CC BY
43
УДК 577.152.311/547.8/548.73
ВИДІЛЕННЯ І ХАРАКТЕРИСТИКА КАРБОКСИЛЕСТЕРАЗИ ПЕЧІНКИ СВИНІ ТА ЇЇ ВИКОРИСТАННЯ У СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНОМУ ГІДРОЛІЗІ ПОХІДНИХ 1,4-БЕНЗДІАЗЕПІН-2-ОНУ
С. А. Андронаті Є. А. Шестеренно
О. В. Севастьянов Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського
1.1. Романовська НАН України, Одеса
В. І. Павловський К. О. Семенішина
В. Є. Осетров
Е-таіІ: [email protected]
Оскільки комерційні препарати карбоксилестерази печінки свині є високовартісними, розроблення простих і доступних методів отримання карбоксилестерази для використання у стереоселек-тивному гідролізі нових естерів 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону є актуальним завданням. Створено ефективний і доступний метод виділення карбоксилестерази з мікросомальної фракції печінки свині з виходом за протеїном 2,24 мг/г тканини і естеразною активністю 149 мкмоль/хв на 1 мг протеїну. З використанням нативного електрофорезу в препараті карбоксилестерази виявлено 19 протеїнових фракцій, 11 з яких (73 % від загального протеїну) мають естеразну активність. Уперше за допомогою карбоксилестерази мікросомальної фракції печінки свині проведено стереоселективний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону з отриманням Я-енан-тіомера субстрату.
Ключові слова: карбоксилестераза, мікросомальна фракція, печінка свині, електрофорез,
ди-(п-нітрофеніл)фосфат, енантіоселективний гідроліз, 3-ацилокси-1,4-бенздіазепін-2-они.
Карбоксилестераза (КФ 3.1.1.1) локалізована переважно в ендоплазматичному ретику-лумі гепатоцитів [1] і відповідає за метаболізм та активацію структурно різноманітних лікарських речовин і проліків, що мають у своєму складі естерну або амідну групи [2, 3].
Ензим має широку субстратну специфічність [4, 5] і високу стереоселективнісь, тому є перспективним як каталізатор стереосе-лективного гідролізу або синтезу органічних сполук [6], у тому числі естерів 3-гідрокси-
1,4-бенздіазепін-2-ону — потенційних анксіолітиків і гіпноседативних лікарських засобів.
Частково очищені препарати карбоксилестерази отримують з мікросомальної фракції клітин печінки свині, яку виділяють методом ультрацентрифугування при 105 000 g [7], або з печінки у вигляді ацетонових порошків [8], що потребує застосування дорогого обладнання або значної кількості токсичних розчинників (більше 10 дм3 ацетону), тривалого проведення процесу в умовах низьких температур (-30 °С).
Відомо, що препарати карбоксилестера-
зи, як високо- так і частково очищені, складаються з низки ізоформ ензиму, однак ці ізоформи мають подібну специфічність і їх можна використовувати в стереоселективно-му гідролізі й синтезі як один ензим [9].
Оскільки стереоселективність карбоксил-естерази печінки свині стосовно нових есте-рів 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-ону не вивчено, метою цієї роботи було розроблення доступного й ефективного способу отримання частково очищеного препарату карбокси-лестерази печінки свині (КЕПС), дослідження його властивостей як каталізатора енантіоселективного гідролізу 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, який має високу спорідненість до центральних бенздіазепінових рецепторів ЦНС.
Матеріали і методи
Мікросомальну фракцію (МФ) печінки свині одержували методом низькошвидкіс-ної седиментації в присутності іонів Са2+ [10], модифікованим відповідно до [11]. Виділену
МФ (концентрація протеїну 12,5 мг/см3) інкубували в присутності 0,1 М Na4P2O7 (рН 8,0) і 0,1 М ЕДТА за перемішування впродовж 30 хв при 37 °С, охолоджували до
0 °С і центрифугували 30 хв за 17 000 об/хв. До супернатанту додавали сульфат амонію до 70% насичення при перемішуванні (0 °С), після чого центрифугували в аналогічних умовах. Осад ресуспендували у трис-HCl буферному розчині (0,01 М, рН 8,0), що містив 0,5 М КС1, потім розчин насичували сульфатом амонію в тих самих умовах до 45%
1 центрифугували при 17 000 об/хв 30 хв, після чого насичували отриманий супернатант до 70% і центрифугували в аналогічних умовах. Осад реекстрагували за 45% насичення сульфатом амонію і екстракт переосаджу-вали насиченням до 70%. Одержані осади розчиняли у трис-HCl буферному розчині (0,01 М, рН 8,0) й об’єднували; сумарну фракцію (45-70% насичення) діалізували проти того самого буферного розчину при 0 °С.
У виділеному препараті карбоксилестерази визначали вміст протеїну за методом Лоурі в модифікації Хартрі [12] та естеразну активність (за 1-нафтилацетатом) [13].
Фракційний склад препарату КЕПС досліджували методом SDS-електрофорезу в 10% -му поліакриламідному гелі (ПААГ) в системі Леммлі на приладі Helicon, Росія. Забарвлювання здійснювали з використанням барвника Кумасі R-250.
Нативний електрофорез виконували в 10% ПААГ за Орнстейн і Девіс [14]. Одну частину гелю забарвлювали Кумасі R-250 для прояву протеїнових фракцій. Іншу — обробляли субстратом карбоксилестерази для виявлення ензиматичної активності.
Вплив селективного інгібітора карбоксилестерази ди-(п-нітрофеніл)-фосфату, синтезованого відповідно до [15], визначали в діапазоні концентрацій від 0,88 до 180 мкМ.
Ступінь гідролізу 1-метил-5-феніл-3-аце-токси-7-бром-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазе-пін-2-ону оцінювали за зменшенням кількості естерних груп спектрофотометрично гідроксаматним методом при X 540 нм [16]. Ензиматичний гідроліз 1-метил-5-феніл-3-ацетокси-7-бром-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенз-діазепін-2-ону проводили протягом 2,5 год у розчині диметилсульфоксид : К-фосфатний буфер, 0,0167 М, рН 7,0, в об’ємних співвідношеннях 2 : 3, за температури 37 °С і есте-разної активності ензиму 100 Од/см3. За одиницю естеразної активності приймали кількість ензиму, що каталізує гідроліз 1 мкмоль 1-нафтилацетату за 1 хв.
Результати та обговорення
Нами розроблено доступний спосіб виділення препарату карбоксилестерази, що полягає в отриманні МФ печінки методом низькошвидкісної седиментації з використанням Са2+, подальшою екстракцією ензиму розчином пірофосфату натрію і фракціонуванням сульфатом амонію.
Показано, що заміна часткової солюбіліза-ції мембран МФ дезоксихолатом натрію на екстракцію пірофосфатом натрію спричинила збільшення виходу за протеїном, підвищення естеразної активності виділеного ензиму (табл. 1), що, можливо, зумовлено не тільки поверхнево-активними властивостями пірофосфату, але й високою іонною силою його розчину. Це дало змогу більш селективно екстрагувати кар-боксилестеразу з мікросомальних мембран.
Таблиця 1. Характеристики виділених препаратів КЕПС
Екстрагент Вихід протеїну, мг/г тканини Естеразна активність, Од/мг
Пірофосфат натрію 2,24±0,07 149,0±5,8
Дезоксихолат натрію 0,20±0,01 38,4±1,2
Вміст фосфоліпідів у препараті знижено в 5 разів порівняно з МФ.
Основні етапи виділення карбоксилесте-рази за допомогою пірофосфату натрію наведено в табл. 2. Встановлено, що додаткове пе-реосадження осаду, отриманого після 45% насичення сульфатом амонію, сприяло збільшенню виходу за загальною естеразною активністю препарату сумарної фракції з 110103 до 137,9103 Од, тобто на 26%.
Виділений препарат карбоксилестерази повністю зберігав ензиматичну активність протягом 6 міс при -10 °С у 0,01 М трис-НСІ буферному розчині, рН 8,0.
Методом SDS-електрофорезу проведено дослідження протеїново-фракційного складу препарату КЕПС (рис. 1).
Показано наявність 26 протеїнових фракцій, які можна об’єднати в 4 зони (табл. 3).
Протеїни з найменшою молекулярною масою розташовані в діапазоні з відносною електрофоретичною рухомістю 0,92-0,71 (№ 1-6). Частка протеїнів цієї зони в загальному спектрі — 18,2%. Основна фракція (№ 2) має молекулярну масу 14,4 кДа. Протеїни другої зони (№ 7-13) мають електрофоретичну рухомість від 0,68 до 0,51. Питома частка їх у загальному спектрі — 24,2%. Середня молекулярна маса протеїнів — близько 30 кДа.
Таблиця 2. Характеристика етапів виділення карбоксилестерази з печінки свині
Препарат Об’єм, см3 протеїну Загальна активність Питома активність, Од/мг
мг % Од1О3 Вихід, %
Гомогенат 1513 851ОО 1ОО 255,3 1ОО,О 3,О
Супернатант 9000 g 3331 635ОО 74,6 222,3 86,7 3,5
Мікросомальна фракція 277 135ОО 15,9 174,2 67,6 12,9
Фракція після екстракції №4Р207 2116 42ОО 4,9 149,5 58,1 35,6
Фракція ^Н4)2Я04 (45-70%) 52 74О О,9 11О,О 42,7 148,7
Фракція об’єднана* 6О 87О 1,О 137,9 53,8 158,5
* Складається з фракції (N^^04 (45-70%) та фракції, що додатково отримана переосадженням осаду ^Н4)2Б04 (0-45%).
кДа
33,1
27,9
15,1
Рис. 1. Електрофореграма препарату карбоксилестерази (SDS-електрофорез)
Перша і друга зони представлені, ймовірно, баластними протеїнами і продуктами деградації. Протеїни найбільш вираженої зони розташовані в діапазоні з 0,45-0,23 (№ 14-21). Їхня частка в спектрі — 43,1%. Протеїни з найбільшою молекулярною масою утворюють зону з рухомістю від 0,22 до
0,10 (№ 22-26). Частка протеїнів цієї зони в загальному спектрі становить 14,6%.
У виділеному препараті КЕПС фракції з молекулярною масою 52,5 ± 7,8 — 69,3 ± 7,6 кДа можуть відповідати субодиницям молекули КЕПС. Отримані результати узгоджуються з наведеними в літературі даними про структуру молекули КЕПС [9]; відомо, що М. м. комерційного препарату КЕПС становить 162-168 кДа, молекула ензиму складається з трьох субодиниць а, в і у з М. м. 58,2, 59,7 і 61,4 кДа, відповідно.
З використанням нативного електрофорезу (рис. 2) у препараті КЕПС виявлено 19 протеїнових фракцій, 11 з яких (73,0% від загального протеїну) виявляють естеразну активність (табл. 4).
А
WÊ МІ ■ Б
191817 161514 ІЗ 12 II 109 8 7 6 5 4 3 2 і № фракції
Рис. 2. Електрофореграми (нативний електрофорез) препарату карбоксилестерази:
(1-19 — номер фракції): А — естеразна активність фракції; Б — протеїнові фракції
Відомо, що селективним необоротним інгібітором карбоксилестераз є ди-(п-нітро-феніл)фосфат [9]. Нами показано, що активність ензиму повністю пригнічувалась ди-(п-нітрофеніл)фосфатом (180 мкМ), що підтверджує відсутність інших естераз.
Уперше за допомогою карбоксилестерази МФ в розроблених умовах (рН = 7,0, 37 °С, 2,5 год, концентрація ДМСО 40%) здійснено стереоселективний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону (рис. 3) з 50%-м ступенем трансформації.
У результаті проведення енантіоселек-тивного гідролізу рацемату 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону в суміші існують дві оптично активні сполуки (II і III).
Однак на відміну від наведених у літературі даних про більшу конформаційну стабільність заміщених по першому положенню 3-гідрокси-1,4-бенздіазепін-2-онів [17], нами було показано, що сполука II (структуру підтверджено методами ТШХ, УФ-спектроскопії та мас-спектрометрії) ра-цемізується в процесі гідролізу і наступного виділення.
Таблиця 3. Протеїнові фракції препарату карбоксилестерази печінки свині (SDS-електрофорез)
№ Rf Питома частка протеїнової фракції у спектрі, % Молекулярна маса, кДа
1 О,92 4,14 ±0,55 < 14,4
2 О,9О 7,20 ± 1,07 14,4 ± 3,0
3 О,89 2,04 ± 0,57 15,1 ± 3,8
4 О,81 1,84 ± 0,71 18,4 ± 4,5
5 О,76 1,60 ± 0,48 21,0 ± 5,2
6 О,71 1,39 ± 0,37 23,4 ± 4,7
7 О,68 2,05 ± 0,23 25,1 ± 2,8
8 О,66 2,18 ± 0,35 27,7 ± 3,0
9 О,64 3,38 ± 0,35 27,9 ± 3,0
1О О,61 2,79 ± 0,20 27,9 ± 3,0
11 О,58 6,61 ± 0,90 33,1 ± 3,5
12 О,55 3,03 ± 0,37 36,7 ± 4,0
13 О,51 4,13 ± 0,24 41,7 ± 4,5
14 О,45 2,92 ± 0,26 45,5 ± 5,0
15 О,41 3,16 ± 0,44 52,5 ± 7,8
16 О,38 3,00 ± 0,15 56,2 ± 6,2
17 О,35 5,46 ± 0,53 61,0 ± 6,7
18 О,33 18,58 ± 1,43 63,1 ± 7,0
19 О,29 4,10 ± 0,47 69,3 ± 7,6
2О О,26 3,97 ± 0,91 71,6 ± 7,8
21 О,23 1,91 ± 0,45 81,3 ± 10,0
22 О,22 2,10 ± 0,37 83,2 ± 10,0
23 О,19 9,08 ± 1,46 90,0 ± 10,0
24 О,15 0,97 ± 0,19 100,0 ± 12,0
25 О,13 0,34 ± 0,02 140,0 ± 16,8
26 О,1О 2,08 ± 0,09 300,0 ± 36,0
Таблиця 4. Фракційний склад і ензиматична активність виділеного препарату КЕПС (нативний електрофорез)
№ Rf Питома частка протеїнової фракції в спектрі, %
За протеїном За естеразною активністю
1 О,85 0,10±0,05 -
2 О,65 1,49±0,15 -
3 О,57 3,84±0,16 -
4 О,52 2,23±0,35 -
5 О,5О 3,83±0,13 -
6 О,47 4,32±0,33 -
7 О,44 7,08±0,15 -
8 О,42 4,28±0,33 -
9 О,38 3,62±0,19 0,74±0,33
1О О,33 7,69±0,22 12,57±0,72
11 О,28 10,04±0,71 13,02±1,34
12 О,23 6,22±0,33 11,84±0,64
13 О,21 3,90±0,27
14 О,18 6,23±0,26 9,50±0,93
15 О,15 5,32±0,40 11,04±1,06
16 О,12 15,40±0,39 17,36±1,42
17 О,О9 3,71±0,29 7,75±0,58
18 О,О7 2,31±0,16 7,63±0,73
19 О,О4 8,41±0,38 8,57±0,72
Рис. 3. Ензиматичний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону
Підтверджено збереження 8-енантіомера субстрату (III) в негідролізованій формі, встановлено його молекулярну і кристалічну структуру [а]п20 = 195,3° [18].
Отримані дані свідчать про більшу специфічність карбоксилестерази МФ печінки свині до R-енантіомера досліджуваного субстрату.
Таким чином, розроблено новий ефективний і доступний метод виділення карбокси-лестерази з мікросомальної фракції печінки свині. Методами вБв- і нативного електрофорезу вивчено протеїново-фракційний склад і активність отриманого ензимного препарату. Інгібування ензиму ди-(п-нітрофеніл)-фосфатом підтверджує його належність до сімейства карбоксилестераз. Уперше за допомогою карбоксилестерази мікросомальної фракції печінки свині здійснено енантіосе-лективний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-1-ме-тил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазе-пін-2-ону, отримано 8-енантіомер субстрату. Запропонований ензиматичний спосіб одержання енантіомерів естерів 1,4-бенздіазепін-2-ону є доступним і перспективним для на-працювання з метою дослідження їхніх фармакологічних властивостей.
ЛІТЕРАТУРА
1. Redinbo M. R., Bencharit S., Potter P. M. Human carboxylesterase 1: from drug metabolism to drug discovery // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — V. 31, N 1. — P. 620-624.
2. Hosokawa M. Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs // Molecules. — 2008. — V. 13, N 2. — P. 412-431.
3. Satoh T., Hosokawa M. Structure, function and regulation of carboxylesterases // Chem. Biol. Interact. — 2006. — V. 162, N 3. — P. 195-211.
4. Landowski C. P., Lorenzi P. L., Song X. et al. Nucleoside ester prodrug substrate specificity of liver carboxylesterase// J. Pharmacol. Exp. Ther. — 2006. — V. 316, N 2. — P.572-580.
5. Imai T., Hosokawa M. Prodrug approach using carboxylesterases activity: catalytic properties and gene regulation of carboxylesterase in mammalian tissue // J. Pesticide Sci. — 2010. — V. 35, N 3. — P. 229-239.
6. Bornscheuer U. T., Kazlauskas R. J. Hydrolases in organic synthesis. — Wienheim, Wiley-VCH, 2006. — 368 p.
7. Kleingeist B., Bocker R. Isolation and pharmacological characterization of microsomal human liver flumazenil carboxylesterase // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. — 1998. — V. 1, N 1. — P. 38-44.
8. Levy М., Ocken P. Purification and properties of pig liver esterase // Arch. Biochem. Biophys. — 1969. — V. 135, N 1. — P. 259-264.
9. Zhu L. M. Applications of pig liver esterases (PLE) in asymmetric synthesis // Tetrahedron. — 1990. — V. 46, N 19. — P. 6587-6611.
10. Kamath S. A., Narayan K. A. Interaction of Ca2+ with endoplasmic reticulum of rat liver: a standardized procedure for the isolation of rat liver microsomes // Anal. Biochem. — 1972. — V. 48, N 1. — P. 53-61.
11. Eriksson L. С. Preparation of liver micro-somes with high recovery of endoplasmic reticulum and a low grade of contamination // Biochim. Biophys. Acta. — 1978. — V. 508,N 1.— P. 155-164.
12. Hartree E. F. Determination of protein: a modification of the Lowry method, that gives a linear photometric response // Anal. Bio-chem. — 1972. — V. 48, N 2. — P. 422-427.
13. Yang S., Liu K., Guengerich P. Enantioselec-tive hydrolysis of oxazepam 3-acetate by esterases in human and rat liver microsomes and rat brain S9 fraction // Chyrality. — 1990. — V. 2. — P. 150-155.
14. Ермаков А И., Арасимович В. В., Ярош Н. П. и др. Методы биохимического исследования растений. — Л.: Агропромиздат, 1987. — 430 с.
15. Moffat J., Khorana H. Tetra-p-nitrophenyl pyrophosphate — a new phosphorylating agent // J. Amer. Chem. Soc. — 1957. — V. 79, N 14. — P. 3741-3746.
16. Balls A. K., Wood H. N. Acetyl chymotrypsin and its reaction with ethanol // J. Biol. Chem. — 1956. — V. 219, N 1. — P. 245-256.
17. Oswald P., Desmet K., Sandra P. et al. Determination of the enantiomerization
energy barrier of some 3-hydroxy-1,4-benzo-diazepine drugs by supercritical fluid chromatography // J. Chromatogr. B. — 2002. — V. 779, N 2. — P. 283-295.
18. Шестеренко Е. А., Романовская И. И., Анд-ронати С. А. и др. Стереоселективный гид-
ролиз 1-метил-5-фенил-3-ацетокси-7-бром-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она с помощью свободной и иммобилизованной микросомальной фракции печени свиньи // Доп. НАН України. — 2011. — № 2. —
С.166-172.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ ПЕЧЕНИ СВИНЬИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНОМ ГИДРОЛИЗЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1,4-БЕНЗДИАЗЕПИН-2-ОНА
С. А. Андронати, Е. А. Шестеренко,
О. В. Севастьянов, И. И. Романовская,
Е. А. Семенишина, В. И. Павловский,
В. Е. Осетров
Физико-химический институт им. А. В. Богатского НАН Украины, Одесса
Е-таіІ: [email protected]
Поскольку коммерческие препараты кар-боксилэстеразы печени свиньи являются дорогостоящими, разработка простых и доступных методов получения карбоксилэстеразы для использования в стереоселективном гидролизе новых эфиров 1,4-бенздиазепин-2-она является актуальной задачей. Создан эффективный и доступный метод выделения карбоксилэсте-разы из микросомальной фракции печени свиньи с выходом по протеину 2,24 мг/г ткани и эстеразной активностью 149 мкмоль/мин на
1 мг протеина. С использованием нативного электрофореза в препарате карбоксилэстеразы выявлено 19 протеиновых фракций, 11 из которых (73% от общего протеина) обладают эстеразной активностью. Впервые с помощью карбоксилэстеразы микросомальной фракции печени свиньи осуществлен стереоселектив-ный гидролиз 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она; получен Я-энантиомер субстрата.
Ключевые слова: карбоксилэстераза, микро-сомальная фракция, печень свиньи, электрофорез, ди-(л--нитрофенил)фосфат, энантиосе-лективный гидролиз, 1,4-бенздиазепин-2-оны.
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF PIG LIVER CARBOXYLESTERASE | AND ITS APPLICATION IN STEREOSELECTIVE HYDROLYSIS OF 1,4-BENZODIAZEPINE-2-ONE DERIVATIVES
S. A. Andronati, E. A. Shesterenko,
O. V. Sevastyanov, 1.1. Romanovska,
E. A. Semenishina, V. I. Pavlovsky,
V. E. Osetrov
A. V. Bogatsky’s Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odesa
Е-mail: [email protected]
Since the commercial preparations of pig liver carboxylesterase are expensive, the development of convenient and available methods of carboxylesterase isolation for usage in stereoselective hydrolysis of new 1.4-benzodiazepine-2-one esters is an essential task. An effective and convenient method for isolation of pig liver microsomal carboxylesterase with protein yield 2.24 mg/g tissue and esterase activity of 149 pmole min-1mg-1 protein is described in paper. With native electrophoresis usage, 19 protein fractions were found in carboxyl esterase preparation, 11 of which (73% of the total protein) possesses esterase activity. For the first time, using pig liver microsomal carboxyl esterase, the stereoselective 3-acetoxy-7-bromo-1-methyl-5 phenyl-1,2-dihydro-3H-1,4-benzodi-azepine-2-one hydrolysis was accomplished and thus S-enantiomer of substrate was obtained.
Key words: carboxyl esterase, microsomal fraction, pig liver, electrophoresis, di-(p-nitro-phenyl)phosphate, enantioselective hydrolysis,
1,4-benzodiazepine-2-ones.
