CC BY
45
УДК 577.152.311/547.8/548.73
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ СТРУКТУРОЙ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ 3-ГИДРОКСИ-1,4-БЕНЗДИАЗЕПИН-2-ОНА И СТЕПЕНЬЮ ИХ ГИДРОЛИЗА КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗОЙ
Е.А. Шестеренко И. И. Романовская
О. В. Севастьянов Физико-химический институт им. А. В. Богатского
Е.А. Семенишина НАН Украины, Одесса
B. И. Павловский
C. А. Андронати
E-mail: romairina@gmail.com
Получено 31.10.2012
Осуществлен синтез ряда новых производных 7-бром-5-арил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-
2-она, содержащих в положении 3 фталимидоацильный и гексилацильный фрагменты. Структура соединений установлена методами масс-спектрометрии и спектроскопии ПМР. Впервые исследован гидролиз ранее синтезированных сложных эфиров 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она — потенциальных анксиолитических и снотворных средств, катализируемый карбоксилэстеразой микросомальной фракции печени свиньи. Показано количественное ингибирование эстеразной активности микросо-мальной фракции печени свиньи в присутствии селективного ингибитора карбоксилэстеразы-ди-(л-нитрофенил)-фосфата. Установлена нелинейность зависимости степени гидролиза от длины ацильного фрагмента 3-ацилокси-7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов, а также снижение степени трансформации субстрата при введении заместителя в положение 1 молекулы. Для производных с фталимидоацильным и гексилацильным фрагментами в положении 3 молекулы увеличение числа СН2-групп в этих заместителях и введение атома хлора в о-положение фенильного кольца приводит к увеличению степени гидролиза.
Ключевые слова: эфиры 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она, карбоксилэстераза, микросомальная фракция.
Карбоксилэстераза печени млекопитающих благодаря широкой субстратной специфичности и высокой стереоселективности [1] является перспективным биокатализатором энантиоселективного гидролиза и синтеза обширного ряда алициклических, кар-боциклических и гетероциклических соединений [2, 3].
Карбоксилэстераза обладает такими положительными свойствами, как отсутствие коэнзима и суицидальной инактивации, однако из-за нестабильности и высокой стоимости коммерческих препаратов целесообразно использовать ее в составе мик-росомальной фракции (МФ) печени свиньи.
Ранее нами было показано, что при помощи карбоксилэстеразы МФ возможно получение оптически чистых энантиомеров
3-ацилокси-1,4-бенздиазепин-2-онов [4], потенциальных анксиолитических и снотворных средств [5, 6].
Известно, что структура субстрата влияет на степень его гидролиза, катализируемого карбоксилэстеразой [7, 8], поэтому цель данной работы — исследование влияния заместителей в молекуле производных 1,4-бенздиазе-пин-2-она на степень их энзиматической трансформации с помощью МФ печени свиньи.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования использовали соединения 1-6 (табл. 1), полученные согласно [8], а также соединения III (7-11, табл. 1), синтезированные по схеме:
Фталимидные производные глицина и в-аланина получены по известной методике [9] сплавлением фталевого ангидрида с соответствующими аминокислотами, хлоран-гидриды II — обработкой тионилхлоридом соответствующих карбоновых кислот.
Спектры Н1-ЯМР записаны на приборе Bruker с рабочей частотой 300 МГц, в CDCl3 и DMSO-d6, внутренний стандарт TMS, при t 25 °С. Масс-спектры зарегистрированы методом электронного удара на масс-спектрометре МХ-1321 (ионизирующее напряжение 70 эВ, t камеры ионизации 200 °С) и методом FAB (fast atom bombardment) на масс-спектрометре 7070 EQ VG Analitikal (энергия пучка ксенона 6 эВ). Тонкослойная хроматография выполнена на пластинках Silufol UV-254, в системах ацетонитрил-хлоро-форм-гексан (1:1:3) и бензол-ацетонитрил-гексан-метанол (25:15:5:1), проявление — УФ-светом при X = 254 нм. Спектрофотометрические исследования проводили на приборе СФ-46.
В работе использовали МФ печени свиньи, выделенную методом низкоскоростной седиментации при 10 000 g в присутствии ионов Са2+ [10, 11]. В выделенной МФ определяли содержание протеина по методу Лоури в модификации Хартри [12], а также эстеразную активность (по 1-нафтилацета-ту) [13].
Влияние бис-(п-нитрофенил)-фосфата на энзиматическую активность МФ изучали, применяя в качестве субстрата 1-нафтилаце-тат в условиях, аналогичных таковым при изучении эстеразной активности энзима [13] в диапазоне концентраций ингибитора 0,03147,0 мкмоль/дм3.
7-Бром-5-фенил-3-фталимидоацетокси-
1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-он (10). В плоскодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, помещали 2 г (0,006 моль) 7-бром-3-гидрокси-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она, приливали 10 см3 безводного хлороформа и 0,4 см3 пиридина. Смесь перемешивали 10 мин при 0 °С, затем прибавляли суспензию 2-(1,3-диоксоизоин-долин-2-ил)этановой кислоты в 10 см3 безводного хлороформа. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч, оставляли на ночь, после чего промывали водой (20 см3 х 3), хлороформ упаривали, остаток перекри-сталлизовывали из этанола. Соединения 7-
9, 11 получены аналогичным образом.
Степень гидролиза сложных эфиров 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она 1-11 оценивали по их убыли спектрофотометрически гидроксаматным методом при X 540 нм [14].
Энзиматический гидролиз проводили в течение 2,5 ч в среде диметилсульфоксид: К-фосфатный буферный раствор (0,0167 моль/дм3, рН 7,0) в объемном отношении 2:3, при температуре 37 °С, концентрации субстратов 0,5 ммоль/дм3 и эстеразной активности МФ 100 ед/см3. За единицу естеразной активности принимали количество энзима, катализирующее гидролиз 1 мкмоль
1-нафтилацетата в 1 мин.
Результаты и обсуждение
Соединения 7-11 идентифицированы методами масс-спектрометрии и спектроскопии ПМР (табл. 1).
Из печени свиньи получена МФ с выходом протеина 38 мг/г ткани и эстеразной активностью 17,25 мкмоль/мг протеина-мин. С помощью выделенной МФ в разработанных условиях [8] осуществлен гидролиз ряда сложных эфиров 3-гидрокси-1,4-бенз-диазепин-2-она 1-11.
Для доказательства того, что в гидролизе исследуемых объектов не принимают участия другие энзимы МФ, исследовано ингибирование эстеразной активности мик-росомальной фракции селективным ингибитором карбоксилэстеразы ди-(п-нитрофе-нил)-фосфатом. Показано количественное ингибирование энзиматической активности МФ печени свиньи в присутствии ингибитора в концентрации 147,06 мкмоль/дм3.
Ранее был проведен энзиматический гидролиз ряда 3-ацилокси-7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов 1-4 с помощью карбоксилэстеразы в составе МФ:
R‘=H, R2 ~ СНз, С5Н1Ь С6Ніз, С7Н15; R3~ Н, СН3, С2Н5.
Изучено влияние ацильного фрагмента в молекуле исследуемых субстратов на степень их гидролиза [8]. Показано, что степень гидролиза этих субстратов с помощью микросомальной фракции носит нелинейный характер (табл.1), что может объясняться одновременным влиянием двух факторов — липофильности веществ и сте-рическими ограничениями встраивания в активный центр энзима, вызываемыми
увеличением длины ацильного фрагмента молекулы. Установлено, что введение алкильных заместителей в положение 1 бенз-диазепинового цикла приводит к снижению степени гидролиза в заданных условиях с 38,3% для соединения 1 до 29,3% — для 5 и 24,1% — для 6, соответственно (табл. 1).
В разработанных условиях осуществлен гидролиз ряда сложных эфиров 7-бром-5-арил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она 7-11, катализируемый карбоксилэсте-разой МФ печени свиньи, с образованием в качестве конечных продуктов соответствующих 3-гидроксипроизводных (табл. 2).
Таблица 1. Сложные эфиры 3-гидрокси-7-бром-5-арил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она
№ И1 И2 И3 Т °С Апл’ Вы- ход, % Масс- спек- тры, ПМР, мд Степень энзиматического гидролиза, %
СН алифатич. NH СН аром. С(3)- Н
1 Н СН3 Н 265-273 74 373* (БМ80-а6) 2,21 с 3Н (СН3)* 9,37* 7,10- 7,63* 6,03* 38,3*
2 Н С5Н11 Н 158-160 31 429* 2,57-2,62 м 2Н (ОСОСН2-(СН2)3-СН3) 1,73-1,79 пентет 2Н (ОСОСН2-СН2-(СН2)2-СН3) 1,35-1,36, м 4Н (ОСОСН2-СН2-(СН2)2-СН3) 0,88-0,92 т 3Н (СН3) * 9,53* 7,10- 7,64* 5,95* 53,2*
3 Н СбН13 Н 131-133 20 44*3 2,57-2,62 м 2Н (ОСОСН2-(СН2)4-СН3) 1,73-1,79 пентет 2Н (ОСОСН2-СН2-(СН2)2-СН3) 1,30-1,42 м 6Н (ОСОСН2-СН2-(СН2)3-СН3) 0,86-0,91 т 3Н (СН3) * 9,55* 7,10- 7,64* 5,95* 48,1*
4 Н С7Н15 Н 98-101 20 457* 2,58-2,64 м 2Н (ОСОСН2-(СН2)5-СН3) 1,71-1,80 пентет 2Н (ОСОСН2-СН2-(СН2)4-СН3) 1,30-1,41 м 8Н (ОСОСН2-СН2- (СН214-СН3) 0,87-0,91 т 3Н (СН3) * 9,26* 7,08- 7,63* 6,02* 46,1*
5 Н СН3 СН3 173-176 42,5 387* БМБО 3,36 с 3Н (ОСО-СН3), 2,20 с 3Н (СН3)* — 7,407,93 м 8Н* 5,81 с * 29,3
6 Н СН3 С2Н5 202-205 75 401* СН3С1 4,24-4,31 м 1Н (СН2), 3,71-3,78 м 1Н (СН2), 2,31 с 3Н (ОСО-СН3), 1,11-1,13 т 3Н (СН2-СН3)* — 7,337,70 м 8Н* 5,89 с* 24,1
7 С1 0х Н 143-150 24 [М+Н]+ 477 2,60-2,67; м 1Н (СО-СН) 1,28-2,16; м 10Н 9,36; с 7,087,61; м 6,01; с 31,0
8 С1 СГТ Н 90-92 25 [М+Н]+ = 519 [М+Ш]+ = 541 [М+К]+ = 557 4,30-4,44, м 2Н, (СН2)2 4,15-4,21 м 1Н, (СН2)2 4,04-4,11 м 1Н, (СН2)2 2,16-2,28; м 1Н (СО-СН) 1,10-1,83 м 10Н 9,67; с 7,137,60; м 7Н 4,96; с 38,3
9 С1 Н 258-260 76,8 [М+Н]+ = 552 4,70-4,85; кв 2Н (СН2) 9,59; с 7,157,90; м 6,06; с 23,8
10 Н о£т Н 249-256 82,6 [М+Н]+ = 518 4,71-4,87; кв 2Н (СН2) 9,97; с 7,197,91; м 6,01; с 0
11 Н ОЛ-Л Н 258-259 72,7 [М+Н]+ = 532 4,07-4,12 т 2Н (СН2СОО) 3,04-3,08; т 2Н ^СН2) 9,08; с 7,08-7,86;м 5,95; с 20,8
* [8]. 82
Таблица 2. Характеристики продуктов энзиматического гидролиза соединений 7—11
Субстрат Продукты гидролиза Масс-спектры, m/Z T. пл., °С
7-9 365 150-153
10, 11 If 332 219-220
Изучение степени гидролиза исследуемых субстратов позволило выявить некоторые закономерности. Так, показано, что введение атома С1 в о-положение фенильного кольца приводит к повышению степени трансформации соединения 9 по сравнению с 10 (табл. 1).
Увеличение числа СН2-групп в циклогек-силацильном (соединение 8 по сравнению с 7) и фталимидоацильном (соединение 11 по сравнению с 10) фрагментах молекулы также способствует возрастанию степени гидролиза субстратов. Это может объясняться стерическими затруднениями при взаимодействии с активным центром энзима субстратов с меньшим числом метиленовых групп между гидролизуемой группой и объемным циклическим заместителем. По-видимому, большая подвижность сложноэфирного фрагмента, связанная с увеличением числа СН2-групп, обеспечивает легкость встраивания в жесткий малый карман активного центра энзима [1].
Таким образом, с помощью ди-(п-нитро-фенил)-фосфата показано, что гидролиз производных 7-бром-5-арил-1,2-дигидро-3Н-
1,4-бенздиазепин-2-она с использованием микросомальной фракции печени свиньи катализируется карбоксилэстеразой. Установлено, что гидролитическая активность микросомальной фракции в отношении 3-ацилокси-7-бром-3-гидрокси-5-фенил-1,2-дигидро-3#-1,4-бенздиазепин-2-она носит нелинейный характер; введение заместителя в положение 1 бенздиазепинового цикла приводит к снижению степени гидролиза. Для производных с фталимидоацильным и цик логексилацильным фрагментами в положении 3 молекулы установлено, что увеличение числа СН2-групп в этих заместителях и введение атома хлора в о-положение фенильного кольца способствуют повышению степени гидролиза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hosokawa M. Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs // Molecules. — 2008. — V. 13, № 2. — P. 412-431.
2. Bornscheuer U. T., Kazlauskas R. J. Hydrolases in crganic synthesis. — Wienheim: Wiley-VCH, 2006. — 368 p.
3. Imai T., Hosokawa M. Prodrug approach using carboxylesterases activity: catalytic properties and gene regulation of carboxyle-sterase in mammalian tissue // J. Pesticide Sci. — 2010. — V. 35, N 3. — P. 229-239.
4. Шестеренко Е.А., Романовская И. И., Анд-ронати С. А. и др. Стереоселективный гидролиз 1-метил-5-фенил-3-ацетокси-7-бром-
1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она с помощью свободной и иммобилизованной микросомальной фракции печени свиньи // Доп. НАНУ. — 2011. — № 2. — С. 166-172.
5. Сівко Г. І., Кириченко І. М., Мальцев Г. В. та ін. Протисудомна активність складних
ефірів 3-гідроксифеназепаму при їх перо-ральному введенні // Одес. мед. журн. — 2006. — Т. 96, № 4. — С. 27-29.
6. Семенішина Е. А., Павловський В. І., Андронаті С. А. та ін. Синтез, структура, протисудомні властивості 7-бром-5-(2'-хлор)феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазе-пін-2-онів // Вісн. ОНУ, Сер. Хімія. — 2010. — Т. 14, № 3. — С. 44-57.
7. Zhu L. M. Applications of pig liver esterases (PLE) in asymmetric synthesis // Tetrahedron. — 1990. — V. 46, N 19. — P. 6587-6611.
8. Андронати С. А., Шестеренко Е. А., Севастьянов О. В. и др. Гидролиз сложных эфиров 7-бром-3-гидрокси-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-
1,4-бенздиазепин-2-она микросомальной фракцией печени свиньи // Вісн. ОНУ, Сер. Хімія. — 2008. — Т. 13, № 11. — С. 37-45.
9. Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов. — М.: Мир, 1965. — 815 с.
10. Andronati S., Semenishyna E., Pavlovsky V., Simonov Y. et al. Synthesis, structure and affinity of novel 3-alkoxy-1,2-dihydro-3H-1,4-
benzodiazepin-2-ones for CNS central and peripheral benzodiazepine receptors // Eur. J. Med. Chem. — 2010. — V. 45, N 4. — P. 1346-1351.
11. Eriksson L. С. Preparation of liver microso-mes with high recovery of endoplasmic reticulum and a low grade of contamination // Biochim. Biophys. Acta. — 1978. — V. 508, N 1. — P. 155-164.
12. Hartree E. F. Determination of protein: a modification of the Lowry method, that gives
a linear photometric response // Anal. Bio -chem. — 1972. — V. 48, N 2. — P. 422-427.
13. Yang S., Liu K., Guengerich P. Enantioselec-tive hydrolysis of oxazepam 3-acetate by esterases in human and rat liver microsomes and rat brain S9 fraction // Chyrality. — 1990. — V. 2. — P. 150-155.
14. Balls A K, Wood H. N. Acetyl chymotrypsin and its reaction with ethanol // J. Biol. Chem. — 1956. — V. 219, N 1. — P. 245-256.
ВЗАЄМОЗВ’ЯЗОК МІЖ СТРУКТУРОЮ ЕФІРІВ 3-ГВДРОКСИ-1,4-БЕНЗДІАЗЕПШ-2-ОНУ ТА СТУПЕНЕМ ЇХ ГІДРОЛІЗУ КАРБОКСИЛЕСТЕРАЗОЮ
Є. А. Шестеренко
1.1. Романовська О. В. Севастьянов К. О. Семенішина В. І. Павловський С. А. Андронаті
Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, Одеса
Е-mail: romairina@gmail.com
Здійснено синтез ряду нових похідних 7-бром-5-арил-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-
2-ону, що містять у положенні 3 фталімідо-ацильний і гексилацильний фрагменти. Структуру сполук встановлено методами мас-спектрометрії та спектроскопії ПМР. Уперше досліджено гідроліз раніше синтезованих складних ефірів 3-гідрокси-7-бром-5-арил-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону — потенційних анксіолітичних і снодійних засобів, що каталізується карбоксилестеразою у складі мікросомальної фракції печінки свині. Показа но кількісне інгібування естеразної активності мікросомальної фракції печінки свині в присутності селективного інгібітора карбок-силестерази — ди-(л--нітрофеніл)-фосфату. Встановлено нелінійність залежності ступеня гідролізу від довжини ацильного фрагмента в 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-
1,4-бенздіазепін-2-онах, а також зниження ступеня трансформації субстрату в разі введення замісника в положення 1 молекули. Для похідних з фталімідоацильним і гексилациль-ним фрагментами в положенні 3 молекули збільшення числа СН2-груп в цих замісниках і введення атому хлору в о-положення фенільно-го кільця сприяє підвищенню ступеня гідролізу.
Ключові слова: ефіри 3-гідрокси-1,4-бенздіа-зе пін-2-ону, карбоксилестераза, мікросо маль -на фракція.
INTERRELATION BETWEEN 3-HYDROXY-
1,4-BENZODIAZEPINE-2-ONE ESTERS STRUCTURE ON THEIR HYDROLYSIS BY CARBOXYL ESTERASE
E. A. Shesterenko
1.1. Romanovska O. V. Sevastyanov E. A. Semenishina V. I. Pavlovsky
S. A. Andronati
Bogatsky’s Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odesa
Е-mail: romairina@gmail.com
The synthesis of new series of 7-bromo-5-aryl-1,2-dihydro-3H-1,4-benzdiazepine-2-one derivatives, containing in the tree position phthalimidoacyl and hexylacyl fragments was accomplished. The structure of new compounds was proved by mass-spectrometry and PMR-spectroscopy methods. For the first time, hydrolysis of the earlier synthesized 3-hydroxy-7-bromo-5-aryl-1,2-dihydro-3H-1,4-benzdi-azepine-2-one esters, potential anxiolytic and hypnotic means, catalyzed by carboxyl esterase in composition of pig liver microsomal fraction was studied. The quantitative inhibition of pig liver microsomal fraction esterase activity in the presence of carboxyl esterase selective inhibitor di-(p-nitrophenyl)-phosphate was shown. The nonlinear dependence both of hydrolysis degree with acyl moiety length in 3-acyloxy-7-bromo-5-aryl-1,2-dihydro-3H-1,4-benzdiazepine-2-ones and
decreased substrate transformation degree after substituent introduction in the first position of molecule was established. For the derivatives with phthalimidoacyl and hexylacyl-moieties in the molecule 3 position it was shown, that increasing of CH2-groups number in this substituents and incorporation of chlorine atom in o-position of phenyl ring bring to increasing of hydrolysis degree.
Key words: 3-hydroxy-1,4-benzdiazepine-2-one esters, carboxyl esterase, microsomal fraction.
