиб, Гепатит В вирусининг юза S (ИБвЛ§) оксилини кодловчи S-ген, рPIC9-S рекомбинант плазмидалари оркали РгеЫа pastoris хужайрасига киритилди ва МШ:+ фенотипи олинди.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL VOLUME 1 ISSUE 8 UIF-2022: 8.2 | ISSN: 2181-3337
REFERENCES
1. B. Gasser, R. Prielhofer, H. Marx, M. Maurer, J. Nocon, M. Steiger, V. Puxbaum, M. Sauer, D. Mattanovich. Pichia pastoris: protein production host and model organism for biomedical research. Future Microbiol. 8, 191 (2013).
2. M. Ahmad, M. Hirz, H. Pichler, H. Schwab. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 5301 (2014).
3. S.C. Spohner, H. Quitmann, P. Czermak. Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris. Journal of Biotechnology 202, 118 (2015).
4. http://www.pichia.com/science-center/commercialized-products/
5. Research Corporation Technologies, Arizona, personal communication; www.rctech.com.
6. Cregg J.M, et al. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris. // Mol. Biotechnol, 2000. - V. 16(1) - P. 23-52.
7. Gerngross TU. Advances in the Production of Human Therapeutic Proteins in Yeast and Filamentous Fungi. // Nat. Biotech, 2004. - V. 22(11). - P. 1409-1414.
8. Julien, C. Production of humanlike recombinant proteins in Pichia pastoris. Bio Process Int, 2006. - V. 4. - P. 22-33.
9. Sreekrishna K, et al. High-Level Expression, Purification, and Characterization of Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Synthesized in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris. // Biochem, 1989. - V. 28(9). P. 4117-4125.
