CC BY
103
ОГЛЯДИ
УДК 577.152.311/547.8/548.73
КАРБОКСИЛЭСТЕРАЗЫ В ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНОМ СИНТЕЗЕ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Е. А. ШЕСТЕРЕНКО, И. И. РОМАНОВСКАЯ, О. В. СЕВАСТЬЯНОВ, С. А. АНДРОНАТИ Физико-химический институт им. А. В. Богатского НАН Украины, Одесса E-mail: [email protected]
Получено 05.07.2012
В обзоре приведены классификация, структура и механизм каталитического действия карбоксилэстераз различного происхождения.
Показана перспективность использования карбоксилэстераз для изучения метаболизма и активации многих лекарственных веществ и пролекарств in vitro. Актуально также применение энзимов как биокатализаторов стереоселективного гидролиза и синтеза ряда сложных эфиров ациклических, карбоциклических и гетероциклических соединений. Установлено, что получаемые с помощью карбоксилэстеразы энантиомеры характеризуются высоким химическим выходом и оптической чистотой, а иммобилизация на различных носителях стабилизирует энзим и позволяет многократно использовать полученные биокатализаторы. Проведенные авторами исследования выявили особенности энзиматического гидролиза новых 3-ацилокси-1,4-бенздиазепин-2-онов — потенциальных анксиолитических и снотворных средств с помощью карбоксилэстеразы микросомальной фракции печени свиньи. С использованием свободной и иммобилизованной в гели филлофорина и альгината, стабилизированных Ca2+, микросомальной фракции впервые осуществлен энантиоселективный гидролиз 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она. Выделен S-энантиомер субстрата, что свидетельствует о большей специфичности карбоксилэстеразы микросомальной фракции печени свиньи к его R-энантиомеру.
Ключевые слова: карбоксилэстераза, микросомальная фракция печени свиньи,
стереоселективный синтез, 3-ацилокси-1,4-бенздиазепин-2-оны, иммобилизация.
Известно, что энантиомеры биологически активных веществ (БАВ), обладая подобными химическими и физическими свойствами, обладают существенными отличиями в фармакологической активности, что обусловлено уникальной способностью живого организма специфично включать их в те или иные метаболические процессы [1]. Поэтому представляет интерес получение и детальное исследование энан-тиомеров лекарственных веществ.
Поскольку методы асимметрического синтеза и разделения энантиомеров — самопроизвольная кристаллизация, использование оптически активных растворителей, получение диастереомеров, хроматография на хиральных стационарных фазах — сопряжены с определенными трудностями [2], перспективной является разработка
более доступных препаративных биотехнологических методов их получения.
Известно, что карбоксилэстеразы (КЭ) являются одними из наиболее изучаемых и активных энзимов для стереоселективно-го гидролиза и синтеза ряда ациклических, карбоциклических и гетероциклических соединений [3].
КЭ обладают такими преимуществами, как стабильность, отсутствие коэнзима, экономичность (в частности КЭ печени сельскохозяйственных животных, микробного происхождения) и др. Коммерческие препараты КЭ представляют собой смеси изоэнзимов, обладающих сходной стереоселективностью, что делает возможным их применение в асимметрическом синтезе в качестве «индивидуального» энзима [4].
Биологическая роль, структура и механизм каталитического действия карбоксилэстераз
КЭ (КФ З.1.1.1.) — сериновые а,Р-гидро-лазы, катализирующие гидролиз эфирной и амидной связей в молекулах различной структуры [5].
Энзимы этого семейства найдены практически у всех видов животных, растений, грибов и микроорганизмов. КЭ выявлены во многих органах, тканях и биологических жидкостях млекопитающих. В первую очередь они экспрессируются в эндоплазмати-ческом ретикулуме гепатоцитов, в меньшей степени — в тонком кишечнике, почках, легких, сердце, моноцитах и макрофагах [6]. Согласно существующей классификации карбоксилэстеразы млекопитающих (КЭМ) подразделяются на 5 основных групп (КЭМ1-КЭМ5) в соответствии с гомологией аминокислотной последовательности [5], причем большинство идентифицированных в настоящее время КЭМ принадлежит к семейству КЭМ1 или КЭМ2. Они, в свою очередь, могут быть разделены на пять подсемейств.
Семейство КЭМ1 включает основные формы изоэнзимов карбоксилэстеразы млекопитающих. Большинство членов этого семейства экспрессируются в печени. К семейству КЭМ1А принадлежат основные формы карбоксилэстеразы человека, обезьян и кроликов, к подсемействам КЭМ1В — основные изоформы карбоксилэстеразы крыс, хомяков, мышей, а к КЭМ1С — собак, кошек и свиней.
В семейство КЭМ2 входят карбоксилэсте-разы тонкого кишечника человека (КЭМ2А1), крыс (КЭМ2А10), мышей (КЭМ2А8), экспрессирующиеся преимущественно в тонком кишечнике [6].
Семейство КЭМЗ человека имеет около 40% идентичности аминокислотной последовательности как с КЭМ1, так и с КЭМ2 и экспрессируется в печени и ЖКТ. К этому семейству относится карбоксилэстеразопо-добный протеин (КЭМ4А2), который экскре-тируется с мочой. В семейство КЭМ5 входят изоэнзимы КЭМ, имеющие иную структуру по сравнению с изоформами других семейств КЭМ [7].
Основная биологическая роль карбоксил-эстераз млекопитающих — метаболизм ксенобиотиков. Энзим расщепляет сложноэфирные, амидные или тиоэфирные связи широкого спектра соединений, отличающихся по химической структуре [8].
Вторая биологическая роль карбоксилэстераз — трансформация холестерола и жирных кислот в печени и периферических тканях. КЭ является гидролазой сложных эфиров холестерола и ацил-КоА.
Карбоксилэстеразы человека, а также гомологи у других млекопитающих участвуют в синтезе тестостерона и метаболизме ретинола [6, 9].
Третья биологическая роль карбоксилэстераз — транспортировка и удерживание протеинов в эндоплазматическом ретикулуме. Карбоксилэстераза связывается с С-реактив-ным протеином (С-РП) и удерживает этот протеин до его высвобождения в цитоплазму, а также связывается в эндоплазматиче-ском ретикулуме с Р-глюкуронидазами — энзимами второй фазы метаболизма ксенобиотиков [10, 11].
Молекулярная масса коммерческих препаратов КЭМ составляет 162-168 кДа, молекула энзима состоит из 3 субъединиц с молекулярной массой около 60 кДа [7]. Структура КЭ человека 1 представлена на рис. 1.
Рис. 1. Структура карбоксилэстеразы человека 1:
Mol 1, Mol 2, Mol 3 — субъединицы энзима.
Каталитический домен, а/р-домен и регуляторный домен каждого из мономеров показаны синим, зеленым и красным цветом, соответственно [12]
В отличие от карбоксилэстераз млекопитающих, микробные карбоксилэстеразы классифицируют совместно с липазами и фосфолипазами [13]. Согласно существующей номенклатуре микробные эстеразы, так же как и КЭМ, в соответствии с гомологией аминокислотной последовательности подразделяются на 7 семейств. Карбоксилэстеразы являются представителями 4 из них (семейства V-VII).
К карбоксилэстеразам семейства V относятся энзимы мезофильных (Pseudomonas oleovorans, Haemophilus influenzae, Aceto-
bacter pasteurianus), психрофильных (Mo-raxella sp., Psychrobacter immobilis) и термофильных (Sulfolobus acidocaldarius) микроорганизмов. Они проявляют значительную гомологию (20-25%) с энзимами, не принадлежащими к подклассу эстераз, в частности с эпоксигидролазами и галопероксидазами [14].
К семейству VI принадлежат энзимы с достаточно низкой молекулярной массой (23-26 кДа), включая эстеразу из Pseudomonas fluorescens. КЭ активна в форме димера и содержит типичную каталитическую триаду Сер-Асп-Гис. У членов этого семейства выявлена 40%-я гомологичность с лизофосфолипазами эукариот.
КЭ семейства VII имеют значительную молекулярную массу (около 55 кДа) и проявляют высокую гомологичность с ацетил-холинэстеразами эукариот и КЭ тонкого кишечника или печени млекопитающих, например свиньи. К этому семейству относятся КЭ Arthrobacter oxydans и Bacillus sub-tilis. В семействе VIII наблюдается высокая гомологичность КЭ с Р-лактамазами класса С. Важнейшим представителем этого семейства является КЭ из Arthrobacter globiformis.
Как и в случае млекопитающих, карбо-ксилэстеразы микроорганизмов проявляют гидролитическую активность в отношении нескольких типов субстратов, включая различные алифатические и циклические сложные эфиры, ацил-CoA, производные аминокислоти др. [15].
Исследование метаболизма лекарственных веществ in vitro с помощью карбоксилэстеразы
Поскольку энантиомеры лекарственных средств (ЛС) могут существенно отличаться по своим фармакологическим свойствам, актуальной является задача детального исследования метаболизма лекарств и активации пролекарств, имеющих в своем составе оптически активный атом углерода, in vitro с использованием КЭ.
Так, КЭМ1 расщепляет связь метилового эфира в молекуле R-кокаина с образованием бензоилэкгонина — основного метаболита кокаина.
Карбоксилэстераза млекопитающих — единственный энзим, известный своей способностью образовывать токсичный метаболит кокаина — кокаэтилен, образующийся при совместном употреблении кокаина и этанола. КЭМ1 эффективно расщепляет 3-ацетильную связь, а также, в меньшей степени, 6-ацетильную связь в молекуле героина
с образованием моноацетилморфина и морфина, соответственно [в].
Карбоксилэстеразы печени человека катализируют гидролиз неполярных ЛС или сложных эфиров ксенобиотиков до более растворимых экскретируемых кислотных и спиртовых метаболитов. Так, меперидин гидролизуется до меперидиновой кислоты и этанола энзимом КЭМ1, но не КЭМ2. Гидролиз меперидина с помощью КЭМ1 связан со специфичностью этого энзима к сложным эфирам, содержащим простые алифатические спиртовые остатки [1в, 17].
Препарат иринотекан — противоопухолевое средство, используемое для лечения различных злокачественных новообразований, таких, в частности, как колоректальный рак. Иринотекан гидролизуется до 7-этил-гидроксикамптотецина-10 (SN-38), который оказывает противоопухолевое действие. Показано, что несколько карбоксилэстераз человека и грызунов гидролизуют ириноте-кан, но активность зависит от вида энзима. Компьютерное моделирование показало, что способность каждого энзима к активации иринотекана зависит от размера входа в активный центр [10].
Кинетические исследования с серией нитрофениловых и нафтиловых эфиров подтвердили, что активация иринотекана кар-боксилэстеразой лимитируется размерами входа в активный центр, которые ограничивают доступ к аминокислотным остаткам активного центра энзима, катализирующим реакцию [10].
Установлено, что карбоксилэстеразы печени и почек мыши, активно гидролизующие иринотекан, в большом количестве экспрессируются в печени и почках и в незначительном — в кишечнике и легких [18].
Циклезонид — новый ингаляционный глюкокортикостероид, разработанный для лечения бронхиальной астмы, под действием КЭМ также преобразуется в активный метаболит дезизобутирилциклезонид. Роль кар-боксилэстеразы, холинэстеразы и А-эсте-разы в гидролизе циклезонида была определена с использованием ряда ингибиторов [5].
Показано, что КЭМ катализируют сте-реоселективный гидролиз сложных эфиров производных З-гидрокси-бенздиазепин-2-она [19]. Так, изучен гидролиз гемисукцина-та оксазепама (39) карбоксилэстеразой печени мышей, крыс и морских свинок (рис. 1). Установлено, что процесс трансформации проходит стереоселективно; (+)-изомер является лучшим субстратом карбоксил-
эстеразы, о чем свидетельствуют Км, составившие 2,510-3 моль/дм3 для (+)-изомера, 3,310-3 моль/дм3 для рацемата и 14,310-3 моль/дм3 для (-)-изомера, независимо от вида лабораторных животных [20].
Сложные эфиры оксазепама и монокар-боновых кислот также стереоселективно гидролизуются карбоксилэстеразами печени крысы и человека, равно как и супернатантом 9000 g ^9-фракция) гомогената головного мозга [21].
Карбоксилэстеразы микросомальной фракции (МФ) печени были более специфичны к ^)-энантиомеру, однако, в отличие от них, карбоксилэстеразы S9-фракции головного мозга проявляли большую специфичность по отношению к ^)-энантиомеру [22]. Дальнейшие исследования выявили, что при трансформации в печени ^)-энантиомер ингибирует гидролиз ^)-изомера, в то время как ^)-энантиомер является активатором гидролиза ^)-энантиомера. Однако в S9-фракции наблюдалась противоположная картина [23]. Подобные результаты были получены и при трансформации 3-ацетата лоразепама [24].
Карбоксилэстеразы в энантиоселективном синтезе органических соединений
Благодаря широкой субстратной специфичности и высокой стереоселективности КЭ являются перспективными биокатализаторами энантиоселективного гидролиза и синтеза обширного ряда ациклических, карбоциклических и гетероциклических соединений [3].
В литературе представлены работы по применению КЭ для стереоселективного синтеза ряда ациклических соединений.
Так, катализируемый карбоксилэстера-зой печени свиньи (КЭПС) гидролиз сложных замещенных малоновых эфиров приводит к образованию ценных хиральных продуктов.
Показано, что лучшим субстратом является доступный 2-[(трет-бутокси)-метил]-2-метилмалонат (1), гидролизующийся в присутствии КЭПС до (+)-^)-кис-лоты (рис. 2) с высоким (9в% ) оптическим выходом [25].
V—ОСН2^.СООМе кэпс1 ' ^ХООМе
Рис. 2
у~ О'
СН2^^СООМе
чсоон
С помощью КЭПС осуществлен стереосе-лективный гидролиз ряда сложных диэфиров с неразветвленной цепью (рис. 3). Так, диметил-^ис-2,4-диметилглутамат (5) гидролизуется до сложного полуэфира (выход — 85%, энантиомерный избыток — 64%) [26].
КЭПС
МеООС-^Х^СООМе-------- НООС'^Ж^СООМе
3
R,—Me, R2=H
4
Н V Н КЭПС V н * н
МеООС^-^ХООМе НООС'^^ХООМе
5 6
Рис. 3
КЭ из пекарских дрожжей катализировала энантиоселективный гидролиз ряда сложных эфиров 2-гидроксигептановой кислоты (рис. 4), хиральных синтонов, важных для синтеза различных простаноидов, с энантиомерным выходом >99% [27].
7-15
R = (7) СН31 (8) С2Н5, (9) СН3(СН2)2, (10) (СН3)2СН, (11) СН3(СН2)3,
(12) (СН3)2СНСН2. (13) С5Н,Ь (14) СбН5СН2. (15) C^CI
Рис. 4
Рекомбинантная эстераза Burkholderia gladioli, выделенная из культуры E. ^li, использовалась для стереоселективного гидролиза линалилацетата (17) (рис. 5). Однако образующийся в результате гидролиза (S)-(+)-линалоол (18) (используемый в парфюмерной промышленности) имел низкую степень энантиомерной чистоты — 45% [28].
Рис. 5
С использованием лиофилизированного мицелия Rhizopus oryzae, обладающего выраженной карбоксилэстеразной активностью, осуществлена стереоселективная этерификация рацемического 2-октанола масляной кислотой. Получен И-энантиомер эфира с высоким энантиомерным выходом — 97% [29].
КЭ применяли для получения энантио-мерно чистых соединений карбоцикличе-ской структуры. Осуществлен стереоселек-тивный гидролиз диметилциклопропан-
2
(19), циклобутан- (21) и циклогексан-1,2-дикарбоксилатов (23) (рис. 6). Образующиеся в качестве продуктов реакции кислые сложные эфиры легко превращаются в у-лактоны с энантиомерным избытком 97% [30].
СООМе ^СООМе
кэ
< <
СООМе
19
СООМе
^ — с(
СООМе *
соон
20
соон
СООМе с<
а -а
23
СООМе
24
21
СООМе
22
Рис. 6
Изучена катализируемая КЭПС трансформация мезодиэфиров цис-циклогекс-4-ен-1,2-дикарбоксилата (25) с образованием моноэфира метил-Н-(18,2И)-циклогекс-4-ен-1,2-дикарбоксилата (рис. 7). Полученный продукт имел высокую степень оптической чистоты > 97% [31].
сс
СООСН,
КЭПС
СООСЬЦ
аСООСНз
Г
*соон
25
26
Рис. 7
КЭПС катализировала стереоселективный гидролиз диэтилового эфира М-третбутокси-карбониламинопропилбензилдиэтилмало-новой кислоты (27), до соответствующего (В)-моноэфира (рис. 8) с высоким химическим и оптическим выходом — 82%
и >99%, соответственно [32].
BocHN.
27
ЕЮ ОС
■COOEt
BocHN
НООС
COOEt
КЭ
28
Исследованы особенности получения S-энантиомеров флурбупрофена (29) и ибупро-фена (31), обладающих большей фармакологической активностью, из рацематов соответствующих этиловых эфиров с применением КЭ из Pseudomonas sp. KCTC 10122BP (рис. 9). Энантиомерный избыток в обоих случаях превышал 99% [33, 34].
Для получения S-ибупрофена из метилового эфира (R^-ибупрофена использовали также КЭ из B. subtilis, реакция протекала с высоким энантиомерным избытком [35].
І її о / кР & сн3 її 0 ,ОН
гг О КЭ Гтт 0
і F 29 сн3 и * 30 сн3
сн3 Г | X ҐТҐ СгН5 II КЭ сн3
н3с^- 31 1 0 Н3С^-^^ 32 О
Рис. 9
КЭ из Sphingobacterium ер. 238С5 катализировала стереоселективный гидролиз Р-фенилаланина (33) (рис. 10) и еще ряда ациклических и циклических аминокислот, имеющих Ь-конфигурацию [36].
NH9 О і и NH, О 1 2 ||
КЭ г
KJ ' 1
33 34
Рис. 10
С использованием карбоксилэстеразы из Burkholderia cepacia проведен стереоселективный гидролиз ряда сложных эфиров ментола 35—40 (рис. 11). Наибольший энантиомерный выход L-ментола наблюдался в случае использования формиата (35) и ацетата ментола (36) (97%) [37].
(38) СэН7СО, (39) CjH15CO, (40) С^СО Рис. 11
Карбоксилэстераза из Klebsiella oxytoca катализировала стереоселективное разделение сложных эфиров 42—51 с высокой степенью энантиомерной чистоты, причем сродство энзима к тому или иному энантиомеру зависело от структуры субстрата (рис. 12) [38].
Rr СН2ОН; R2: (42) (СН2)4СН3, (43) СН3, (44) Н. (45) СН2ОС2Н5 (46) СН2ОСН3. (47) CF3; R2: СН3, Rv (48) Cl, (49) СН3, (50) ОН, (51) ОСН3
Рис. 12
Показано, что КЭПС является перспективным биокатализатором в процессе синтеза (-)-физостигмина, катализируя стереосе-лективный гидролиз его предшественника диметил-2-(2-хлор-5-метоксифенил)-2-метил-малоната (52) (рис. 13) с высоким химическим (86%) и оптическим (99%) выходом [39].
С02Ме
С02ме кэпе
52
Рис. 13
53
КЭПС применяли как биокатализатор гидролиза сложных эфиров гетероциклических соединений. Установлено, что внутриклеточная карбоксилэстераза дрожжей Kluyveromyces marxianus ОБ8 1553 катализировала стереоселективный гидролиз рацемических эфиров 1,2-о-изопропилиденглицерина, являющихся трудногидролизуемыми субстратами стереоселективного гидролиза с использованием большинства известных эстераз. Исследование кинетических параметров реакции гидролиза ацетата 1,2-о-изопропилиденглицерина (54) (рис. 14) выявило сходные значения Умакс. гидролиза энантиомеров, но значительные отличия констант Михаэлиса — Km 8-энантиомера, поэтому она значительно уступает таковой И-энантиомера (5,3 и 70 мкмоль/дм3, соответственно) [40].
"О
ососн,
54
--U
Лк * Лк
он ососн3
55 54а
Рис. 14
КЭПС катализировала гидролиз ряда сложных бициклических мезодиэфиров (56,
58, 60) (рис. 15).
О о
^Г\^.СООМе КЭПС /Г\^с ООН
/t^J+COOMe /А^сооме
56
Vvk-c
57
о — V-v(4-C00Me
^М-*сооме о ООМе
58
59
КЭПС
РгСОО
60
ООСРг
РгСОО
61
Также показано, что КЭПС катализировала стереоселективный гидролиз ряда сложных эфиров трициклических моноэфиров 62—67 (рис. 16). Максимальная стереоселективность наблюдалась в случае 2'-хлор-этилового эфира и составляла 90,6% для образующегося метаболита и 99,4% — для нетрансформированного субстрата [41].
co9r
С09Н
C09R
(±)62-67 (+)68 (-)62-67
Р = (62) СН3, (63) С2Н5. (64) СН2С1, (65) С>Н5С1, (66) СН2С01МН2, (67) СН2СР3
Рис. 16
Сложные эфиры экзо- и эндо-цис-мезо-оксобицикло[ 2,2,1]-гептана являются хорошими субстратами КЭПС; соответствующие сложные полуэфиры образуются с высоким как химическим, так и оптическим выходом (80-98%) (рис. 17). Соответствующие продукты могут быть успешно использованы для синтеза природных соединений [42].
^>^с°2а кэпе Н°2С^^ +
jjy
69
70 Рис. 17
69а
Исследован катализируемый КЭПС гидролиз диэфиров 1,4-(изопропилендиокси)-2,5-тетрагидрофурана 71, 73 с образованием соответствующих (+)-полуэфиров (рис. 18) с высоким оптическим выходом — более 72% [43].
МеООС1
сХ
&
71
<Х
х
кэпс г
сооме меоос^Хсоон
72
X
АсО
ОАс
АсО
73
о
74
Рис. 18
Рис. 15
КЭ из Bacillus niacini EM001 катализировала стереоселективный гидролиз офлокса-цина (75) с образованием левофлоксацина (S-офлоксацина) (рис. 19) с энантиомерным избытком 67% [44].
Рис. 19
КЭПС и КЭ печени быка с успехом применяли для стереоселективного гидролиза сложных эфиров производных пиперидин-диона. Показано что гидролиз (±)-транс-3-этоксикарбонил-1,4-(4-фторфенил)-М метилпиперидин-2,6-диона (77) проходит с образованием (-)-изомера с энантиомер-ным избытком 90% (рис. 20) [45].
Рис. 20
Методы иммобилизации карбоксилэстеразы
Иммобилизация — это процесс закрепления энзима на поверхности или внутри носителя. Существуют два основных метода иммобилизации энзимов: физический и химический [46, 47].
Физическая иммобилизация энзимов представляет собой включение энзима в такую среду, в которой доступной для него является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации энзим не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре основных метода физической иммобилизации: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в поры геля; пространственное отделение энзима от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой мембраны; включение в двухфазную среду, где энзим растворим и может находиться только в одной из фаз [48, 49].
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что в результате химического воздействия на структуру энзима в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между протеином и носителем.
Препараты иммобилизованных энзимов, полученные с применением химических методов, обладают двумя важными свойствами. Во-первых, ковалентная связь энзима с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. Во-вторых, химическая модификация энзимов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность [50, 51].
В литературе приведены сведения о закрепленных на различных носителях препаратах КЭ со стабилизированной энзиматической активностью [52-54], что является перспективным для многоразового использования биокатализаторов в реакции стерео-селективного синтеза алифатических, карбоциклических и гетероциклических соединений.
Одним из наиболее распространенных способов иммобилизации КЭ является ее включение в гели полимеров синтетического и природного происхождения. Так, КЭПС была иммобилизована в гранулы Эупергита С (полиакрилатного полимера) для применения в стереоселективном гидролизе (-)-(18,4И)-4-гидрокси-2-циклопентенилацета-та. Показаны высокое (68%) сохранение эстеразной активности КЭПС при иммобилизации и высокая степень энантиомерной чистоты образующегося в результате гидролиза продукта (>98 %) [55].
Иммобилизованную в гранулы к-карра-гинана КЭПС использовали для стереоселек-тивного гидролиза метил-2-ацетоксибензоата в реакторах периодического и непрерывного действия с неподвижным слоем. Показано 50%-е сохранение исходной активности КЭПС после 8 циклов применения в реакторе периодического действия [56].
КЭПС, иммобилизованная в гранулы к-каррагинана, катализировала стереоселек-тивный гидролиз и трансэтерификацию ряда сложных эфиров первичных, вторичных и третичных спиртов в среде несмеши-вающихся с водой органических растворителей с оптическим выходом до 90% [57].
Сопоставление химического (ковалентного) и физического способов иммобилизации КЭПС на микропористых мембранах выявило, что степень сохранения активности выше в случае физической иммобилизации. Полученные препараты применяли для стереоселективного гидролиза диэтилового эфира цис-циклогекс-4-ен-1,2-дикарбоно-вой кислоты (79) с образованием соответствующего (18,2И)-моноэфира (рис. 21)
(оптическая чистота продукта не зависела от метода иммобилизации и составляла 95-97%) [58].
Ковалентным связыванием КЭПС с диоксидом кремния при помощи соли диазония был получен биокатализатор без значительной потери эстеразной активности, применявшийся для проведения стереоселективного гидролиза диметилового эфира 2-метил-2-фенилмалоновой кислоты до соответствующего (+)-(И)-моноэфира в течение 4 циклов использования с максимальным оптическим выходом 85% [59].
Совместной лиофилизацией КЭПС с ме -токсиполиэтиленгликолем получен биокатализатор переэтерификации ряда спиртов 55—58 виниловыми эфирами (рис. 22), что позволило значительно увеличить химический и оптический выход (до 97 и 96% соответственно) в оптимальных условиях проведения процесса [60].
о
0
1 О Et пн
ЕГ О^^- t ' + 1
Me
81-84 85-88 81а-84а
R= (81) (CH2)2CH=C(CH3)2. (82) (CH2)3CH(CH3)2, (83) (СН2)5СН3, (84) CH2Ph
Рис. 22
Совместную лиофилизацию КЭПС с метоксиполиэтиленгликолем, бычьим сывороточным альбумином, а также аминоме-тилполистиролом использовали для повышения стабильности КЭПС в органических растворителях для стереоселективного разделения граммовых количеств 1-алкокси-, 1-этилсульфанил-, 1-фтор-3-арил-2-пропа-нолов, 1-феноксипропанола и 1-метокси-2-фенокси-2-пропанола (оптический выход в большинстве случаев варьировал в пределах 80-99%) [61].
Свободная и иммобилизованная на Целите 545 рекомбинантная эстераза Pseudomonas uorescens, выделенная из культуры E. ooli, катализировала стереоселектив-ный гидролиз и синтез ряда алифатических и гетероциклических соединений с различным химическим и оптическим выходом (от < 1 до 99%); максимальная энантимерная
чистота наблюдалась для а-фенилэтанола и его ацетата [62].
В результате поперечной сшивки КЭ из Bacillus subtilis глутаровым альдегидом получен препарат с увеличенной стабильностью к действию высоких температур и сохранением 70%-й исходной эстеразной активности. Осуществление стереоселективного гидролиза DL-ментилацетата позволило получать L-ментол с высокой степенью энантиомерной чистоты (> 94%) в реакторе периодического действия в течение 10 циклов использования препарата с потерей эстеразной активности менее 8% [63].
Гидролиз сложных эфиров 3-гидрокси-
1,4-бенздиазепин-2-она, катализируемый карбоксилэстеразой микросомальной фракции печени свиньи
Поскольку энантиоселективность кар-боксилэстеразы МФ печени свиньи в отношении гидролиза новых производных 3-гид-рокси-1,4-бенздиазепина не изучена, нами был выбран ряд сложных эфиров 3-гидро-кси-1,4-бенздиазепин-2-она с целью исследования данного процесса. В разработанных условиях (эстеразная активность 100 ед/см3, рН 7,0, t = 37 °С, т = 2,5 ч, концентрация диметилсульфоксида — ДМСО 40%) с помощью выделенной МФ осуществлен гидролиз соединений 89—94 (рис. 23) с образованием соответствующих 3-гидроксипроизводных (95-97).
Известно, что структура субстрата может влиять на степень его трансформации карбоксилэстеразой [3], поэтому было исследовано влияние заместителей в молекуле сложных эфиров 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она на степень их биоконверсии in vitro с помощью микросомальной фракции печени свиньи. Показано, что степень трансформации сложных эфиров 7-бром-3-гидрокси-5-фенил-1,2-дигидро-3#-1,4-бенздиазепин-2-она под
влиянием микросомальной фракции изменяется в зависимости от их структуры.
Так, степень трансформации соединений 90, 91, 92 с разной длиной ацильного фрагмента в положении 3 бенздиазепинового цикла составила 53,2%, 48,1% и 46,1%, соответственно, в то время как 89 гидролизуется в этих же условиях на 38,3% (рис. 24) [64]. Установлено, что введение алкильных заместителей в 1-е положение бенздиазепиново-го цикла приводит к снижению степени гидролиза в заданных условиях с 38,3% для соединения 89 до 29,3% — для 93 и 24,1% — для 94, соответственно (рис. 23).
Рис. 23. Зависимость степени гидролиза 3-ацилокси-7-бром-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-онов с применением микросомальной фракции печени свиньи от структуры субстратов
С помощью выделенной МФ в разработанных условиях осуществлен стереоселек-тивный гидролиз соединения 93 с 50%-й степенью трансформации (рис. 24).
^ о
МФ \ (Г ^ ).о
У сн,
о I 1 о
91 92 91а
Рис. 24. Стереоселективный гидролиз 93 с помощью МФ
Нами было показано, что образующееся в результате гидролиза соединение 96 подвергается рацемизации в процессе гидролиза и последующего выделения, что согласуется с данными литературы [21].
Был получен энантиомер 93а, методом рентгеноструктурного анализа установлены его молекулярная и кристаллическая структуры. Показано, что выделенное соединение является 8-энантиомером, что свидетельст -вует о большей специфичности карбоксил-эстеразы МФ печени свиньи к И-энантиомеру 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-фенил-1,2-дигидро-3#-1,4-бенздиазепин-2-она.
Соединение 93а кристаллизуется в моноклинной хиральной пространственной группе Р21. Его абсолютная конфигурация (а) и конформация (б) приведены на рис. 25.
Диазепиновый цикл в молекуле 93а имеет конформацию псевдованны. Угол вращения [а]20в=+195,3°, с = 1 в хлороформе.
В кристалле связанные двойной винтовой осью молекулы образуют цепочки, параллельные кристаллографической оси Ь за счет С8-Н-032 (3,439(2) А) водородной связи (рис. 26). Внутри цепочки взаимное расположение 7-бромзамещенных бензольных колец, конденсированных с диазепино-вым циклом, указывает на диполь-диполь-ное и стэкинг-взаимодействия между ними. Структурные данные депонированы в Кембриджском банке структурных данных под номером ССБС 789193 [65].
Рис. 25. Молекулярная структура субстрата 93а:
а — вид молекулы в проекции на ее среднюю плоскость;
б — вид молекулы, иллюстрирующий ее конформацию
Рис. 26. Цепи в кристалле S-энантиомера субстрата 93а
Поскольку показано, что карбоксилэсте-раза в составе микросомальной фракции печени свиньи является перспективным биокатализатором стереоселективного гидролиза сложных эфиров 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она, целесообразно было разработать способы ее иммобилизации, что способствует повышению стабильности энзимного препарата и дает возможность многократно использовать биокатализатор для получения стереоизомеров эфиров 3-гидрокси-1,4-бенздиазепин-2-она.
Выделеную МФ иммобилизовали в гранулы филлофорина из Phyllophora nervosa и альгината Na, стабилизированных ионами Са2+. В результате иммобилизации получены биокатализаторы с высоким сохранением исходной эстеразной активности (80 и 70%, соответственно) в форме прочных гранул сферической формы, стабильные в используемой водно-органической среде.
Показано отсутствие значительных отличий рН (7,0) и температурных (37 °С) оптимумов эстеразной активности свободного и иммобилизованных МФ.
С помощью иммобилизованных в филло-форине и альгинате Са МФ осуществлен сте-реоселективный гидролиз соединения 93 в течение 5 и 12 циклов, соответственно, в периодическом режиме (рис. 27).
ъ Б Ъ Б у 5 ь i Б Б Б в а Е
i f 5 Е Е
1 г |*|
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Число циклов
□ филлофорин □ альгинат
Рис. 27. Зависимость степени трансформации соединения 91 от кратности применения иммобилизованных препаратов
Таким образом, данные литературы и результаты собственных исследований свидетельствуют о перспективности применения как свободных, так и иммобилизованных препаратов карбоксилэстеразы для сте-реоселективного синтеза различных классов органических соединений, имеющих практическое применение в биотехнологических процессах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rentsch K. M. The importance of stereoselective determination of drugs in the clinical laboratory // J. Biochem. Biophys. Methods. —
2002. — V. 54, N 1. — P. 1-9.
2. Bielory L., Leonov A. Stereoconfiguration of antiallergic and immunologic drugs // Ann. Allergy Asthma Immunol. — 2008. — V. 100, N 1. — P. 1-9.
3. Zhu L.-M., Tedford M. C. Applications of pig liver esterases (PLE) in asymmetric synthesis // Tetrahedron. — 1990. — V. 46, N 13. — P. 6587-6611.
4. Lam L. K., Brown C. M., De Jeso B. et al. Enzymes in organic synthesis. 42. Investigation of the effects of the isozymal composition of pig liver esterase on its stereoselectivity in preparative-scale ester hydrolysis of asymmetric synthetic value // Chirality. — 1988. — V. 110, N 13. — P. 4409-4411.
5. Hosokawa M. Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs // Molecules. — 2008. — V. 13, N 2. — P. 412-431.
6. Redinbo M. R., Bencharit S., Potter P. M. Human carboxylesterase 1: from drug metabolism to drug discovery // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — V. 31, N 1. — P. 620-624.
7. Satoh T, Hosokawa M. Structure, function and regulation of carboxylesterases // Chem. Biol. Interact. — 2006. — V. 162, N 3. — P. 195-211.
8. Hosokawa M, Maki T., Satoh T. Characterization of molecular species of liver microsomal carboxylesterase of several animal species and humans // Arch. Biochem. Biophys. — 1990. — V. 277, N 3. — P. 219-277.
9. Watanabe K, Matsunaga T, Kimura T. et al. Stereospecific and regioselective hydrolysis of cannabinoid esters by ES46.5K, an esterase from mouse hepatic microsomes, and its differences from carboxylesterases of rabbit and porcine liver // Biol. Pharm. Bull. — 2005. — V. 28, N 9. — P. 1743-1747.
10. Wadkins R., Morton C., Danks M. Structural constraints affect the metabolism of 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidi-no]carbonyloxy- camptothecin (CPT-11) by carboxylesterases // Mol. Pharmacol. —
2001. — V. 60, N 2. — P. 355-362.
11. Brzezinski M., Spink B., Dean R. et al. Human liver carboxylesterases hCE-1: binding specificity for cocaine, heroine and their metabolites and analogs // Drag. Metab. Disp. — 1997. — V. 25, N 9. — P. 1089-1096.
12. Bencharit S., Morton C. L, Hyatt J. L. et al. Crystal structure of human carboxylesterase
1 complexed with the Alzheimer’s drug tacrine // Chem. Biol. Interact. — 2003. — V. 10, N 4. — P. 341-349.
13. Arpigny J. L., Jaeger K. E. Bacterial lipolytic enzymes: classification and properties // Biochem. J. — 1999. — V. 343, N 1. — P. 177-183.
14. Bornscheue U. T. Microbial carboxyl esterases: classification, properties and application in biocatalysis // FEMS Microbiol. Rev. —
2002. — V. 26, N 1. — P. 73-81.
15. Akoh C.-C, Lee G.-C, Liaw Y.-C. et al. GDSL family of serine esterases/lipases // Prog. Lipid Res. — 2004. — V. 43, N 6. — P. 534-552.
16. Satoh T., Hosakawa M. The mammalian carboxylesterases: from molecules to functions // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. — 1998. — V. 38, N 2. — P. 257-288.
17. Zhang J., Burnell J. C., Dumaual N., Bosron W. F. Binding and hydrolysis of meperidine by human liver carboxylesterase hCE-1 // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1999. — V. 290, N 1. — P. 314-318.
18. Micheal W., Mingxing X. Mouse liver and kidney carboxylesterase rapidly hydrolyzes antitumor prodrug irinotecan and the n-ter-minal three quarter sequence determines substrate selectivity // Drug Metab. —
2003. — V. 31, N 1. — P. 21-27.
19. Yang S. K., Chen S. J., Huang J. D. Enantio-selectivity suggests a cytosolic origin for a commercial pig liver esterase preparation // Chirality. — 1995. — V. 7, N 1. — P. 40-43.
20. Salmona M., Saronio C., Bianchi R. et al. In vitro hydrolysis of oxazepam succinate halfester by a stereospecific soluble esterase from different animal species // J. Pharm. Sci. — 1974. — V. 63, N 2. — P. 222-225.
21. Yang K., Lu X. Racemization kinetics of enantiomeric oxazepams: stereoselective hydrolysis of enantiomeric oxazepam 3-acetate in rat liver microsomes and brain homogenate // Ibid. — 1989. — V. 78, N 10. — P. 789-795.
22. Macsay G., Tegyey Z., Otvos L. Stereospecifi-ty of esterases hydrolysis of oxazepam acetate // Ibid. — 1978. — V. 67, N 9. — P. 1208-1210.
23. Yang S., Liu K., Guengerich P. Enantio-selective hydrolysis of oxazepam 3-acetate by esterases in human and rat liver micro-somes and rat brain S9 fraction // Chyrality. —
1990. — V. 2, N 3. — P. 150-155.
24. Liu K., Guengerich F. P., Yang S. K. Enantioselective hydrolysis of lorazepam 3-acetate by esterases in human and rat liver microsomes and rat brain S9 fraction // Drug. Metab. Disposit. — 1991. — V. 19, N 3. — P. 609-613.
25. Bjorkling F., Boutelje J., Gatenbeck S. et al. The effect of dimethyl sulfoxide on the enan-tioselectivity in the pig liver esterase catalyzed hydrolysis of dialkylated propanedioic acid dimethyl esters // Bioorg. Chem. — 1996. — V. 14, N 2. — P. 176-181.
26. Chen C.-S., Fujimoto Y., Sih C. J. Bifunctional chiral synthons via microbiological methods. 1. Optically active 2,4-dimethylglutaric acid monomethyl esters // J. Am. Chem. Soc. — 1981. — V. 103, N 12. — P. 3580-3582.
27. Ushio K., Yamauchi S., Masuda K. Preparation of enantiomerically pure (S)-2-hydroxy-heptanoate via bakers’ yeast catalyzed hydrolytic resolution // Biotechnol. Lett. —
1991. — V. 13, N 7. — P. 495-500.
28. Schlacher A., Stanzer T., Osprian I. et al. Detection of a new enzyme for stereoselective hydrolysis of linalyl acetate using simple plate assays for the characterization of cloned esterases from Burkholderia gladioli resolution // J. Biotechnol. — 1998. — V. 62, N 1. — P. 47-54.
29. Gandolfi R., Converti A., Pirozzi D. et al. Efficient and selective microbial esterifica-tion with dry mycelium of Rhizopus oryzae // Ibid. — 2001. — V. 92, N 1. — P. 21-26.
30. Gais H. J., Buelow G., Zatorski A. et al. Enzy -me-catalyzed asymmetric synthesis. 8. Enan-tioselectivity of pig liver esterase catalyzed hydrolyses of 4-substituted meso cyclopen-tane 1,2-diesters // J. Org. Chem. — 1989. — V. 54, N 21. — P. 5115-5122.
31. Sousa H, Afonso C., Mota J. et al. Enantioselective hydrolysis of a meso-diesters using pig liver esterase in a two-phase stirred tank reactor // Ind. Eng. Chem. Res. — 2003. — V. 42, N 22. — P. 5516-5525.
32. Chartrain M, Maligres P., Cohen D. Porcine liver esterase-catalyzed enantioselective hydrolysis of a prochiral diester into its optically pure (S)-ester acid, a precursor to a growth hormone secretagogue // J. Biosci. Bioengin. — 1999. — V. 87, N 3. — P. 386-389.
33. Lee E. G, Won H. S., Ro H. S. et al. Preparation of enantiomerically pure (S)-flurbipro-fen by an esterase from Pseudomonas sp. KCTC 10122BP // J. Mol. Catal. B. Enzym. —
2003. — V. 26, N 3. — P. 149-156.
34. Kim G. J., Lee E. G., Gokul B. et al. Identification, molecular cloning and expression of a new esterase from Pseudo -monas sp. KCTC 10122BP with enantioselec-tivity towards racemic ketoprofen ethyl ester // Ibid. — 2003. — V. 22, N 1. — P. 29-35.
35. Безбородов А. М., Загустина Н. А., Попов В. О. Ферментативные процессы в биотехнологии. — М.: Наука, 2008. — 335 с.
36. Ogawa J., Mano J., Hagishita T. et al. Enantioselective ester hydrolase from Sphin -gobacterium sp. 238C5 useful for chiral resolution of P-phenylalanine and for its P-pep-tide synthesis // J. Mol. Catal. B. Enzym. — 2009. — V. 60, N 3. — P. 138-144.
37. Yu L., Xu L., Yu X. et al. Purification and properties of a highly enantioselective l-men-thyl acetate hydrolase from Burkholderia cepacia // Ibid. — 2009. — V. 57, N 1. — P. 27-33.
38. Wang P. Y., Tsai S. W. Enzymatic hydrolytic resolution of (R,S)-tropic acid esters and (R,S)-ethyl а-methoxyphenyl acetate in biphasic media // Ibid. — 2009. — V. 57, N 1. — P. 158-163.
39. Asakawa K., Noguchi N., Takashima S. et al. Preparation of a new chiral building block containing a benzylic quaternary stereogenic center and a formal total synthesis of (-)-physostigmine // Tetrahedron: Asymmetry. — 2008. — V. 19, N 19. — P. 2304-2309.
40. Monti D., Ferrandi E. E., Righi M. et al. Purification and characterization of the enantioselective esterase from Kluyvero-myces marxianus CBS 1553 // J. Biotechnol. —
2008. — V. 133, N 1. — P. 65-72.
41. Bloch R., Guibe-Jampel E., Girard C. Stereoselective pig liver esterase-catalyzed hydrolysis of rigid bicyclic meso-diesters: Preparation of optically pure 4,7-epoxytetra- and hexa-hydrophthalides // Tetrahedron Lett. — 1985. — V. 26, N 34. — P. 4087-4090.
42. Guanti G., Banfi L., Narisano E. et al. Enzymes in asymmetric synthesis: effect of reaction media on the PLE catalysed hydro-
lysis of diesters // Ibid. — 1986. — V. 27, N 38. — P. 4639-4642.
43. Hultin P. G., Mueseler F. J., Jones J. B. Enzymes in organic synthesis. Pig liver esterase and porcine pancreatic lipase catalyzed hydrolyses of 3,4-(isopropylidenedioxy)-2,5-tetrahydrofuranyl diesters // J. Org. Chem. —
1991. — V. 56, N 18. — P. 5375-5380.
44. Kima H. K., Nab H. S., Parkb M. S. et al. Occurrence of ofloxacin ester-hydrolyzing esterase from Bacillus niacini EM001 // J. Mol. Catal. B. Enzym. — 2004. — V. 27, N 4-6. — P. 237-241.
45. Curzons A., Powell L., Keay A. Process for stereospecific hydrolysis of piperidinedione derivatives. WO/1933/022284. Application number PTG/GB93/00721 Publication Date 11/11/1993 Filing Date: 06/04/1993.
46. Евтушенков А. Н., Фомичев Ю. К. Введение в биотехнологию. — Минск: БГУ, 2004. — 104 c.
47. Волова Т. Г. Биотехнология. — Новосибирск: Изд-во Сиб. отделения РАН, 1999. — 252 с.
48. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. — М.: Мир, 1988. — 378 с.
49. Егоров Н. С. Самуилов В. Д. Биотехнология. — М.: Высшая школа, 1987. — 159 с.
50. Березин И. В., Мартинек К. Введение в прикладную энзимологию. — М.: Изд-во МГУ, 1982. — 384 с.
51. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. — М.: Мир, 1983. — 213 с.
52. Shimazaki Y., Kuroda T. Production of enzyme reactors after separation by non-denaturing two-dimensional electrophoresis and immobilization on membrane // Biotechnol. Lett. —
2009. — V. 31, N 10. — P. 1545-1549.
53. Almeida R. V., Branco R. V., Peixoto B. et al. Immobilization of a recombinant thermostable esterase (Pf2001) from Pyrococcus furiosus on microporous polypropylene: Isotherms, hyperactivation and purification // Biochem. Eng. J. — 2008. — V. 39, N 3. — P. 531-537.
54. Shimazaki Y., Sakikawa T., Kimura A. Analysis of activity of esterase captured onto an immunoaffinity membrane // Clin. Chim. Acta. — 2012. — V. 413, N 1-2. — P. 269-272.
55. Laumen K., Reimerdes E. H., Schneider M. et al. Immobilized porcine liver esterase: a convenient reagent for the preparation of chiral building blocks // Tetrahedron Lett. — 1985. — V. 26, N 4. — P. 407-410.
56. Desai P. D., Dave A. M., Devi S. Chemo-selective hydrolysis of methyl 2-acetoxyben-
zoate using free and entrapped esterase in K-carrageenan beads // J. Appl. Polymer Sci.— 2008. — V. 108, N 4. — P. 2617-2622.
57. Barbara S., Robert W., Steven W. et al. Carrageenan-immobilized esterase. United States Patent 5262313. Application Number: 07/715829 Publication Date: 11/16/1993 Filing Date: 06/14/1991.
58. Sousa H. A., Rodrigues C., Klein E. et al. Immobilisation of pig liver esterase in hollow fiber membranes // Enz. Microbial Tech-nol. — 2001. — V. 29, N 10. — P. 625-634.
59. Herdan J.-M., Balulescu M., Cira O. Enantioselective hydrolysis of racemic esters using pig liver esterase // J. Mol. Catalysis A: Chemical. — 1996. — V. 107, N 1. — P. 409-414.
60. Ruppert S., Gais H-J. Activity enhancement of pig liver esterase in organic solvents by colyophilization with methoxypolyethylene glycol: kinetic resolution of alcohols // Tetrahedron: Asymmetry. — 1997. — V. 8, N 21. — P. 3657-3664.
61. Gais H-J., Jungen M., Jadhav V. Activation of pig liver esterase in organic media with organic polymers. Application to the enan-tioselective acylation of racemic functional-ized secondary alcohols // J. Org. Chem. — 2001. — V. 66, N 10. — P. 3384-3396.
62. Krebsf anger N., Schierholz K., Born-scheuer U. T. Enantioselectivity of a recombinant esterase from Pseudomonas fluorescens towards alcohols and carboxylic acids // J. Biotechnol. — 1998. — V. 60, N 1. — P. 105-111.
63. Zheng G.-W., Yu H.-L., Li C.-X. Immobili -zation of Bacillus subtilis esterase by simple cross-linking for enzymatic resolution of DL-menthyl acetate // J. Mol. Catal. B. Enzym. — 2011. — V. 70, N 3-4. — P. 138-143.
64. Андронати С. А., Шестеренко Е. А., Севастьянов О. В. и др. Гидролиз сложных эфиров 7-бром-3-гидрокси-5-фенил-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она мик-росомальной фракцией печени свиньи // Вісн. ОНУ, Сер. Хімія. — 2008. — Т. 13, № 11.— C. 37-45.
65. Шестеренко Е. А., Романовская И. И., Андронати С. А. и др. Стереоселективный гидролиз 1-метил-5-фенил-3-ацетокси-7-бром-1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она с помощью свободной и иммобилизованной микросомальной фракции печени свиньи // Доп. НАНУ. — 2011.- № 2.-С. 166-172.
КАРБОКСИЛЕСТЕРАЗИ В ЕНАНТІОСЕЛЕКТИВНОМУ СИНТЕЗІ ОРГАНІЧНИХ СПОЛУК
Є. А. Шестеренко 1.1. Романовська
О. В. Севастьянов С. А. Андронаті
Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, Одеса
E-ma.il: [email protected]
В огляді наведено класифікацію, структуру і механізм каталітичної дії карбоксилесте-раз різного походження.
Показано перспективність використання карбоксилестераз для вивчення метаболізму та активації низки лікарських речовин і пролі-ків in vitro. Актуальним є також використання ензимів як біокаталізаторів стереоселек-тивного гідролізу і синтезу складних ефірів ациклічних, карбоциклічних та гетероциклічних сполук. Встановлено, що одержані за допомогою карбоксилестерази енантіомери характеризуються високим хімічним виходом
і оптичною чистотою, а іммобілізація на різних носіях стабілізує ензим і дає змогу багаторазово використовувати отримані біокаталіза-тори. Проведені авторами дослідження виявили особливості ензиматичного гідролізу нових 3-ацилокси-1,4-бенздіазепін-2-онів — потенційних анксіолітичних та снодійних засобів за допомогою карбоксилестерази мік-росомальної фракції печінки свині. З використанням вільної та іммобілізованої в гелі філо-форину і альгінату, стабілізованих Ca2+, мікросомальної фракції вперше здійснено енантіоселективний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-1-метил-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону. Виділено S-енантіомер субстрату, що свідчить про більшу специфічність карбоксилестерази мікросомальної фракції печінки свині до його R-енантіомера.
Ключові слова: карбоксилестераза, мікросо-мальна фракція печінки свині, стереоселек-тивний синтез, 3-ацилокси-1,4-бенздіазепін-2-они, іммобілізація.
CARBOXYLESTERASES IN ENANTIOSE-LECTIVE SYNTHESIS OF ORGANIC COMPOUNDS
E. A. Shesterenko
I. I. Romanovska O. V. Sevastyanov S. A. Andronati
Bogatsky Physicochemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odesa
Е-mail: [email protected]
The classification, structure, and mechanism of catalytic action of carboxylesterase of different origin are presented in the review.
The prospects of carboxylesterases application for metabolism and both several drugs and prodrugs activation investigation in vitro are shown. The enzyme usage as biocatalyst of stereoselective hydrolysis and synthesis of a wide range of acyclic, carbocyclic and heterocyclic compounds — esters are also urgent. It was established that enantiomers obtainable with the help of carboxylesterase are characterized by high chemical yields and optical purity; immobilization on different supports stabilizes the enzyme and allows the repeated usage of obtained biocatalysts. The own studies conducted and the enzymatic hydrolysis features of news 3-acyl-hydroxy-1,4-benzodiasepin-2-ones — potential anxiolytic and hypnotic means, with a help of pig liver microsomal fraction carboxylesterase have been established. For the first time the enantioselective hydrolysis of 3-acetoxy-7-bromo-1-methyl- 5-phenyl-1,2-dihydro-3H-1,4-benz-diazepine-2-one was accomplished using free and immobilized in phyllophorine and alginate, stabilized by Ca2+ microsomal fraction. The S-enan-tiomer of substrate was isolated, which suggests the increased specificity of pig liver microsomal fraction carboxylesterase to its R-enantiomer.
Key words: carboxylesterase, pig liver microsomal fraction, stereoselective synthesis, 3-acyl-hydroxy-1,4-benzdiazepine-2-ones, immobilization.
