CC BY
24
'W) Check for updates
https://doi.org/l0.17816/ecogen17447-55
АНАЛИЗ ГЕНОВ ПОЛИАМИНОКСИДАЗ У МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ KOMAGATAELLA PHAFFII
© А.В. Иванова, А.В. Сидорин, Е.В. Самбук, А.М. Румянцев
ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург
Для цитирования: Иванова А.В., Сидорин А.В., Самбук Е.В., Румянцев А.М. Анализ генов полиаминоксидаз у метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii // Экологическая генетика. - 2019. - Т. 17. - № 4. - С. 47-55. https://doi.org/l0.17816/ecogen17447-55.
Поступила: 17.06.2019 Одобрена: 02.12.2019 Принята: 17.12.2019
Ф Полиамины присутствуют во всех живых клетках и регулируют широкий спектр биологических процессов. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae полиаминоксидаза Fms1p превращает спермин в спермидин и 3-аминопропаналь, что необходимо для синтеза пантотеновой кислоты и гипузинирования. В данной работе показано, что ортологи гена FMS1 дрожжей S. cerevisiae присутствуют у всех основных представителей подотдела Saccharomycotina, однако их копийность различна. У дрожжей Komagataella phaffii (Pichia pastoris) идентифицированы два гена полиаминоксидаз (KpFMSl и KpFMS2) и изучена регуляция активности их промоторов.
Ф Ключевые слова: полиаминоксидазы; метилотрофные дрожжи; Komagataella phaffii; Pichia pastoris.
THE ANALYSIS OF THE POLYAMINE OXIDASE GENES IN THE METHYLOTROPHIC YEAST
KOMAGATAELLA PHAFFII
© A.V. Ivanova, A.V. Sidorin, E.V. Sambuk, A.M. Rumyantsev
St. Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia
Cite this article as: Ivanova AV, Sidorin AV Sambuk EV, Rumyantsev AM. The analysis of the polyamine oxidase genes in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii. Ecological genetics. 2019;17(4):47-55. https://doi.org/l0.17816/ecogen17447-55.
Received: 17.06.2019 Revised: 02.12.2019 Accepted: 17.12.2019
& Polyamines are present in all living cells and regulate a wide range of biological processes. In Saccharomyces cerevisiae the polyamine oxidase Fmslp converts spermine to spermidine and 3-aminopropionaldehyde, which is necessary for the synthesis of pantothenic acid and hypusination. This paper shows that S. cerevisiae FMS1 gene orthologs are present in all major representatives of the Saccharomycotina subdivision, but their copy numbers are different. In the Komagataella phaffii (Pichia pastoris) yeast, two polyamine oxidase genes (KpFMS1 and KpFMS2) were identified, and the regulation of their promoters activity was studied.
& Keywords: polyamine oxidases; methylotrophic yeast; Komagataella phaffii; Pichia pastoris.
ВВЕДЕНИЕ
Полиамины — группа алифатических поликатионов, которая обнаружена у прокариотических и эукариоти-ческих организмов. У высших эукариот, в том числе и у грибов, наиболее часто встречаются путресцин, спермидин и спермин. Функции полиаминов определяются их химической структурой. При физиологических рН полиамины имеют положительный заряд и за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий могут действовать как лиганды, связываясь с ДНК, РНК, белками, фосфолипидами и нуклеозидтри-фосфатами [1, 2]. Предполагают, что полиамины могут участвовать в регуляции экспрессии генов как за счет изменения структуры ДНК и модуляции сигнальных путей, так и за счет связывания с транскрипционными факторами. Полиамины избыточны у всех живых организмов. Дефицит полиаминов приводит к прекращению роста клеток, однако их интенсивное накопление может
быть цитотоксично, что свидетельствует о необходимости строгой регуляции внутриклеточного пула этих соединений [2, 3]. В последнее время интерес к полиаминам вызван их возможным использованием в качестве антипролиферативных соединений.
Уровень полиаминов в клетке контролируется комплексом биосинтетических (орнитиндекарбоксилаза, S-аденозилметионинкарбоксилаза, спермидинсинта-за и сперминсинтаза) и катаболических (спермидин/ сперминацетилтрансфераза, флавинсодержащая полиаминоксидаза, Си-содержащая диаминоксидаза) ферментов [2]. Полиаминоксидаза представляет особый интерес, так как она превращает спермин в спермидин и 3-аминопропаналь. Окисление 3-аминопропаналя необходимо 5. cerevisiae для синтеза пантотеновой кислоты [4], в то время как спермидин участвует в реакции гипузинирования (важной модификации трансляционного фактора е№-5А) [5].
Филогенетический анализ полиаминоксидаз был проведен у животных и растений. У животных обнаружено, что в процессе эволюции предковый ген поли-аминоксидазы PAO был дуплицирован, и в результате возникли два белка паралога позвоночных, кодируемые генами SMO и APAO [6]. Геном Arabidopsis thaliana содержит минимум пять полиаминоксидаз. Анализ субстратной специфичности белка показал, что поли-аминоксидаза AtPAO3 окисляет спермидин и спермин и продуцирует H2O2. Показано, что полиаминоксида-зы растений A. thaliana AtPAO2, AtPAO3 и AtPAO4 локализованы в пероксисомах [7]. У животных один из белков полиаминоксидаз содержит сигнал транспорта в пероксисомы и также может быть локализован в этих органеллах.
У грибов полиамины регулируют широкий круг биологических явлений: диморфизм, формирование спор и апрессорий. В некоторых случаях они регулируют вирулентность грибов — патогенов животных и растений [8]. Лучше всего изучена ФАД-зависимая (флавинадениндинуклеотид) полиаминоксидаза Fms^ Saccharomyces cerevisiae [9], участвующая в биосинтезе Р-аланина и пантотеновой кислоты. Дрожжи c делецией гена FMS1 не способны расти на среде без пантотеновой кислоты или р-аланина, а в случае сверхэкспрессии гена FMS1 под контролем ADH1 промотора, трансформанты секретируют пантотеновую кислоту в среду [4]. В то же время у других представителей подотдела Saccharomycotina количество генов полиаминоксидаз варьирует и связь копийности генов поли-аминооксидаз с метаболизмом не ясна.
В данной работе проведен анализ ортологов полиаминоксидаз у представителей подотдела Saccharomy-cotina, идентифицированы гены полиаминоксидаз KpFMS1 и KpFMS2 метилотрофных дрожжей Koma-gataella рhaffii (Pichia pastoris) и изучена их регуляция.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сравнение аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз
Ортологи белка S. cerevisiae Fmslp у представителей группы Saccharomycotina были найдены с помощью алгоритма BLASTp со стандартными параметрами [10]. Множественное сравнение аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз проводили в программе Mega X [11]. Найденные последовательности были вы-равнены с помощью программы CLUSTAL W [12]. Для построения филогенетического дерева использовали метод Maximum Likelihood (ML). Наилучшей моделью для данного метода оказалась LG+G [13]. Построение ML дерева проводилось с использованием модели LG+G и с 500 повторностями анализа bootstrap. Полученное дерево было укоренено с помощью внешней группы — грибов Neurospora crassa. Визуализировали
дерево с помощью программы FigTree v1.4.3 (http:// influenza.bio.ed.ac.uk/software/Figtree/).
Праймеры
Все праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 1.
Таблица 1
Последовательности праймеров, использованных в работе
Название Последовательность (5' ^ 3')
KpFMS1F AAAGACGTCAGGGTACACGGTATTGTGAGA
KpFMS1R AATGGATCCTGATAGCCGATTGCAATGTT
KpFMS2F AAAAAGACGTCGTTTCGAATAATTAGTTGTT
KpFMS2R AATGGATCCGTTGGTATTGTGAAATAGACG
PHO5R CGGAATTCCAAAACTATTGT
Плазмиды
В работе были использованы плазмиды pAL2-T (Евро-ген, Россия) и pPIC9-AOX1-PHO5 [14].
Штаммы
В работе были использованы штаммы дрожжей К. phaffii 4-GS115 (his4 phox) и tr2-4-GS115 (phox PAOX1-PHO5) [14], а также штамм бактерий E. coli DH5a, (fhuA2 A(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Ф80А (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17).
Среды и условия культивирования
Для культивирования штаммов дрожжей использовали следующие среды. YEPD: 2 % глюкоза, 2 % пептон, 1 % дрожжевой экстракт, 2.4 % агар. МФО: 0.73 М MgSO4 • 7H2O, 0.18 мМ CaCl2, 20 мМ Na-цитратный буфер (pH 4,6), витамины, микроэлементы. Источники углерода (глицерин или метанол) — 1 %, источник азота (сульфат аммония) — 0,2 %. Для культивирования бактерий использовали среду LB: 1 % триптон, 0.5 % дрожжевой экстракт, 170 мМ NaCl, бензилпенициллин — 5 • 105 е. а./л. Штаммы К. phaffii выращивали при температуре 30 °C, E. coli — при температуре 37 °C.
Конструирование плазмид pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5
Для получения плазмид pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5 проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами к промоторам генов KpFMS1 (KpFMS1F и KpFMS 1R) и KpFMS2 (KpFMS2F и KpFMS2R) и хромосомной ДНК штамма К. phaffii 4-GS115 в качестве матрицы. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей проводили согласно [15]. Последовательности промоторов были клонированы в полученный ранее вектор pPIC9-PHO5 [14] с использованием сайтов рестрикции AatII и BamHI.
При этом происходило замещение промотора гена ал-когольоксидазы 1 AOXl на промоторы генов полиаминоксидаз KpFMSl и KpFMS2. Трансформацию бактерий проводили согласно [16]. В результате были сконструированы плазмиды, в которых под контролем промоторов генов KpFMSl и KpFMS2 находятся последовательности репортерного гена кислой фосфатазы (КФ) PHO5 дрожжей S. cerevisiae. Также эти плазмиды содержат ген HIS4 в качестве селективного маркера.
Структуру итоговых плазмид pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5 проверяли с помощью методов ПЦР и рестрикционного анализа.
Получение штаммов РFMS1-4-GS115 и РFMS2-4-GS115
Плазмидами pPIC9-PKpFMS 1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5 трансформировали штамм 4-GS115. Для этого плазмиды линеаризовали с помощью эндо-нуклеазы рестрикции StuI и трансформировали клетки дрожжей методом электропорации [17]. При этом происходила интеграция генетической конструкции в геном K. phaffii. Селекцию трансформантов проводили за счет восстановления прототрофности по гистидину. Для анализа интеграции плазмиды выделяли хромосомную ДНК из трансформантов и проводили ПЦР с праймера-ми к промоторам генов полиаминоксидаз и гену PHO5 (KpFMS1F и PHO5R для PFMS1-4-GS115; KpFMS2F и PHO5R для PFMS2-4-GS115).
Молекулярные методы
Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции BamHI, AatII и StuI производили при условиях, предложенных фирмой-производителем ферментов (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Дефосфорилирование вектора производили с помощью фосфатазы FastAP (Thermo Fisher Scientific Inc., США) одновременно с гидролизом ДНК эндонуклеазами рестрикции. Очистку ДНК из ага-розных гелей и реакционных смесей проводили с помощью наборов Cleanup Standard (Евроген, Россия). Ли-гирование фрагментов ДНК проводили с помощью T4 ДНК лигазы (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью наборов Plasmid Miniprep (Евроген, Россия). Для проведения ПЦР использовали наборы реактивов Encyclo Plus PCR (Евроген, Россия). Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 0,7 % агарозном геле в буфере TAE [18].
Качественное определение активности кислой фосфатазы
На поверхность среды с выросшими колониями дрожжей накладывали бумажные фильтры, смоченные раствором субстрата а-нафтилфосфата и красителя синего прочного Б, растворенных в 0,1 М цитратного буфера рН 4,6 до концентрации 2 мг/мл. Через 10 мин оценивали интенсивность окрашивания колоний дрожжей [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Биоинформатический анализ протеомов дрожжей подотдела Saccharomycotina
На первом этапе работы изучили распространенность полиаминоксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina (отдел Ascomycota). Для этого с помощью алгоритма BLAST провели поиск гомологичных белков в протеомах 22 видов дрожжей, относящихся к разным семействам данного отдела, а также в протеоме мицелиального гриба Neurospora crassa (представителя подотдела Pezizomycotina, входящего в отдел Ascomycota). В качестве образца для сравнения использовали аминокислотную последовательность полиаминоксидазы дрожжей S. cerevisiae Fmslp [9]. Подобный подход применяли ранее при поиске полиаминоксидаз среди фитопатогенных грибов [8]. Результаты представлены на рис. 1.
Показано, что полиаминоксидазы и соответствующие им гены присутствуют у всех исследованных видов из разных семейств подотдела Saccharomycotina. При этом в зависимости от систематического положения количество белков полиаминоксидаз и соответствующих им генов у исследованных видов разное: 1) основные представители семейств Ascoideaceae, Phaffomycetaceae, Saccharomycetaceae содержат только один ген, 2) представители семейств Debaryomycetaceae, Met-schnikowiaceae и клады Yarrowia — два гена, 3) представители семейства Pichiaceae — 3 гена. Исключением для этого семейства являются дрожжи Komagataella phaffii (больше известные под своим старым названием — Pichia pastoris), у которых обнаружены два гена. Этот вид дрожжей является представителем клады Komagataella, которую в работе [20] относят к пара-филетическому семейству Pichiaceae.
Проведение филогенетического анализа с использованием последовательностей генов полиаминоксидаз оказалось затруднено большими различиями между нуклеотидными последовательностями обнаруженных генов. Поэтому проводили множественное сравнение аминокислотных последовательностей всех полиамин-оксидаз, обнаруженных у исследуемых видов дрожжей (рис. 2).
Полученные результаты позволяют объединить аминокислотные последовательности полиаминокси-даз в группы (ПАО) на основании их сходства. Группа ПАО1 объединяет белки, обнаруженные у представителей семейств Ascoideaceae, Phaffomycetaceae, Saccharomycetaceae, у которых был выявлен только один ген полиаминоксидаз. Группы ПАО2.1 и ПАО2.2 объединяют белки, обнаруженные у представителей семейства Metschnikowiaceae, у которых было выявлено два гена. ПАО3.1, ПАО3.2 и ПАО3.3 объединяют белки, обнаруженные у представителей семейства Pichiaceae, у большинства из которых было выявлено
Рис. 1. Распространенность полиаминоксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina. Филогенетические отношения показаны, основываясь на результатах, полученных в работе [20]. Обозначение ПГД отделяет родственные виды, предки которых претерпели полногеномную дупликацию [28]
три гена. К этим группам (ПАО3.1 и ПАО3.2) относятся также белки дрожжей Babjeviella inositovora (Debaryomycetaceae, два гена). Внутри самих групп ПАО результаты множественного сравнения последовательностей в целом отражают филогенетические отношения в соответствующих семействах подотдела Saccharomycotina.
2. Биоинформатический анализ внутриклеточной локализации полиаминоксидаз
Побочным продуктом реакций, осуществляемых полиаминоксидазами, является перекись водорода, которая опасна для клеток. Поэтому у растений и у животных некоторые полиаминоксидазы направляются в пероксисомы [7]. Для всех полиаминоксидаз был проведен поиск сигнальных последовательностей, обеспечивающих их транспорт в различные клеточные органеллы, в первую очередь в пероксисомы. Известны два основных типа сигналов, обеспечивающих
транспорт белков в пероксисомы — PTS1 и PTS2 (Peroxisomal Targeting Signals). Наиболее распространенным является сигнал PTS1, который встречается более чем у 95 % белков матрикса пероксисом. Исходно сигнал PTS1 был определен как последовательность из трех аминокислот на С-конце белка — SKL. Однако затем было показано, что этот сигнал может варьировать и представляет из себя консен-сусную последовательность [21]. Результаты анализа последовательностей полиаминоксидаз на наличие сигналов пероксисомной локализации представлены на рис. 2.
Показано, что среди исследованных полиаминок-сидаз, выделяются группы ПАО2.2 и ПАО3.2, представители которой часто (в 6 случаях из 9) содержат на С-конце сигнал PTS1, соответствующий консенсу-сной последовательности. При этом у трех белков последовательность на С-конце не соответствует консен-сусной, но очень близка к ней. Последовательности
32,6%
43,4%
99 ,4%
36,4%
39,4%
23,2%
7D,4%
9S%
36,2%
37,6%
97,6%
74,2%
13,4%
99,4%
99,4%
32%
B5,2%
93, &%
49,6%
95,6%
23,4%
47,6%
БВ,Б%
56,2%
33,3%
69,2%
33,4%
Белок/вид
PTS1
Семейства
XP 503341.1 Yarrowia lipolytica XP 501266.1 Yarrowia lipolytica AKL Клада Yarrowia
XP_018713474.1 Metschnikowia sp. XP_001383524.2 Scheffersomyces stipitis XP_002546433.1 Candida tropicalis XP_716457.1 Candida albicans XP 018983323.1 Babjeviella inositovora - Debaryomycetaceae Metschnikowiaceae ПА02.1
ПА03.1
XP 022459189.1 Kuraishia capsulata XP_002493159.1 Komagataella phaffii XP_013933011.1 Ogataea parapolymorpha XP_019019768.1 Pichia membranifaciens XP 020546691.1 Pichia kudriavzevii XP_002494272.1 Komagataella phaffii XP_022459070.1 Kuraishia capsulata XP_013933434.1 Ogataea parapolymorpha XP_019016158.1 Pichia membranifaciens XP_020542396.1 Pichia kudriavzevii XP 022461193.1 Kuraishia capsulata XP_013933775.1 Ogataea parapolymorpha XP_019018091.1 Pichia membranifaciens XP_020543008.1 Pichia kudriavzevii SKL GKL AKF AKL Pichiaceae
ПАОЗ.З
ПА03.2
XP_ 018986710.1 Babjeviella inositovora XP_018713421.1 Metschnikowia sp. XP_001387500.2 Scheffersomyces stipites XP 722661.1 Candida albicans XP_002545464.1 Candida tropicalis GRL SKI SKL SKL SKL Debaryomycetaceae Metschnikowiaceae
ПА02.2
XP_020047881.1 Ascoidea rubescens - Ascoideaceae ПА01
XP 020072648.1 Cyberlindnerajadini — Phaffomycetaceae
XP_002553058.1 Lachancea thermotolerans XP 002999399.1 Kluyveromyces lactis XP 449679.1 Candida glabrata XP 003679995.1 Toridaspora delbrueckii XP 002499197.1 Zygosaccharomyces rouxii XP_003954787.1 Kazachstania africana XP_018220082.1 Saccharomyces eubayanus XP 013733.1 Saccharomyces cerevisiae ERL Saccharomycetaceae
XP_960607.2 Neurospora crassa - Sordariaceae
Рис. 2. Результаты множественного сравнения аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз исследуемых видов дрожжей. Показана представленность последовательностей PTS1, обеспечивающих локализацию белка в перок-сисомах, на С-конце полиаминоксидаз исследованных видов дрожжей. Подчеркиванием выделены аминокислоты, отличные от известной для 5. cerevisiae консенсусной последовательности [22]
полиаминоксидаз также были проанализированы с использованием сервиса DeepLoc-1.0. Для предсказания локализации белка в клетке данная программа использует подход, основанный не на поиске известных сигнальных последовательностей, а на машинном обучении [22]. С использованием данного алгоритма в качестве наиболее вероятного варианта локализации полиаминоксидазы дрожжей К. рка^И XP_002494272.1 (ген KpFMS2) были предсказаны пероксисомы.
Дрожжи К. рка^й, исследуемые в данной работе, относятся к метилотрофам, которые способны использовать метиловый спирт в качестве единственного источника углерода и энергии. Первые реакции пути утилизации метанола происходят в пероксисомах, что также связано с образованием перекиси водорода при окислении метанола до формальдегида алкогольоксида-зами [23]. Анализ генома К. рка$11 показал, что у этого вида дрожжей идентифицированы два несцепленных гена полиаминоксидаз KpFMS1 и KpFMS2. При этом
один из них (KpFMS2) расположен рядом с геном ал-когольоксидазы 1 (AOX1). Гены KpFMS2 и AOX1 располагаются «голова к голове» (head to head), и их про-моторные области могут перекрываться (рис. 3), что может влиять на регуляцию транскрипции KpFMS2.
■II
-843 -791
-620 -573 -293 -257
Ген AOX1
Ген КрРМЭ2
-1 -98 -150 -321 -368 -648 -684 -941
□ — Сайты связывания белка Мхг1 ■ — Участки связывания белка Ыгд1
□ — Матричная цепь
Рис. 3. Взаимное расположение генов KpFMS2 и АОХ1 К. рНа//И. Показаны сайты связывания транскрипционных факторов Mxг1p и Nгg1p, являющихся основными регуляторами промотора гена АОХ1
3. Сравнительное изучение экспрессии генов KpFMS1 и KpFMS2 у дрожжей К. phaffii
Для исследования регуляции активности промоторов генов полиаминоксидаз были получены штаммы РРМ81-4-08115 и РРМ82-4-08115, которые содержат в своих геномах последовательность репортерного гена кислой фосфатазы РНО5 под контролем промоторов генов полиаминоксидаз. Для сравнения активности промоторов генов KpFMS2 и AOXl был также использован полученный ранее [14] штамм 1x2-4-08115, содержащий ген РНО5 под контролем промотора гена AOXl. Штаммы высевали в серии разведений на твердые среды с различными источниками углерода и азота. В качестве источников углерода использовали глицерин и метанол. В качестве источников азота использовали сульфат аммония. Отдельно использовали полную среду YEPD, содержащую глюкозу, дрожжевой экстракт и пептон. Результаты качественного анализа активности репортерного гена РНО5 у штаммов РРМ81-4-08115, РРМ82-4-08115 и 1г2-4-08115 представлены на рис. 4.
На среде YEPD, где в качестве источника углерода используется глюкоза, а источником азота являются смесь аминокислот и олигопептидов, наблюдается активность промотора гена KpFMS2. В этих условиях активности промотора гена KpFMSl не было обнаружено, а экспрессии гена АОХ1, как и следовало ожидать [24], не происходит.
На средах с глицерином в качестве источника углерода промоторы генов полиаминоксидаз неактивны. Экспрессия гена АОХ1 на таких средах была репрессирована глицерином.
На среде с метанолом в качестве источника углерода промоторы генов KpFMS2 и АОХ1 активны. Активности промотора гена KpFMSl не было обнаружено.
ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что дупликации играют важную роль в эволюции живых организмов. Дупликации создают дополнительные копии генетического материала и вносят значительный вклад в создание разнообразия геномов. Судьба дуплицированных генов может быть различной. Мутации могут накапливаться как в структурной, так
Среды
YEPD MGlyc MMet
PFMS1-4-GS115
ы
I PFMS2-4-GS115
св
□ ^2-4^115 (PAOX1-PHO5)
Рис. 4. Активность репортерной кислой фосфатазы штаммов К. phaffii РРМ81-4-08115, РРМ82-4-08115 и 1г2-4-08115 при росте на средах с различными источниками углерода и азота
и в регуляторной частях. В результате в ходе эволюции с дуплицированными генами могут происходить следующие процессы: 1) сохранение, при котором две копии гена сохраняют функцию предкового гена, 2) неофунк-ционализация, при которой один из генов развивает новую функцию, тогда как другой сохраняет функцию предкового гена, 3) субфункционализация, в случае которой две копии развивают различные функции и работают совместно для того, чтобы компенсировать функцию предкового гена, и 4) специализация, когда две копии развивают различные функции, и при этом их общая функция также отличается от предковой функции (то есть здесь объединяются процессы неофункциона-лизации и субфункционализации) [25, 26]. Кроме того, за счет изменения регуляторных областей структурные гены могут становиться частью других регулонов, отвечая на новые сигналы за счет взаимодействия с новыми регуляторными факторами.
В данной работе впервые проведен биоинфор-матический анализ распространенности полиамин-оксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina (отдел Ascomycota). Продемонстрировано, что у всех исследуемых видов присутствуют полиаминоксидазы и соответствующие гены, однако их копийность различна. Показано, что количество копий коррелирует с систематическим положением исследуемых видов. Интересно, что представители семейства Saccharomycetaceae, к которому относятся дрожжи S. cerevisiae, а также родственных семейств Ascoideaceae и Phaffomycetaceae имеют только один ген полиаминоксидазы. При этом предки S. cerevisiae в ходе эволюции претерпели полногеномную дупликацию [27]. Таким образом, один из двух генов полиаминоксидаз, образовавшихся в ходе дупликации у S. cerevisiae, в дальнейшем был утрачен, и данному виду дрожжей достаточно активности одного гена.
В то же время у представителей других семейств подотдела Saccharomycotina сохранились два или даже три гена полиаминоксидаз. Последовательности эти генов сильно дивергировали, а кодируемые ими белки предположительно характеризуются различной внутриклеточной локализацией. У большинства проанализированных видов, представителей семейств Debaryomycetaceae, Metschnikowiaceae, Pichiaceae и клады Yarrowia, одна из полиаминоксидаз (группы ПАО2.2 и ПАО3.2) содержит последовательность, направляющую ее в пероксисомы. Белки дрожжей B. inositovora, Metschnikowia sp. и Ogataea parapolymorpha, относящиеся к данным группам полиаминоксидаз, несут на С-конце последовательности, которые хотя и не соответствуют консенсусной последовательности РТ81 S. cerevisiae, но очень близки к ней. Дальнейший анализ их локализации может расширить набор известных для дрожжей сигналов РТ81, направляющих белки в пероксисомы.
Обнаруженные различия в представленности генов полиаминоксидаз могут быть связаны с особенностями метаболизма различных видов дрожжей. В этом отношении особенно интересно изучение регуляции генов полиаминоксидаз у метилотрофных дрожжей K. phaffii. Эти дрожжи способны использовать метиловый спирт в качестве единственного источника углерода и энергии. Алкогольоксидаза катализирует первую реакцию метаболизма метанола. Этот фермент работает внутри пероксисом, поскольку его активность сопряжена с образованием токсичного для клетки побочного продукта — перекиси водорода. Ген алкогольоксидазы 1 строго регулируется источником углерода в среде. На средах с глюкозой и глицерином наблюдается его репрессия, а на среде с метанолом происходит активация промотора данного гена [24]. Транскрипционный активатор Мхг1р является основным регулятором активности промотора гена АОХ1 [28].
В представленной работе показано, что один из двух генов полиаминоксидаз K. phaffii KpFMS2 расположен рядом с геном АОХ1 «голова к голове». Сайты связывания белка Mxr1 5'-CYCC-3' [29] распределены по всей области между кодирующими последовательностями генов KpFMS2 и АОХ1 и находятся на разных цепях (см. рис. 3). Белок Nrg1p обеспечивает репрессию гена АОХ1 у K. phaffii при наличии глицерина и глюкозы в среде [30]. Одна из областей, с которой взаимодействует Nrg1p, расположена вблизи кодирующей последовательности гена KpFMS2, вторая — вблизи гена АОХ1 (см. рис. 3). Таким образом, промоторные области данных генов могут перекрываться, а сами они иметь сходные элементы регуляции.
В данной работе было впервые показано, что промотор гена KpFMS2 (перекрывающийся с промотором гена АОХ1 и обеспечивающий транскрипцию в противоположном направлении) функционирует на средах с метанолом. Уровень его активности был заметно меньше, чем у промотора гена АОХ1. Так же, как и промотор гена АОХ1, промотор гена KpFMS2 был неактивен на средах с глицерином в качестве источника углерода. Но в то же время этот промотор был активен на среде YEPD. То есть в отличие от промотора гена АОХ1, его работа не подавляется глюкозой при росте K. phaffii на данной среде.
Таким образом, ген KpFMS2 в результате хромосомных перестроек оказался сцепленным с геном АОХ1. Данный ген сохраняет свои особенности регуляции, но на средах с глицерином и метанолом его промотор регулируется сходно с промотором гена АОХ1 и других генов метаболизма метанола, составляющих MUT-ре-гулон. С одной стороны, это может являться побочным эффектом необычайно высокой активности промотора гена АОХ1. Известно, что эукариотические промоторы могут обеспечивать транскрипцию длинных некодирую-
щих РНК (long noncoding RNAs) [31]. С другой стороны, вовлечение гена KpFMS2 в MUT-регулон могло быть закреплено в ходе эволюции. В пользу этого предположения свидетельствует близость группы полиамин-оксидаз ПАО3.3, куда относится белок, кодируемый геном KpFMS2, группе ПАО3.2, куда входят белки, несущие сигналы PTS1. И, хотя сам белок KpFms2 K. phaffii такой последовательности не содержит, с помощью сервиса DeepLoc-1.0 для него предсказывается локализация в пероксисомах. Гены MUT-регулона активны при росте K. phaffii на средах с метанолом, когда в клетках этих дрожжей наблюдается активная сборка и работа пероксисом. Вовлечение гена KpFMS2 в MUT-регулон, вероятно, оказалось выгодно и было отобрано в ходе эволюции.
Активности промотора гена KpFMS1 в исследованных условиях не наблюдали. Это может быть следствием того, что этот промотор либо неактивен совсем, либо активируется в специфических условиях. Дальнейшее изучение функций и регуляции экспрессии генов полиаминоксидаз у K. phaffii важно как с теоретической точки зрения для понимания эволюции дуплицированных генов, так и с практической, в связи с огромной значимостью этих дрожжей и промоторов генов MUT-регулона для биотехнологии.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 18-34-00750 мол_а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wallace HM, Fraser AV, Hughes A. A perspective of po-lyamine metabolism. Biochem J. 2003;376(Pt 1): 1 -14. https://doi.org/10.1042/BJ20031327.
2. Miller-Fleming L, Olin-Sandoval V, Campbell K, Ralser M. Remaining mysteries of molecular biology: the role of polyamines in the cell. J Mol Biol. 2015;427(21 ):3389-3406. https://doi.org/10.1016/j. jmb.2015.06.020.
3. Wallace HM. Polyamines: specific metabolic regulators or multifunctional polycations? Biochem Soc Trans. 1998;26(4):569-571. https://doi.org/10.1042/ bst0260569.
4. White WH, Gunyuzlu PL, Toyn JH. Saccharomy-ces cerevisiae is capable of de novo pantothenic acid biosynthesis involving a novel pathway of beta-alanine production from spermine. J Biol Chem. 2001;276(14):10794-10800. https://doi.org/10.1074/ jbc.M009804200.
5. Chattopadhyay MK, Tabor CW, Tabor H. Spermidine but not spermine is essential for hypusine biosynthesis and growth in Saccharomyces cerevisiae: spermine is converted to spermidine in vivo by the FMS1-amine oxidase. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(24):13869-74. https://doi.org/10.1073/pnas.1835918100.
6. Polticelli F, Salvi D, Mariottini P, et al. Molecular evolution of the polyamine oxidase gene family in Metazoa. BMC Evol Biol. 2012; 12:90. https://doi. org/10.1186/1471-2148-12-90.
7. Reumann S, Ma C, Lemke S, Babujee L. AraPerox. A database of putative Arabidopsis proteins from plant peroxisomes. Plant Physiol. 2004;136(1):2587-2608. https://doi.org/10.1104/pp.104.043695.
8. Valdes-Santiago L, Cervantes-Chavez JA, Leon-Ramirez CG, Ruiz-Herrera J. Polyamine metabolism in fungi with emphasis on phytopathogenic species. J Amino Acids. 2012;2012:837932. https://doi. org/10.1155/2012/837932.
9. Landry J, Sternglanz R. Yeast Fms1 is a FAD-utilizing polyamine oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 2003;303(3):771-776. https://doi.org/10.1016/ s0006-291x(03)00416-9.
10.Altschul SF, Gish W, Miller W, et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990;215(3): 403-410. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05) 80360-2.
11.Kumar S, Stecher G, Li M, et al. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 2018;35(6):1547-1549. https:// doi.org/10.1093/molbev/msy096.
12. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994;22(22):4673-4680. https:// doi.org/10.1093/nar/22.22.4673.
13. Le SQ, Gascuel O. An improved general amino acid replacement matrix. Mol Biol Evol. 2008;25(7): 1307-20. https://doi.org/10.1093/molbev/msn067.
14. Rumjantsev AM, Bondareva OV, Padkina MV, Sam-buk EV. Effect of nitrogen source and inorganic phosphate concentration on methanol utilization and PEX genes expression in Pichia pastoris. Scientific World Journal. 2014;2014:743615. https://doi. org/10.1155/2014/743615.
15.Guthrie C, Fink GR. Guide to yeast genetics and molecular biology. Methods Enzymol. 1991; 194: 1-863. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(00)x 0276-5.
16.Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 1983;166(4):557-580. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(83)80284-8.
17. Wu S, Letchworth GJ. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pre-treated with lithium acetate and dithiothreitol. Biotechniques. 2004;36( 1): 152-154. https://doi. org/10.2144/04361DD02.
18. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). — М.:
Наука, 1981. - 288 с. [Osterman LA. Metody issle-dovaniya belkov i nukleinovykh kislot. Elektroforez i ul'tratsentrifugirovaniye (prakticheskoye posobiye). Moscow: Nauka; 1981. 288 p. (In Russ).]
19. Самсонова М.Г., Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. -1975. - Т. 11. - № 9. - С. 104-115. [Samso-nova MG, Padkina MV, Krasnopevtseva NG. Ge-netiko-biokhimicheskoye izucheniye kislykh fosfataz drozhzhey Saccharomyces cerevisiae. Genetika. 1975;11(9):104-115. (In Russ.)]
20. Shen XX, Zhou X, Kominek J, et al. Reconstructing the backbone of the Saccharomycotina yeast phy-logeny using genome-scale data. G3 (Bethesda). 2016;6(12):3927-3939. https://doi.org/10.1534/ g3.116.034744.
21. Notzel C, Lingner T, Klingenberg H, Thoms S. Identification of new fungal peroxisomal matrix proteins and revision of the PTS1 consensus. Traffic. 2016;17(10):1110-1124. https://doi.org/10.1111/tra.12426.
22. Almagro Armenteros JJ, Sonderby CK, Sonder-by SK, et al. DeepLoc: prediction of protein subcel-lular localization using deep learning. Bioinformatics. 2017;33(21):3387-3395. https://doi.org/10.1093/bio-informatics/btx431.
23. Ellis SB, Brust PF, Koutz PJ, et al. Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 1985;5(5):1111-21. https://doi.org/10.1128/mcb.5.5.1111.
24. Tschopp JF, Brust PF, Cregg JM, et al. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. Nucleic Acids Res. 1987;15(9):3859-76. https://doi.org/10.1093/nar/15.9.3859.
25. Assis R, Bachtrog D. Neofunctionalization of young duplicate genes in Drosophila. Proc Natl Acad Sci. 2013;110(43):17409-17414. https://doi.org/10.1073/ pnas.1313759110.
26. He X, Zhang J. Rapid subfunctionalization accompanied by prolonged and substantial neofunc-tionalization in duplicate gene evolution. Genetics. 2005;169(2):1157-1164. https://doi.org/10.1534/ge-netics.104.037051.
27.Kellis M, Birren BW, Lander ES. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 2004;428(6983):617-624. https://doi.org/10.1038/ nature02424.
28. Lin-Cereghino GP, Godfrey L, de la Cruz BJ, et al. Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 2006;26(3):883-897. https://doi. org/10.1128/MCB.26.3.883-897.2006.
29. Kranthi BV, Kumar R, Kumar NV, et al. Identification of key DNA elements involved in promoter recognition
by Mxrlp, a master regulator of methanol utilization pathway in Pichia pastoris. Biochim Biophys Acta. 2009; 1789(6-8):460-468. https://doi.org/l0.1016/j. bbagrm.2009.05.004.
30. Wang X, Cai M, Shi L, et al. PpNrgl is a transcriptional repressor for glucose and glycerol repression of AOX1 promoter in methylotrophic yeast Pichia pasto-
ris. Biotechnol Lett. 2016;38(2):291-298. https://doi. org/l0.1007/s10529-015-1972-4.
31. Wilkinson D, Vachova L, Hlavacek O, et al. Long noncoding RNAs in yeast cells and differentiated subpopulations of yeast colonies and biofilms. Oxid Med Cell Longev. 2018;2018:4950591. https://doi. org/10.1155/2018/4950591.
* Информация об авторах
Алина Владиславовна Иванова — студентка 4-го курса кафедры генетики и биотехнологии. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: alinalans@ gmail.com.
Антон Витальевич Сидорин — бакалавр кафедры генетики и биотехнологии. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: antonsidorin@list.ru.
Елена Викторовна Самбук — д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. SPIN: 8281-8020. E-mail: e.sambuk@spbu.ru.
Андрей Михайлович Румянцев — канд. биол. наук, младший научный сотрудник кафедры генетики и биотехнологии. ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. SPIN: 9335-1184. E-mail: rumyantsev-am@mail.ru.
* Authors and affiliations
Alina V. Ivanova — 4th year Student of the Department of Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: alinalans@gmail.com.
Anton V. Sidorin - Bachelor of Science (BSc) in the Genetics and Biotechnology Department. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. E-mail: antonsidorin@list.ru.
Elena V. Sambuk — Doctor of Science, Professor of the Department of Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. SPIN: 8281-8020. E-mail: e.sambuk@ spbu.ru.
Andrei M. Rumyantsev — PhD, Senior Researcher of the Department of Genetics and Biotechnology. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia. SPIN: 9335-1184. E-mail: rumyantsev-am@mail.ru.
