CC BY
28
CV
со
us
и ш u
ж ш
и
Взаимосвязь компонентов EGFR/PI3K/AKT-сигнального пути с эффективностью терапии тамоксифеном у больных эстрогензависимым раком молочной железы
Т.А. Дронова1, 2, Н.Н. Бабышкина1, 2, М.В. Завьялова1-3, С.В. Паталяк1, Е.М. Слонимская1, 3,
Н.В. Чердынцева1, 2, Ю.Г. Кжышковска2, 4
1Научно-исследовательский институт онкологии ФГБНУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН»; Россия, 634009 Томск, пер. Кооперативный 5; ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет»;
Россия, 634050 Томск, пр-т Ленина, 36; 3ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России; Россия, 634050 Томск, Московский тракт, 2; 4Университет Гейдельберга; Германия, Маннхайм
Контакты: Татьяна Анатольевна Дронова [email protected]
Введение. Резистентность к гормональной терапии тамоксифеном обусловлена комплексом взаимоотношений сигнальных каскадов рецепторов факторов роста с эстрогеновыми рецепторами.
Цель исследования — комплексная оценка экспрессии матричной РНК(мРНК), белковой экспрессии и полиморфизма генов основных компонентов EGFR/PHK/AKT-сигнального пути во взаимосвязи с эффективностью терапии тамоксифеном у больных эстрогензависимым раком молочной железы (РМЖ).
Материалы и методы. В исследование включены 95 больных РМЖ, получавшие адъювантную терапию тамоксифеном, из которых у 31 пациентки наблюдалось прогрессирование заболевания на фоне тамоксифена (тамоксифен-резистентная группа), 64 больных составили группу без признаков прогрессирования (тамоксифен-чувствительная группа). Генотипирование полиморфных локусов генов ESR1 (rs2077647, rs2228480, rs1801132), EGFR (rs1468727, rs2227983), AKT1 (rs1130233) и PTEN (rs11202592) проведено с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для оценки экспрессии мРНК генов ESR1, EGFR, AKT1, PTEN использовали метод количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Иммуногистохими-чески проведено изучение экспрессии ERa, EGFR, Akt (pS473) и PTEN. Показатели безрецидивной выживаемости больных РМЖ проанализированы с помощью кривых Каплана—Майера.
Результаты. Показано, что мутантный аллель С rs2077647гена ESR1 чаще встречается в опухолях, чувствительных к тамок-сифену, по сравнению с опухолями, резистентными к данной терапии (p = 0,044). Для тамоксифен-чувствительных опухолей отмечен высокий уровень экспрессии мРНК гена AKT1 по сравнению с тамоксифен-резистентными (7,27 ± 5,29 и 0,02 ± 0,01 соответственно, p = 0,014). Носительство мутантного генотипа GG rs2228480 гена ESR1 ассоциировано с резистентностью к терапии тамоксифеном (p = 0,028). Уровень экспрессии EGFR и Akt (pS473) значимо выше в тамоксифен-резистентной группе по сравнению с тамоксифен-чувствительной (p = 0,006 и 0,037 соответственно). Безрецидивная выживаемость была значимо меньше у пациенток с мутантными генотипами гена ESR1 rs2228480 по сравнению с носительством диких и гетерозиготных вариантов (log rank p = 0,043). Наличие положительного уровня экспрессии в опухоли EGFR или Akt (pS473) ассоциировано с низкими показателями безрецидивной выживаемости исследуемой группы пациентов (log rank p = 0,014 и 0,048 соответственно). Заключение. В качестве потенциальных маркеров, ассоциированных с чувствительностью/резистентностью опухоли к гормональной терапии тамоксифеном, могут рассматриваться полиморфные сайты гена ESR1, экспрессия мРНК AKT1 и уровень экспрессии EGFR и Akt (pS473).
Ключевые слова: эстрогензависимый рак молочной железы, тамоксифен, EGFR/PI3K/AKT-сигнальный каскад, полиморфизм генов
Для цитирования: Дронова Т.А., Бабышкина Н.Н., Завьялова М.В. и др. Взаимосвязь компонентов EGFR/PHK/AKT-сигнального пути с эффективностью терапии тамоксифеном у больных эстрогензависимым раком молочной железы. Успехи молекулярной онкологии 2018;5 (3):40-50.
DOI: 10.17650/2313-805X-2018-5-3-40-50
Relation of EGFR/PI3K/AKT signaling components with tamoxifen efficacy in patients with estrogen-dependent breast cancer
T.A. Dronova1,2, N.N. Babyshkina12, M. V. Zavyalova1-3, S. V. Patalyak1, E.M. Slonimskaya13, N. V. Cherdyntseva1,2, J.G. Kzhyshkowska2,4
Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences; 5 Kooperativnyy Pereulok, Tomsk 634009, Russia; 2National Research Tomsk State University; 36 Lenina Prospekt, Tomsk 634050, Russia;
3Siberian State Medical University; 2 Mo.skov.skiy Trakt, Tomsk 634050, Russia; 4University of Heidelberg, Mannheim, Germany
Background. It is generally accepted that crosstalk between the growth factor receptor and ER pathways implicated in tamoxifen resistance. The aim of the study was to examine the relationship between mRNA level, protein expression and gene polymorphism of the EGFR/PI3K/AKT signaling components with tamoxifen efficacy in patients with estrogen-dependent breast cancer.
Materials and methods. The study included 95 breast cancer patients who had received adjuvant tamoxifen, of which 31 patients developed recurrence/metastasis after tamoxifen treatment (tamoxifen resistance group), 64patients did not develop any diseases progression (tamoxifen sensitive group) during the 5 years of follow-up. Genotypes for ESR1 (rs2077647, rs2228480, rs1801132), EGFR (rs1468727, rs2227983), AKT1 (rs1130233) and PTEN (rs11202592) were analyzed using a TaqMan assay. Using reverse transcription-PCR, the relative expression of mRNA for ESR1, EGFR, AKT1 and PTEN was determined. ERa, EGFR, Akt (pS473) and PTEN expression level was evaluated using immunohistochemistry. Progression-free survival (PFS) was estimated by Kaplan — Meier analysis. Results. The minor allele of ESR1 rs2077647 was more prevalent in tamoxifen sensitive tumors compared to tamoxifen resistant tumors (p = 0.044). We found high AKT1 mRNA expression level in tamoxifen sensitive group compared with tamoxifen resistance patients (7.27 ± 5.29 and 0.02 ± 0.01, respectively, p = 0.014). ESR1 rs2228480 was significantly associated with tamoxifen resistance (p = 0.028). EGFR and Akt (pS473) protein expression level was significantly higher in the tamoxifen resistance group compared to tamoxifen sensitive breast cancer patients (p = 0.006 and 0.037, respectively). Patients carrying mutant genotypes of ESR1 rs2228480 had a poorer progression-free survival than those carrying wild and heterozygous variants (log rank p = 0.043). Positive EGFR tumor expression as well as positive Akt (pS473) expression were significantly associated with shorter PFS (log rankp = 0.014 and 0.048, respectively).
Conclusion. Polymorphic sites of the ESR1 gene, AKT1 mRNA expression, EGFR expression level and Akt (pS473) protein expression can be potential molecular markers associated with tumor sensitivity/resistance to tamoxifen treatment.
Key words: estrogen-dependent breast cancer; tamoxifen; EGFR/PI3K/AKTsignaling; gene polymorphism
For citation: Dronova T.A., Babyshkina N.N., Zavyalova M.V. et al. Relation of EGFR/PI3K/AKT signaling components with tamoxifen efficacy in patients with estrogen-dependent breast cancer. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2018;5(3):40—50.
cv
CS
и ш u
Введение
Тамоксифен, селективный модулятор эстрогеновых рецепторов, остается в настоящее время базисным препаратом гормональной терапии как ранних, так и распространенных форм эстрогензависимого рака молочной железы (РМЖ) [1, 2]. Способность тамок-сифена конкурировать с эстрогенами за связывание с эстрогеновыми рецепторами а (ERa) приводит к частичному блокированию ERa-сигнального пути, что в значительной степени способствует снижению про-лиферативного эффекта стероидов. Использование тамо-ксифена в адъювантном режиме позволяет значительно увеличить показатели безрецидивной выживаемости больных РМЖ [3]. Однако высокий риск развития рецидива или прогрессирования заболевания на фоне адъювантного применения тамоксифена существенно ограничивает его эффективность [4].
Резистентность к антиэстрогенной терапии — муль-тифакториальная проблема, в которой задействовано множество сигнальных путей, в том числе сигнальные каскады рецепторов факторов роста, которые взаимодействуют как с эстрогеновыми рецепторами, так и внутриклеточными путями, такими как PI3K/AKT/ mTOR [5, 6].
Рецептор эпидермального фактора роста EGFR (HER1/ErbB1), член семейства белков ErbB, является одним из важнейших компонентов PDK/AKT-сигналинга, осуществляющего регуляцию клеточной пролиферации и злокачественной трансформации клеток при РМЖ [7]. EGFR-PDK-взаимодействие опосредовано адаптерным белком GAB1, содержащим канонические
сайты связывания с PI3K, что приводит к аллостери-ческой активации каталитической субъединицы p110 PI3K и образованию фосфатидилинозитол-3,4,5-три-фосфатов (PIP3), необходимых для последующих реакций фосфорилирования Akt [8]. Уровень PIP3 находится под регуляторным контролем противоположно направленных эффекторных реакций PI3K и фосфа-тазы PTEN [9].
Многочисленные экспериментальные и клинические данные демонстрируют, что гиперэкспрессия EGFR определяет резистентность к тамоксифену в эстроген-положительных опухолях молочной железы [10—12]. Результаты ранее проведенных нами исследований также подтвердили прогностическую значимость статуса экспрессии EGFR как маркера неэффективности адъювантной терапии тамоксифеном [13]. Данные литературы свидетельствуют о том, что высокий уровень экспрессии Akt ассоциирован с низкими показателями общей выживаемости у больных РМЖ, получавших тамоксифен [14]. Напротив, низкий уровень экспрессии PTEN либо потеря экспрессии PTEN коррелирует с развитием рецидива на фоне приема тамоксифена у пациенток с РМЖ, что определяет неблагоприятный исход заболевания [15]. Однако, несмотря на убедительные данные, свидетельствующие о вовлечении EGFR/PI3K-ассоциированных белков в механизмы неэффективности тамоксифена, системный подход к оценке их прогностической значимости у больных эстрогензависимым РМЖ отсутствует.
Цель исследования — комплексная оценка экспрессии матричной РНК (мРНК), белковой экспрессии
X ш
и
CV
со
us
и ш u
ж ш
и
и полиморфизма генов основных компонентов EGFR/ Р13К/АКТ-сигнального пути во взаимосвязи с эффективностью терапии тамоксифеном у больных эстро-гензависимым РМЖ.
Материалы и методы
В исследование были включены 95 пациенток с впервые выявленным операбельным РМЖ (Т1—4^— 3М0), получавших лечение в отделении общей онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ с 2002 по 2014 г. Средний возраст больных составил 54,5 ± 0,9 года (30—79 лет). У всех пациенток диагноз эстрогензави-симого РМЖ подтвержден морфологически. Определение молекулярного подтипа опухоли проводили иммуногистохимически на основе маркеров ERa, PR, НЕЯ2 и Ю-67. Люминальный подтип А РМЖ (опухоли с отрицательной экспрессией НЕЯ2, положительной экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону и пролиферативной активностью менее 20 %) выявлен у 62 (65,3 %) больных, люминальный подтип В (эстроген/прогестерон рецептор-положительные опухоли как с положительной, так и с отрицательной экспрессией НЕЯ2 и высоким уровнем пролиферативной активности >20 %) — у 33 (34,7 %) пациенток.
Все больные получали комбинированное лечение в объеме оперативного вмешательства, а также гормональной терапии и химиотерапии по показаниям. Адъ-ювантная химиотерапия в виде 4—6 курсов по схеме FAC была проведена 33 (35,5 %) пациенткам. Все больные в адъювантном режиме получали тамоксифен в стандартной дозе 20 мг/сут. Оценку эффективности лечения проводили на основании наличия или отсутствия прогрессирования заболевания, по результатам которой сформированы 2 группы: тамоксифен-чувст-вительная (больные без выявленных отдаленных метастазов; п = 64), и тамоксифен-резистентная (больные с прогрессированием заболевания; п = 31). Все случаи прогрессирования были отмечены на фоне адъювант-ной терапии тамоксифеном. Среднее время до прогрес-сирования составило 28,5 ± 17,8 мес. Исследуемые группы пациенток были сопоставимы по основным клинико-морфологическим признакам и объему проведенного лечения (табл. 1).
Для оценки экспрессии исследуемых генов использованы образцы опухолевой и прилежащей нормальной ткани, полученные во время оперативного вмешательства. Образцы помещали в раствор RNAlаter (АтЫоп, США) и сохраняли при температуре —80 °С (после 24-часовой инкубации при температуре +4 °С) для дальнейшего выделения РНК. Белковые продукты исследуемых генов и их полиморфные варианты были изучены в образцах опухолевой ткани, фиксированных в 10 % рН-нейтральном растворе формалина. Продолжительность фиксации составляла не более 18—24 ч. Проводку образцов осуществляли по стандартной методике.
Для оценки полиморфизма генов ESR1 (ге2077647, п2228480, гз180П32), ЕОГЯ (ге1468727, п£227983),
AKT1 (rs1130233) и PTEN (rs11202592) из опухолевых образцов с помощью наборов QIAamp DNA FFPE tissue kit (Qiagen, Германия) выделена тотальная ДНК. Качественную и количественную оценку ДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 1000 (NanoDrop, США). Изучение исследуемых полиморфных локусов выполняли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на амплификато-ре CFX96 (Bio-Rad, США). Последовательность прай-меров и проб подбирали с использованием программы OligoAnalysisVector NTI и генетического банка данных www.ncbi.nlm.nih.gov (табл. 2). Реакционная смесь в объеме 15 мкл включала 100 нг геномной ДНК; 0,5—1,5 мкл специфической пары праймеров и проб с концентрацией 1 о.е./мл; 200 мкМ каждого дезоксинуклеотид-трифосфата; 1,2—2,0 мкл буфера (60 мМ Трис-HCl (pH 8,5 при температуре 25 °C), 1,5 мМ MgC^, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 % Тритон X-100) и 0,5—1,0 ед. Taq ДНК-полимеразы (Медиген, Россия). Программу амплификации осуществляли в несколько этапов: денатурация при температуре 95 °С в течение 2 мин с последующими 40 циклами при температуре 95 °С в течение 10 с; отжиг 30 с при специфической температуре для каждой пары праймеров.
Уровень экспрессии генов ESR1, EGFR, AKT1, PTEN оценивали с помощью количественной обратно-транскриптазной ПЦР на амплификаторе CFX96 (BioRad, США). Дизайн праймеров и TaqMan-зондов представлен в табл. 3. ПЦР ставили в 3 повторах в объеме 15 мкл, содержащем 250 мкМ dNTPs (Sibenzyme, Россия), 300 нМ прямого и обратного праймеров, 200 нМ зонда, 2,5 мМ MgCl2, 19 SE buffer (67 мМ Трис-HCl (pH 8,8 при температуре 25 °C), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01 % Tween-20), 2,5 ед. HotStart Taq polymerase (Sibenzyme, Россия) и 50 нг комплементарной ДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл — 94 °С, 10 мин — предварительная денатурация; 40 циклов —
1-й шаг 94 °С, 10 с и 2-й шаг 60 °С, 20 с. Проверку чистоты ПЦР-продуктов проводили с использованием электрофореза в 2,5 % агарозном геле с 0,2 % бромистым этидием. Относительную экспрессию генов ESR1, EGFR, AKT1, PTEN определяли с помощью метода
2-ÄÄCT. Уровень экспрессии исследуемых генов нормировали по референсному гену GAPDH.
Изучение экспрессии ERa, EGFR, Akt (pS473) и PTEN проводили на парафиновых срезах иммуно-гистохимическим способом по стандартному протоколу. Использовали антитела фирмы Dako к рецепторам эстрогенов (клон 1D5, RTU, мышиные), EGFR (клон SP9, 1:100), Akt (pS473) (клон 14-5, 1:50) и PTEN (клон 6H2.1, 1:100). Экспрессию ERa оценивали количественным методом гисто-счета (Histo-Score). При этом подсчитывали процент положительных клеток и показатель экспрессии в баллах. Экспрессию EGFR, Akt (pS473) и PTEN оценивали в процентом содержании положительно окрашенных клеток в 10 полях зрения на 1000 клеток. При анализе экспрессии EGFR,
Таблица 1. Клинико-морфологические параметры больных исследуемых групп Table 1. Clinical and morphological parameters of the patients in the examined groups
Параметр
Тамоксифен-чувствитель-ная группа, n (%)
Тамоксифен-резистентна: группа, n (%)
Tamoxifen-sensitive group, n (%) | Tamoxifen-resistant group, n (%)
Возраст, лет: Age, years: <50 >50 35 (54,7) 29 (45,3) 13 (41,9) 18 (58,1) 0,343
Состояние менструальной функции: Menstrual function status: сохранена preserved менопауза menopause 42 (65,6) 22 (34,4) 14 (45,2) 17 (54,8) 0,093
Размер опухоли: Tumor size: Т1 Т2 T3—4 33 (51,5) 30 (46,9) 1 (1,6) 14 (45,2) 17 (54,8) 0 (0,0) 0,673 (T1 против T3—4) 0,673 (T1 versus T3-4)
Регионарные лимфатические узлы: Regional lymph nodes: N0 N1-3 44 (68,7) 20 (31,3) 18 (58,1) 13 (41,9) 0,426
Гистологический тип: Histological type: протоковый ductal дольковый lobular другие other 51 (79,7) 9(14,1) 4 (6,2) 27 (87,1) 3 (9,7) 1 (3,2) 0,471 (протоковый против долькового) 0,471 (ductal versus lobular)
Адъювантная химиотерапия: Adjuvant chemotherapy: проводилась was administered не проводилась was not administered 24 (37,5) 40 (62,5) 11 (35,5) 20 (64,5) 0,971
Примечание. N0 — без признаков поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; N1—3 — метастазы в регионарных лимфатических узлах.
Note. N0 — absence of signs of metastatic lesions in the regional lymph nodes; N1—3 — metastases in the regional lymph nodes.
cv
CS
и ш u
ж ш
и
Akt (pS473) и PTEN учитывали положительное мембранное и/или цитоплазматическое окрашивание (рис. 1).
Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета программ Sta-tistica 6.0 и SPSS 21.0. Распределение генотипов исследованных полиморфных локусов проверяли на соответствие равновесию Харди—Вайнберга. Для проверки гипотезы о значимости различий между исследуемыми группами использовали критерий согласия X2 или двусторонний критерий Фишера. Безрецидивную выживаемость больных РМЖ анализировали с помощью кривых Каплана—Майера и log rank-теста. Различия считали достоверными прир <0,05.
Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии
с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288) на основании разрешения локального комитета по биомедицинской этике НИИ онкологии Томского НИМЦ.
Результаты
Результаты генотипирования полиморфных локусов генов ESR1 (гз2077647, гб2228480, 181801132), ЕОГЯ (гб1468727, гб2227983), АКТ1 (ге1130233) и РТЕЫ (ге11202592) у больных РМЖ представлены в табл. 4. Показано, что мутантный аллель С ге2077647 гена ESR1 чаще встречается в опухолях, чувствительных к тамок-сифену по сравнению с опухолями, резистентными к данной терапии (60,8 и 44,0 % соответственно; р = 0,044). Кроме того, выявлено, что тамоксифен-чувствительную
CV
со
us
Таблица 2. Последовательность олигонуклеотидных праймеров и TaqMan-зондов для анализа полиморфизма исследуемых генов Table 2. Oligonucleotide primer and TaqMan probe sequences for analysis of polymorphisms in the studied genes
Локус Последовательность праймеров, 5'—3' Последовательность зондов, 5'—3' Температура отжига, °С
Locus 5'—3' primer sequence 5'-3' probe sequence Annealing
temperature, С
ESR1 rs2228480 GCTCTACTTCATCGCATTCCT TGCAGCAGGGATTATCTGAAC FAM-AGGGTTTCCCTGCCACAGTCTG ROX-TTCCCTGCCACGGTCTGAGAG 60
ESR1 rs2077647 CACGGACCATGACCATGAC GCTCCAGCTCGTTCCCTT FAM-CCACACCAAAGCATCCGGGA ROX-TCCACACCAAAGCATCTGGGATG 57
ESR1 rs1801132 CCAGATGGTCAGTGCCTTG CTGAAGGGTCTGGTAGGATCA FAM-ATGCTGAGCCCCCGATACTCTA ROX-ATGCTGAGCCCCCCATACTCTA 60
EGFR rs1468727 CCTGTTTTACTCTCTGGGCAT ATTATGTGATTTGTTCTGAGCCTAT FAM-TATTTAGGAGCAGGATAAGAGGACCA ROX-GGAGTAGGATAAGAGGACCAAGTTCA 60
EGFR rs2227983 AGGTCTGCCATGCCTTGT CTTGTCCACGCATTCCCT FAM- AGCCCAAGGACTGCGTCTCTT ROX- GAGCCCAGGGACTGCGTCT 60
AKT1 rs1130233 GTGTGCCTCAGGTTGCG TCCAGGGCTGACACAATCT FAM-GGAACGTGTGTTCTCCGAGGA ROX-CACCGTGTTTCTCCGAGGAC 60
PTEN rs11202592 GCTTCTGCCATCTCTCTCCT GTTTCTGCTAACGATCTCTTTGA FAM-TTTTCTTCAGCCACAGGGTCC ROX-CACAGGCTCCCAGACATGACA 60
И Ш
u
Таблица 3. Последовательность олигонуклеотидных праймеров и TaqMan-зондов для анализа экспрессии исследуемых генов Table 3. Oligonucleotide primer and TaqMan probe sequences for expression analisis of the studied genes
Ген Gene Последовательность праймеров, 5'-3' Последовательность зондов, 5'—3' 5'-3' probe sequence
ESR1 CAGGGTGGCAGAGAAAGATT GTAGCGAGTCTCCTTGGCA FAM-TGACAAGGGAAGTATGGCTATGGA
EGFR CTCCATGCCTTTGAGAACCTA CCAAGGATGTTATGTTCAGGCT FAM-CGGCAGGACCAAGCAACAT
AKT1 CTTCATCATCCGCTGCCT TCCTCCTCCTCCTGCTTCT FAM-GAGGAGCGGGAGGAGTGGA
PTEN AGCCGTTACCTGTGTGTGG CTGGTCCTGGTATGAAGAATGTA FAM-TCCACAAACAGAACAAGATGCTAAA
X ш
и
Рис. 1. Иммуногистохимически положительная экспрессия EGFR (а), Akt (pS473) (б) и PTEN (в) в опухолевой ткани молочной железы. Окраска диаминобензидином и гематоксилином (х 200)
Fig. 1. Immunohistochemically positive expression of EGFR (а), Akt (pS473) (б), and PTEN (в) in breast tumor tissue. Diaminobenzidine and hematoxylin staining (х 200)
Таблица 4. Распределение генотипов и аллелей генов ESR1, EGFR, AKT1, PTEN у больных исследуемых групп Table 4. Distribution of ESR1, EGFR, AKT1, PTEN gene genotypes and alleles in patients of the studied groups
Genotype/allele n Тамоксифен-резистентная группа, n (%) -
Тамоксифен-чувствительная группа, n (%)
Tamoxifen-sensitive group, n (%) | Tamoxifen-resistant group, n (%)
ESR1 rs2077647
TT 23 13 (21,7) 10 (40)
TC 27 21 (35,0) 8 (32)
CC 33 26 (43,3) 7 (28) 0,075 TT против CC
0,075 TT versus CC
T 47 (39,2) 28 (56)
C 73 (60,8) 22 (44) 0,044
ESR1 rs2228480
GG 64 46 (78) 18 (72)
GA 17 13 (22) 4 (16)
AA 3 0 (0) 3 (12) 0,028 GG против AA
0,028 GG versus AA
G 105 (89) 40 (80)
A 13 (11) 10 (20) 0,121
ESR1 rs1801132
CC 56 37 (63,8) 19 (76)
CG 23 18 (31,0) 5 (20)
GG 4 3(5,2) 1 (4) 0,593 CC против GG
0,593 CC versus GG
C 92 (79,3) 43 (86)
G 24 (20,7) 7 (14) 0,310
EGFR rs2227983
GG 43 30 (53,6) 13 (54,2)
GA 30 20 (35,7) 10 (41,6)
AA 7 6 (10,7) 1 (4,2) 0,656 GG против AA
0,656 GG versus AA
G 80 (71,4) 36 (75,0)
A 32 (28,6) 12 (25,0) 0,643
EGFR rs1468727 43
TT 13 32 (54,2) 11 (44)
TC 28 6 (10,2) 7 (28)
CC 21 (35,6) 7 (28) 0,956 TT против CC
0,956 TT versus CC
T 70 (59,3) 29 (58)
C 48 (40,7) 21 (42) 0,873
AKT1 rs1130233
GG 62 43 (71,7) 19 (76)
GA 21 15 (25,0) 6 (24)
AA 2 2 (3,3) 0 (0) 0,491 GG против AA
0,491 GG versus AA
G 101 (84,2) 44 (88)
A 19 (15,8) 6 (12) 0,507
PTEN rs11202592
CC 31 21 (35,6) 10 (40)
CG 53 38 (64,4) 15 (60)
GG 0 0 (0) 0 (0) 0,702 CC против GG
0,702 CC versus GG
C 80 (67,8) 35 (70)
G 38 (32,2) 15 (30) 0,778
cv
ев
и ш u
ж ш
и
группу пациентов отличает от тамоксифен-резистентной группы отсутствие мутантных генотипов GG ге2228480 гена ESR1 (0 и 12 % соответственно; р = 0,028). Для других полиморфных локусов изучаемых генов значимой связи с эффективностью терапии тамоксифеном не обнаружено.
Для определения уровня траскрипционной активности генов ESR1, ЕОЕЯ, АКТ1 и РТЕЫ изучены парные
образцы тканей опухоли молочной железы и условно нормальной ткани в 2 группах пациенток. Выявлено, что чувствительные и резистентные опухоли отличаются по уровню экспрессии 2 генов — ESR1 и АКТ1. Повышение уровня экспрессии ESR1 было характерно для тамоксифен-чувствительной группы больных по сравнению с тамоксифен-резистентной, однако
CO а
a
cv •й
„ с
3
CO 13
n
a
CS с
^
n
о
u
z
J
DC I
Э
u .0
ш I
CD
EE £
со ш о
X ш
О
60 50 40 30 20 10 0 -10
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4
p = 0,075
ТЧ / TS n = 31
ТР / TR n = 25
p = 0,014
ТЧ / TS n = 21
ТР / TR n = 3
6 14
£ 12
3
13 | 10 с
S
с 8
I 6
S I
5 4
<u ш
1 2
m
О
£ 0 -2
г 7 6 5 4 3 2 2 0 -2 -4
p = 0,165
ТЧ / TS n = 22
ТР / TR n = 4
p = 0,954
ТЧ / TS n = 20
ТР / TR n = 2
□ Среднее значение/Меап Q Среднее значение стандартная ошибка / Mean standard error
I Среднее значение 1,96 стандартная ошибка/Mean 1,96 standard error
Рис. 2. Уровень экспрессии генов ESR1 (a), EGFR (б), АКТ1 (в) и PTEN(г) у больных РМЖв зависимости от эффективности терапии тамокси-феном. Приведены средние значения ± SE. ТЧ — тамоксифен-чувствительная группа, ТР — тамоксифен-резистентная группа Fig. 2. ESR1 (a), EGFR (б), АКТ1 (в), and PTEN (г) gene expression levels in patients with breast cancer depending on tamoxifen therapy effectiveness. Mean values ± SE. TS — tamoxifen-sensitive group, TR — tamoxifen-resistantgroup
Таблица 5. Уровень экспрессии EGFR, Akt (pS473) и PTEN в образцах опухолевой ткани у больных исследуемых групп Table 5. EGFR, Akt (pS473), and PTEN expression levels in the tumor tissue samples from the patients of the studied groups
Параметр n Тамоксифен-чувствительная группа, n (%) Тамоксифен-резистентная группа, п (%) Р
ВшйМйнйймШиШ^ВивВ
EGFR: отрицательная negative положительная positive 38 25 27 (75,0) 9(25,0) И (40,7) 16(59,3) 0,006
Akt (pS473): отрицательная negative положительная positive 18 8 17(77,3) 5(22,7) 1 (25,0) 3(75,0) 0,037
PTEN: отрицательная negative положительная positive 15 11 12 (54,5) 10(45,5) 3 (75,0) 1 (25,0) 0,426
в
0,1
0,8
ce 0,6
0,4
0,2
£0,0
ESR1 rs228480 _i-i GG + GA
_i-i AA
—I— Цензурированные / Censored —I— Цензурированные / Censored Log rank p = 0,043
0
20
80
40 60
Время, мес/Time, months
Медиана безреци-
GG + GA AA
Число пациентов /Number of patients
19 27
Цензурированные
наблюдения/ рецидив / Censored observations/ recurrence
48/16 3/0
дивного периода (90 % доверительный интервал) / Median recurrence-free period (90 % confidence interval) 74,0 (41,3 x 106,7) 24,0 (19,2 x 28,8)
различия не достигали статистическом значимости (27,56 ± 15,07 и 0,53 ± 0,42 соответственно; p = 0,075) (рис. 2а). Более значимое повышение содержания мРНК гена AKT1 отмечено у пациенток с РМЖ без про-грессирования заболевания, чем среди больных, не отвечающих на терапию тамоксифеном (7,27 ± 5,29 и 0,02±0,01 соответственно; p = 0,014) (рис. 2в).
При изучении уровня экспрессии белковых продуктов генов EGFR, AKT1 и PTEN показано, что риск прогрессирования заболевания на фоне тамоксифена значительно выше у больных с положительной экспрессией EGFR и Akt (pS473) (p = 0,006 и 0,037 соответственно; табл. 5).
Для оценки потенциальной прогностической значимости исследуемых маркеров мы провели анализ безрецидивной выживаемости у пациенток с РМЖ. Выявлено, что носительство мутантного варианта гена ESR1 rs2228480 сопряжено с низкими показателями безрецидивной выживаемости у больных эстрогенза-висимым РМЖ (log rankp = 0,043) (рис. 3). Наличие положительного уровня экспрессии в опухоли EGFR и Akt (pS473) ассоциировано со значительным уменьшением времени до прогрессирования заболевания у пациентов исследуемой группы (log rank p = 0,014 и 0,048 соответственно) (рис. 4).
CV
CS
и ш u
Рис. 3. Показатели безрецидивной выживаемости у больных РМЖ в зависимости от генотипов гена ESR1 (rs2228480) Fig. 3. Recurrence-free survival in patients with breast cancer depending on ESR1 (rs2228480) gene genotype
Обсуждение
Принимая во внимание ранее полученные нами данные о взаимосвязи высокого уровня экспрессии
L, 0,1
0,8
0,6
0,4
0,2
е
£0,0-
е
LO
Akt (pS473)
_п Негативная / Negative _п Позитивная / Positive —I— Цензурированные / Censored —I— Цензурированные / Censored
Log rank p = 0,048
20 40
Время, мес / Time, months
60
б
Отрицательная / Negative AA
Число пациентов /Number of patients
64 3
Цензурированные
наблюдения/ рецидив / Censored observations/ recurrence 19/0 21/6
Медиана безрецидивного периода (90 % доверительный интервал) / Median recurrence-free period (90 % confidence interval) Не достигнута / Not reached Не достигнута / Not reached
0,1
g 0,8
0,6
0,4
* 0,2 а н в и ч и
I 0,0
з е
LO
EGFR
Негативная / Negative Позитивная / Positive Цензурированные / Censored Цензурированные / Censored
Log rank p = 0,014
20
Число
наблюдения/
пациен-, рецидив / Censored
тов /Number .
100
120
Отрицательная / Negative AA
of patients 38 25
40 60 80
Время, мес / Time, months Цензурированные Медиана безрецидивного периода (90 % доверительный интервал) /
Median recurrence-free period (90 % confidence interval) Не достигнута / Not reached 45,0 (20,9 x 69,0)
observations/ recurrence 27/11 9/16
Рис. 4. Показатели безрецидивной выживаемости у больных РМЖ в зависимости от экспрессии Akt (pS473) (а) и EGFR (б) Fig. 4. Recurrence-free survival in patients with breast cancer depending on Akt (pS473) (а) and EGFR (б) gene expression
X ш
и
а
0
0
CV
со
US
и ш u
X ш
и
EGFR, а также ассоциации мутантного варианта гена ESR1 rs2228480 с низкой эффективностью гормональной терапии тамоксифеном у больных РМЖ [13], мы провели комплексную оценку основных компонентов EGFR/PI3K/AKT-сигнального пути в группах пациенток с эстрогензависимым РМЖ, различных по эффективности лечения тамоксифеном.
В ходе настоящего исследования мы последовательно проанализировали генетическую компоненту (полиморфизм генов и уровень экспрессии мРНК), а также белковый статус EGFR/PDK-ассоциирован-ных факторов у больных РМЖ тамоксифен-резистент-ной и тамоксифен-чувствительной групп.
Мы показали, что потенциальными маркерами, определяющими чувствительность к тамоксифену, являются SNP rs2077647 гена ESR1 и уровень экспрессии мРНК гена AKT1. Неэффективность терапии тамок-сифеном может быть связана с наличием мутантных генотипов гена ESR1 rs2228480 и положительного экс-прессионного статуса белков EGFR и Akt (pS473). Важно, что выявленные маркеры резистентности продемонстрировали значимый прогностический потенциал в отношении показателей выживаемости у больных эстрогензависимым РМЖ.
SNP rs2077647, локализующейся в 1-м экзоне гена ESR1, является функционально нейтральной мутацией, которая не приводит к изменению биологической активности продукта экспрессии гена [16]. Получены данные о том, что мутантный аллель С данного полиморфного варианта является протективным фактором в отношении развития РМЖ [17, 18]. Возможно, потенциальный «благоприятный» эффект в отношении риска развития РМЖ и чувствительности к гормональной терапии обусловлен сильным неравновесным сцеплением данного полиморфизма с близко расположенными SNP локусами ESR1.
SNP rs2228480 представляет собой синонимичную нуклеотидную замену 8-м экзоне гена ESR1, функциональная роль которой полностью не известна. Однако полагают, что данная точечная мутация может способствовать нарушению сайтов связывания эстрогеновых рецепторов для взаимодействия с коактиваторами [19]. Вероятно, что результатом таких нарушений может быть образование функционально неактивного рецептора, неспособного полноценно взаимодействовать с тамоксифеном, что потенциально определяет развитие резистентности. Следует отметить, что подобные исследования связи ESR1 rs2228480 с эффективностью тамоксифена у больных РМЖ в отечественных и зарубежных источниках отсутствуют.
Участие EGFR в механизмах резистентности к гормональной терапии в настоящее время не подлежит сомнению. Гиперэкспрессия EGFR в опухолях, не отвечающих на тамоксифен, и ее неблагоприятная прогностическая значимость у больных эстроген-положительным РМЖ продемонстрирована в настоящем исследовании и подтверждена многочисленными опубликованными данными [20—22].
В отличие от EGFR, определение экспрессии мРНК AKT1 как потенциального маркера резистентности к тамоксифену остается в настоящее время спорным. Данные экспериментальных исследований свидетельствуют о прямой зависимости высокого уровня экспрессии AKT1 и развития тамоксифен-чувствительно-го фенотипа клеток опухолевых линий РМЖ [23]. Результаты клинических работ указывают на отсутствие связи экспрессии мРНК AKT1 с ответом на тамок-сифен [24, 25]. Однако исследования, касающиеся белкового продукта гена AKT1, позволили выявить четкие ассоциации экспрессии Akt (pS473) с неблагоприятным исходом у больных РМЖ на фоне адъювант-ного применения тамоксифена [14]. Показано, что высокий уровень ядерной экспрессии Akt (pS473) коррелирует с неэффективным ответом на тамоксифен у больных РМЖ в период постменопаузы без метастатического поражения регионарных лимфатических узлов [26]. Вероятно, что более существенным и информативным в прогностическом плане является уровень продукции фосфорилированной формы белка по сравнению с уровнем экспрессии мРНК, поскольку именно фосфорилирование (в большей степени по аминокислотному остатку Ser-473) определяет функциональную активность Akt.
Заключение
Таким образом, на основании проанализированных данных литературы и результатов настоящего исследования можно предполагать высокую степень активации EGFR/PDK/AKT-сигнального пути в опухолях, резистентных к тамоксифену, обусловленную, в том числе, значительной экспрессией EGFR и фосфори-лированной формы белка Akt. Вклад в реализацию тамоксифен-чувствительного/резистентного феноти -па опухоли вносит как функциональная активность рецепторных тирозинкиназ (EGFR, в частности), обеспечивающих фосфорилирование ERa и его лигандне-зависимую активацию, так и полиморфные сайты ESR1, затрагивающие лигандзависимые (SNP rs2228480) и лиганднезависимые (SNP rs2077647) области гена, способствующие изменению активности ERa.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Senkus E., Kyriakides S., Penault-Llorca F. et al. Primary breast cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2013;24:vi7-vi23.
DOI: 10.1093/annonc/mdt284. PMID: 26314782.
2. Burstein H.J., Lacchetti C., Anderson H. et al. Adjuvant Endocrine therapy for women with hormone receptor-positive breast cancer: American Society
of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update on ovarian suppression. J Clin Oncol 2016;34(14):1689—701. DOI: 10.1200/JCO.2015.65.9573. PMID: 26884586.
3. Crew K.D., Albain K.S., Hershman D.L. et al. How do we increase uptake
of tamoxifen and other anti-estrogens for breast cancer prevention? NPJ Breast Cancer 2017;3(20):1-7. DOI: 10.1038/s41523-017-0021-y. PMID: 28649660.
4. Pan H., Gray R., Braybrooke J. et al. 20-year risks of breast-cancer recurrence after stopping endocrine therapy at 5 years.
N Engl J Med 2017;377:1836-46. DOI: 10.1056/NEJMoa1701830. PMID: 29117498.
5. Chang M. Tamoxifen resistance in breast cancer. Biomol Ther (Seoul) 2012;20(3): 256-7. DOI: 10.4062/biomolther. 2012.20.3.256. PMID: 24130921.
6. Velloso F.J., Bianco A.F., Farias J.O. et al. The crossroads of breast cancer progression: insights into the modulation of major signaling pathways. Oncol Targets Ther 2017;10:5491-524.
DOI: 10.2147/OTT.S142154. PMID: 29200866.
7. Wee P., Wang Z. Epidermal growth factor receptor cell proliferation signaling pathways. Cancers(Basel) 2017;9(5):52. DOI: 10.3390/cancers9050052. PMID: 28513565.
8. Paplomata E., O'Regan R. The PI3K/ AKT/mTOR pathway in breast cancer: targets, trials and biomarkers. Ther Adv Med Oncol 2014;6(4):154-66.
DOI: 10.1177/1758834014530023. PMID: 25057302.
9. Lee J.J., Loh K., Yap Y.S. PI3K/Akt/ mTOR inhibitors in breast cancer. Cancer Biol Med 2015;12(4):342-54.
DOI: 10.7497/j.issn.2095-3941. 2015.0089. PMID: 26779371. 10. Giltnane J.M., Ryden L., Cregger M. et al. Quantitative measurement of epidermal
growth factor receptor is a negative predictive factor for tamoxifen response in hormone receptor positive premeno-pausal breast cancer. J Clin Oncol 2007;25:3007-14. DOI: 10.1200/ JCO.2006.08.9938. PMID: 17634479.
11. Massarweh S., Osborne C.K., Creighton C.J. et al. Tamoxifen resistance in breast tumors is driven by growth factor receptor signaling with repression of classic estrogen receptor genomic function. Cancer Res 2008;68(3):826-33.
DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-07-2707. PMID: 18245484.
12. Kim S., Lee J., Oh S.J. et al. Differential effect of EGFR inhibitors on tamoxifen-resistant breast cancer cells. Oncol Rep 2015;34(3):1613-9. DOI: 10.3892/or. 2015.4116. PMID: 26166014.
13. Babyshkina N., Vtorushin S., Zavyalova M. et al. The distribution pattern of ERa expression, ESR1 genetic variation and expression of growth factor receptors: association with breast cancer prognosis in Russian patients treated with adjuvant tamoxifen.
Clin Exp Med 2017;17(3):383-93. DOI: 10.1007/s10238-016-0428-z. PMID: 27225751.
14. Kirkegaard T., Witton C.J., McGlynn L.M. et al. AKT activation predicts outcome
in breast cancer patients treated with tamoxifen. J Pathol 2005;207:139-46. DOI: org/10.1002/path.1829. PMID: 16088978.
15. Tanic N., Milovanovic Z., Tanic N. et al. The impact of PTEN tumor suppressor gene on acquiring resistance to tamoxifen treatment in breast cancer patients. Cancer Biol Ther 2012;13(12):1165-74. DOI: 10.4161/cbt.21346.
PMID: 22892847.
16. Li T., Zhao J., Yang J. et al. A Metaanalysis of the association between ESR1 genetic variants and the risk of breast cancer. PLoS One 2016;11(4):e0153314. DOI: 10.1371/journal.pone.0153314. PMID: 27070141.
17. Hsiao W.C., Young K.C., Lin S.L. et al. Estrogen receptor-alpha polymorphism in a Taiwanese clinical breast cancer population: a case-control study. Breast Cancer Res 2004;6(3):180-6.
DOI: 10.1186/bcr770. PMID: 15084241.
18. Fernandez L.P., Milne R.L., Barroso E. et al. Estrogen and progesterone receptor gene polymorphisms and sporadic breast cancer risk: a Spanish case-control study.
Int J Cancer 2006;119(2):467-71. DOI: 10.1002/ijc. 21847. PMID: 16477637.
19. Anghel A., Raica M., Narita D. Estrogen receptor alpha polymorphisms: correlation with clinicopathological parameters in breast cancer. Neoplasma 2010;57(4):306-15. PMID: 20429621.
20. Chong K., Subramanian A., Sharma A.
et al. Measuring IGF-1, ER-a and EGFR expression can predict tamoxifen-resistance in ER-positive breast cancer. Anticancer Res 2011;31(1):23-32. PMID: 21273576.
21. Xuan Q.J., Wang J.X., Nanding A. et al. Tumor-associated macrophages are correlated with tamoxifen resistance
in the postmenopausal breast cancer patients. Pathol Oncol Res 2014;20(3):619-24. DOI: 10.1007/ s12253-013-9740-z. PMID: 24414992.
22. Bae S.Y., Nam S.J., Lee S.K. et al. Tamoxifen resistance: EGFR expression in hormone receptor-positive and HER2 negative breast cancer. In: Proceedings of the 2016 San Antonio Breast Cancer Symposium: Report abstract Cancer Res 2017;77(4):9-36.
DOI: 10.1158/1538-7445.
23. van Agthoven T., Veldscholte J., Smid M. et al. Functional identification of genes causing estrogen independence of human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2009;114(1):23-30.
DOI: 10.1007/s10549-008-9969-5. PMID: 18351453.
24. van Agthoven T., Godinho M.F., Wulfkuhle J.D. et al. Protein pathway activation mapping reveals molecular networks associated with antiestrogen resistance in breast cancer cell lines. Int J Cancer 2012;131(9):1998-2007.
DOI: 10.1002/ijc. 27489.
25. Riggio M., Perrone M.C., Polo M.L. et al. AKT1 and AKT2 isoforms play distinct roles during breast cancer progression through the regulation of specific downstream proteins. Sci Rep 2017;7:44244. DOI: 10.1038/srep44244. PMID: 28287129.
26. Bostner J., Karlsson E., Pandiyan M.J. et al. Activation of Akt, mTOR, and the estrogen receptor as a signature
to predict tamoxifen treatment benefit. Breast Cancer Res Treat 2013;137(2):397-406. DOI: 10.1007/s10549-012-2376-y. PMID: 23242584.
cv
CS
и ш u
X ш
и
CV
со
us
Вклад авторов
Т.А. Дронова: написание текста рукописи, обзор публикаций по теме статьи, анализ полученных данных;
Н.Н. Бабышкина: написание текста рукописи, анализ полученных данных;
М.В. Завьялова, С.В. Паталяк: получение данных для анализа, анализ полученных данных;
Е.М. Слонимская: получение данных для анализа, разработка дизайна исследования;
Н.В. Чердынцева, Ю.Г. Кжышковска: разработка дизайна исследования.
О Authors' contributions О
Z T.A. Dronova: article writing, reviewing of publications of the article»s theme, analysis of the obtained data;
02 N.N. Babyshkina: article writing, analysis of the obtained data;
2 M.V. Zavyalova, S.V. Patalyak: obtaining data for analysis, analysis of the obtained data;
Jj E.M. Slonimskaya: obtaining data for analysis, developing the research design; N.V. Cherdyntseva, J.G. Kzhyshkowska: developing the research design.
Ej ORCID авторов/ORCID of authors
«л Т.А. Дронова/T.A. Dronova: https://orcid.org/0000-0003-3009-2404 ш
О Н.Н. Бабышкина/N.N. Babyshkina: https://orcid.org/0000-0002-0562-3878
el М.В. Завьялова/M.V. Zavyalova: https://orcid.org/0000-0001-9429-9813
ca С.В. Паталяк/S.V. Patalyak: https://orcid.org/0000-0002-9468-1980
^ Е.М. Слонимская/E.M. Slonimskaya: https://orcid.org/0000-0003-4382-5697
as Н.В. Чердынцева/N.V. Cherdyntseva: https://orcid.org/0000-0003-1526-9013
£ Ю.Г. Кжышковска/J.G. Kzhyshkowska: https://orcid.org/0000-0003-0898-3075
ЭС Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. О Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РФФИ № 17-29-06037 офи_м «Геномные механизмы регуляции Е опухолевой прогрессии рака молочной железы в условиях лекарственной терапии».
22 Financing. The study was supported by the grant of the Russian Foundation for Basic Research No. 17-29-06037 «Genomic regulation of the breast ¡■^ cancer progression during chemotherapy».
X ш
и
Информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study.
Статья поступила: 05.07.2018. Принята к публикации: 10.08.2018. Article received: 05.07.2018. Accepted for publication: 10.08.2018.
