РОЛЬ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА βI ТИПА (TGF-BRI) В ПРОГРЕССИРОВАНИИ ЛЮМИНАЛЬНОГО ПОДТИПА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭKСПЕРИMЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

DOI: 10.21294/18144861-2017-16-2-27-35 УДК: 618.19-006.6-08:577.112:577.21:577.169

Для цитирования: Бабышкина Н.Н., Вторушин С.В., Дронова Т.А., Крахмаль Н.В., Завьялова М.В., Цыганов М.М., Паталяк С.В., Слонимская Е.М., Чердынцева Н.В. Роль рецептора трансформирующего фактора роста bI типа (TGF-ßRI) в прогрессировании люминального подтипа рака молочной железы. Сибирский онкологический журнал. 2017; 16 (2): 27-35. - DOI: 10.21294/18144861-2017-16-2-27-35

For citation: Babyshkina N.N., Vtorushin S.V. , Dronova T.A., Krakhmal N.V., Zavyalova M.V. , Tsyganov M.M.,Patalyak S.V. , Slonimskaya E.M., Cherdyntseva N.V. Role of transforming growth factor receptor bl type (TGF-BRI) in the progression of the luminal breast cancer subtype. Siberian Journal of Oncology. 2017; 16 (2): 27-35. - DOI: 10.21294/18144861-2017-16-2-27-35

роль рецептора трансформирующего фактора

роста ßl типа (TGF-BRI) Б прогрЕССИроВАНИИ люминального подтипа рака молочной ЖЕЛЕЗЫ

Н.Н. Бабышкина12, С.Б. Бторушин13, т.А. Дронова2, Н.Б. Крахмаль13, М.Б. Завьялова123, М.М. Цыганов12, С.Б. паталяк1, Е.М. Слонимская13, Н.Б. Чердынцева12

Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, г. Томск, Россия1 634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: [email protected]

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет», г. Томск, Россия2 634050, г. Томск, пр. Ленина, 362

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Mинздрава РФ, г. Томск, Россия3 634050, г. Томск, Mосковский тракт, 23

Аннотация

Введение. Перекрестные связи между сигнальными путями эстрогеновых рецепторов и рецепторов факторов роста могут играть важную роль в возможном снижении устойчивости опухолей молочной железы к эндокринной терапии. Целью исследования явилось изучение взаимосвязи белковой и генной экспрессии рецептора трансформирующего фактора роста р1 типа (TGF-pRI) и его полиморфных вариантов с эффективностью адъювантной терапии тамоксифеном при люминальном раке молочной железы (РМЖ). Материал и методы. В исследование включено 105 пациенток с люминальным подтипом РМЖ (Т1-3^-3М0), получавших тамоксифен в адъювантном режиме в стандартной дозировке 20 мг/сут. При оценке отдаленных результатов лечения пациентки, имевшие прогрессирование заболевания на фоне приема тамоксифена, составили тамоксифен-резистентную группу (ТАМ-Р), больные без признаков прогрессирования - тамоксифен-чувствительную группу (ТАМ-Ч). Уровень экспрессии гена TGF-BRI и полиморфизм TGF-BR1 (^334354) были изучены с помощью ПЦР в режиме реального времени. Белковая экспрессия TGF-pRI в опухоли была оценена иммуногистохимическим методом. Результаты. Выявлен высокий уровень экспрессии мРНК TGF-BRI в опухоли у больных люминальным А подтипом по сравнению с люминальным В РМЖ (р=0,050). Показано, что носители мутантных генотипов и аллелей гена TGF-BRI (^334354) чаще встречались у пациенток с люминальным А раком молочной железы (р=0,019 и р=0,007 соответственно). Уровень экспрессии белка TGF-pRI был значимо выше в тамоксифен-чувствительной группе по сравнению с тамоксифен-резистентными пациентками без учета подтипа опухоли (р=0,043). При разделении больных по молекулярному подтипу выявлена тенденция к взаимосвязи высокого уровня белковой экспрессии TGF-pRI с чувствительностью к терапии тамоксифеном среди больных люминальным В раком молочной железы (р=0,090). Заключение. Уровень экспрессии TGF-pRI в опухолевой ткани может рассматриваться в качестве потенциального молекулярно-генетического маркера эффективности эндокринной терапии тамоксифеном у больных люминальным раком молочной железы.

Ключевые слова: люминальный рак молочной железы, эндокринная терапия, тамоксифен, рецептор трансформирующего фактора роста р! типа (ТвР-ВИ), полиморфизм генов.

Бабышкина Наталия Николаевна, [email protected] СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2017; 16(2): 27-35

Люминальный рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся молекулярным подтипом, который характеризуется наличием позитивной экспрессии рецепторов к стероидным гормонам и высокими показателями чувствительности к эндокринной терапии [1, 2]. Люминальный РМЖ представляет собой гетерогенную группу опухолей: люминальный А подтип является положительным по экспрессии к эстроген/прогестерону (ERa/PR), без гиперэкспрессии рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (НЕЯ2), с низким индексом пролифератив-ной активности Ю67; люминальный В тип может быть представлен подтипами, положительными по экспрессии к ERa/PR, без гиперэкспрессии НЕИ2, с высоким индексом Ю67, а также опухолями, позитивными по экспрессии рецепторов как к стероидным гормонам, так и к HER2. Несмотря на то, что эндокринотерапия является наиболее эффективным и низкотоксичным методом лечения больных люминальным РМЖ, преодоление развития резистентности к данной терапии остается одной из актуальных проблем.

В качестве возможных механизмов формирования резистентности к эндокринной терапии в настоящее время рассматривается двунаправленное взаимодействие между эстрогеновыми рецепторами и сигнальными путями трансформирующего фактора роста Р1 (ГОР-р1), который играет важную роль в процессах клеточной пролиферации и дифференцировки большинства эпителиальных опухолей [3]. В TGF-pl/Smad-сигнальную трансдукцию вовлечены два типа мембранных рецепторов - TGF-pRI и TGF-PRII. Классический сигнальный каскад включает связывание TGF-P1 с внеклеточным доменом рецептора II типа, что приводит к последующей активации рецептора I типа и фосфорилированию белков Smad2 и Smad3. Smad2/3 комплексируются с Smad4 и образуют гетеромерный комплекс Smad2/3/4, который транс-лоцируется внутрь клеточного ядра, где может связываться с активирующими белками и функционировать как транскрипционный активатор, индуцирующий экспрессию генов-мишеней, вовлеченных в регуляцию процессов клеточного цикла [4]. Клинико-экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что ядерные эстрогеновые рецепторы блокируют TGF-P1 сигнальный путь посредством деградации его основных компонентов Smad2/3 и активации МАРК [5, 6]. В свою очередь, Smad3 и Smad4 способны выступать в роли коактиваторов и корепрессоров соответственно ERa-индуцированной экспрессии генов-мишеней, ответственных за регуляцию пролиферации [7, 8].

Среди мембранных рецепторов Тир-Р1 наиболее полно представлены результаты исследования в плане прогностической значимости лишь для TGF-PRII, однако они далеко не однозначны. Показано, что высокий уровень экспрессии TGF-

РКИ ассоциирован с наличием метастазов в регионарные лимфоузлы и низкими показателями пятилетней безметастатической выживаемости у больных РМЖ независимо от молекулярного подтипа [9]. Согласно другим данным, отсутствие экспрессии TGF-pRII в опухолевой ткани связано с гематогенным метастазированием у больных НЕЯ2 позитивным РМЖ [10]. Единичные исследования посвящены изучению TGF-pRII как маркера чувствительности к адъювантной гормональной терапии. В недавних работах было продемонстрировано, что потеря экспрессии TGF-pRII является одним из механизмов неэффективности эндокринной терапии у больных РМЖ [11]. Следует отметить, что в литературных источниках не изучена роль TGF-pRI в сопоставлении с эффективностью терапии тамоксифеном у больных РМЖ. Однако TGF-pRI является не менее важным звеном TGF-P1/Smad сигнального пути. Наличие в структуре рецептора консервативного 30 аминокислотного региона, так называемого SG-субдомена, содержащего SGSGSG последовательность, фос-форилирование которого определяет передачу внутриклеточного сигнала, является уникальной особенностью TGF-pRI [12].

TGF-pRI представляет собой трансмембранный серин/треонинкиназный рецептор с молекулярной массой 55 кД, который содержит сигнальный пептид, богатый цистеином ^гликозилированный внеклеточный домен, цитоплазматический ки-назный домен и короткий С-концевой хвост. В настоящее время выделено множество полиморфных форм гена TGF-pRI, один из которых - одно-нуклеотидный полиморфизм (SNP) в 7 интроне Int7G24A (ге334354) - представляет собой замену гуанина на аденин (А) в 24 позиции донорного сайта. Функциональная роль данного интронного варианта остается не до конца понятной, хотя предполагается, что подобные мутационные замены нуклеотидов могут опосредованно влиять на экспрессию гена на уровне транскрипции либо изменять сплайсинг РНК [13]. В настояшее время имеются единичные данные о взаимосвязи Int7G24A SNP с клиническим течением рака молочной железы [13]. Следует отметить, что прогностическая значимость данной интронной мутации во взаимосвязи с уровнем экспрессии как гена, так и белка TGF-pRI у больных люминальным РМЖ остается в настоящее время неизученной.

Целью исследования явилось изучение взаимосвязи белковой и генной экспрессии рецептора трансформирующего фактора роста РТ типа и его полиморфных вариантов с эффективностью адъю-вантной терапии тамоксифеном при люминальном раке молочной железы.

Материал и методы

В исследование были включены 105 пациенток с операбельным раком молочной железы Т К М0

стадии, получавших лечение в отделении общей онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ с 2002 по 2014 г. У всех больных диагноз был подтвержден морфологически. Всем пациенткам было выполнено радикальное хирургическое лечение, лучевая и химиотерапия - по показаниям. Обязательным условием для включения больных в исследование было проведение адъювантной эндокринтерапии (тамоксифен в стандартной дозировке 20 мг/сут). Неоадъювантное лечение не проводилось. Для определения подтипа люминаль-ного рака молочной железы была использована классическая панель из иммуногистохимических маркеров ЕЯа, РЯ, НЕЯ2 и Ю67. К люминальному А подтипу РМЖ относили опухоли с негативной экспрессией НЕЯ2, позитивной экспрессией рецепторов к эстрогенам и прогестерону и пролифера-тивной активностью менее 20 %. К люминальному В подтипу - гормон-положительные опухоли как с позитивной, так и с негативной экспрессией НЕЯ2 и высоким уровнем пролиферативной активности (Ю67>20 %).

Из 105 пациенток, включенных в исследование, 65 (61,9 %) имели люминальный А подтип рака молочной железы, 40 (38,1 %) - люминальный В подтип (табл. 1). Возраст больных варьировался от 30 до 79 лет, в среднем - 54,5 ± 0,9 года. Доля молодых женщин (до 50 лет включительно) в обеих группах составила 43,1 % и 40,0 % соответственно, соотношение женщин старше 50 лет также статистически не различалось в зависимости от подтипа опухоли (р=0,915). В зависимости от размера первичной опухоли наблюдалась тенденция к увеличению

размера опухолевого узла у больных люминальным В РМЖ (р=0,053). Не было найдено ассоциаций между исследуемыми группами и менструальным статусом пациенток (р=0,220), лимфогенным мета-стазированием (р=0,477), гистологическим типом опухоли (р=0,898) и адъювантной химиотерапией (р=0,826). Таким образом, сравниваемые группы пациенток с люминальным раком молочной железы были сопоставимы по основным клинико-морфологическим параметрам.

Отдаленные результаты лечения оценивались по факту прогрессирования заболевания в виде отдаленных метастазов, на основании которых были сформированы две группы больных. Первую группу составили пациентки без признаков прогрессирования (тамоксифен-чувствительная группа -ТАМ-Ч, n=53), вторую - с прогрессированием заболевания (тамоксифен-резистентная подгруппа -ТАМ-Р, n=39). Все случаи прогрессирования наблюдались на фоне адъювантной терапии тамок-сифеном. Среднее время до прогрессирования -28,6 ± 17,8 мес.

Материалом для исследования служили образцы опухолевой и прилежащей нормальной ткани. Для изучения уровня экспрессии гена TGF-/3RI из опухолевой и прилежащей нормальной ткани с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Германия), была выделена тотальная РНК. Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid™ (Fermentas, Литва). Уровень экспрессии гена TGF-/3RI оценивали при помощи количественной ПЦР в режиме реального

Таблица 1

Клинико-морфологическая характеристика больных РМЖ в зависимости от молекулярного подтипа опухоли

Параметры Люминальный A (n=65) Люминальный B (n=40) Р

Возраст

<50 лет 28 (43,1 %) 16 (40,0 %) 0,915

>50 лет 37 (56,9 %) 24 (60,0 %)

Состояние менструальной функции

Сохранена 31 (47,7 %) 24 (60,0 %) 0,220

Менопауза 34 (52,3 %) 16 (40,0 %)

Размер опухоли

Т1 30 (46,2 %) 16 (40,0 %)

Т2 35 (53,8 %) 21 (52,5 %) 0,053

Т3-4 0 (0,0 %) 3 (7,5 %)

Лимфогенное метастазирование

N0 45 (69,2 %) 25 (62,5 %) 0,477

N1-3 20 (30,8 %) 15 (37,5 %)

Гистологический тип

Протоковый 51 (78,5 %) 31 (77,5 %)

Дольковый 10 (15,3 %) 5 (12,5 %) 0,898

Другие 4 (6,2 %) 4 (10,0 %)

Адъювантная химиотерапия

Да 42 (64,6 %) 25 (62,5 %) 0,826

Нет 23 (35,4 %) 15 (37,5 %)

времени (qPCR) на амплификаторе CFX96 («BioRad», США). Праймеры и зонды (FAM-BHQ1) были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11,5 и базы данных NCBI. ПЦР ставили в объеме 15 мкл, содержащем 250 мкМ dNTPs (Sibenzyme, Россия), 300 нМ прямого и обратного праймеров, 200 нМ зонда, 2,5 мМ MgCl2, 19 SE buffer (67 мМ Tris-HCl pH 8,8 при 25°C, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01 % Tween - 20), 2,5 ед. Taq polymerase (Sibenzyme, Россия) и 50 нг кДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл - 94°С, 10 мин - предварительная денатурация; 40 циклов - 1-й шаг 94°С, 10 сек и 2-й шаг 20 сек, - при температуре 60°С. Уровень экспрессии TGF-ßRI нормализовали по отношению к экспрессии гена GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase). Уровень экспрессии гена TGF-ßRI был оценен в относительных единицах с помощью метода 2 -AACT (Livak).

Для оценки полиморфных вариантов гена TGF-ßRI проводилось выделение ДНК из образцов опухолевой ткани с помощью наборов QIaamp DNA FFPE tissue kit (Qiagen, Германия). Качественная и количественная оценка ДНК проведена на спектрофотометре NanoDrop-1000 («NanoDrop», США). Изучение полиморфных вариантов TGF-ßRI Int7G24A (rs334354) выполнено с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Последовательность праймеров и проб подбирали при помощи программы OligoAnalysisVector NTI с использованием генетического банка данных (www.ncbi.nlm.nih. gov). Реакционная смесь для ПЦР объемом 15 мкл включала 100 нг геномной ДНК; 0,5-1,5 мкл специфической пары праймеров и проб с концентрацией

1 о.е./мл; 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтри-фосфата; 1,2-2,0 мкл буфера (60 мМTris-HCl (pH 8,5 при 25°C), 1,5 мМ Mga2; 25 мМКС1; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 % Тритон X-100) и 0,5-1,0 ед. Taq ДНК-полимеразы («Медиген», Новосибирск). Программа амплификации предполагала предварительную денатурацию при 95°С в течение

2 мин, с последующими 40 циклами денатурации

при 95°С (10 сек), отжиг при 60°С (30 сек) на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США).

Изучение экспрессии рецепторов к половым гормонам, HER2, Ki67 и TGF-ßRI проводили на парафиновых срезах иммуногистохимическим способом. Использовались антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогенов (клон 1D5, RTU, мышиные), прогестерона (клон PgR 636, RTU, мышиные), к онкопротеину c-erbB-2 (HER2) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные «Novocastra») и к TGF-ßRI (клон 8А11, рабочее разведение 1:50, «Novocastra»).

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93, № 2288) на основании разрешения локального комитета по биомедицинской этике НИИ онкологии Томского НИМЦ.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 7.0. Применялся критерий %2, обсуждались результаты с достоверностью различий при р<0,05.

Результаты

Выявлено, что у больных люминальным А подтипом уровень экспрессии гена TGF-ßRI значимо выше (7,07 ± 2,99) по сравнению с люминальным В РМЖ (1,81 ± 0,55; р=0,050; рис. 1). При сравнении особенностей белковой экспрессии TGF-ßRI в опухолевой ткани больных люминальным А и В подтипами статистически значимых различий обнаружено не было (табл. 2). Оценка полиморфных вариантов гена TGF-ßRI показала значимое увеличение частоты встречаемости мутантного Int7G24AA генотипа и Int7G24A аллеля среди больных с люминальными А опухолями по отношению к люминальным В подтипам (p=0,019 и p=0,007 соответственно).

Изучение взаимосвязи исследуемых маркеров с эффективностью адъювантной терапии тамоксифе-ном было проведено как в общей группе больных РМЖ, так и в группах пациенток с люминальным

Таблица 2

Экспрессия белка TGF-BRI и полиморфизм гена TGF-BRI у больных РМЖ

Параметры Число больных Люминальный A Люминальный B p

TGF-ßRI экспрессия Негативная Позитивная TGF-ßRI (rs334354 ) GG GA AA G allele А allele

40 53

64 21 7

25 (45,5 %) 30 (54,5 %)

32 (59,3 %) 16 (29,6 %) 6 (11,1 %) 80 (74,1 %) 28 (25,9 %)

15 (39,5 %) 23 (60,5 %)

32 (84,2 %) 5 (13,2 %) 1 (2,6 %) 69 (90,8 %) 7 (9,2 %)

0,566

0,019*

0,007*

Примечание: * железы.

статистически значимые различия между показателями у больных люминальным А и люминальным В раком молочной

Рис. 1. Экспрессия гена TGF-BRI в образцах опухолевой ткани у больных люминальным А и люминальным В подтипами рака молочной железы. Моноплексная ПЦР, в качестве стандартного гена использован ген GAPDH. Каждая реакция проводилась трижды, приведены средние значения ± SE

Рис. 2. Экспрессия гена TGF-BRI в образцах опухолевой ткани у больных общей группы в зависимости от эффективности лечения тамоксифеном. Моноплексная ПЦР, в качестве стандартного гена использован ген GAPDH. Каждая реакция проводилась трижды, приведены средние значения ± SE

Таблица 3

Экспрессия белка ТСР-ВП и полиморфизм гена ТОР-БШ в общей группе больных в зависимости от

эффективности лечения тамоксифеном

Параметры

Число больных

ТАМ-Ч

ТМА-Р

Р

TGF-PRI экспрессия Негативная Позитивная TGF-pRI (rs334354 ) GG GA AA G allele А allele

35 38

48 18

6

21 (40,4 %) 31 (59,6 %)

33 (64,7 %) 13 (25,5 %) 5 (9,8 %) 79 (77,5 %) 23 (22,5 %)

14 (66,7 %) 7 (33,3 %)

15 (71,4 %) 5 (23,8 %) 1 (4,8 %)

35 (83,4 %) 7 (16,6 %)

0,043*

0,664

0,572

Примечание: * - статистически значимые различия между показателями в ТАМ-Ч и ТАМ-Р группах.

Таблица 4

Экспрессия белка ТСР-ВП и полиморфизм гена ТОР-БШ у больных люминальным А и В подтипами РМЖ в зависимости от эффективности лечения тамоксифеном

Параметры Люминальный A Люминальный В

р p

ТАМ-Ч ТМА-Р ТАМ-Ч ТМА-Р

TGF-PRI экспрессия

Негативная 12 (37,5 %) 9 (60,0 %)

Позитивная 20 (62,5 %) 6 (40,0 %) TGF-pRI (rs334354 )

GG 17 (54,8 %) 10 (66,7 %)

GA 10 (32,3 %) 4 (26,6 %)

AA 4 (12,9 %) 1 (6,7 %)

G allele 44 (70,9 %) 24 (80,0 %)

А allele 18 (29,1 %) 6 (20,0 %)

0,148

0,445

0,502

9 (45,0 %) 11 (55,0 %)

16 (80,0 %) 3 (15,0 %) 1 (5,0 %) 35 (87,5 %) 5 (12,5 %)

5 (83,3 %) 1 (16,7 %)

5 (83,3 %)

I (16,7 %) 0 (0,0 %)

II (91,7 %) 1 (8,3 %)

0,090

0,885

0,576

А и В подтипом опухоли. Анализ уровня экспрессии мРНК гена TGF-/3RI не выявил статистически значимых различий в общей группе больных РМЖ без учета подтипа опухоли (p=0,552; рис. 2). Дальнейшая стратификация пациенток в зависимости от молекулярного подтипа подтвердила найденные закономерности. Тамоксифен-чувствительные пациентки как с люминальным А, так и с люми-нальным В РМЖ, имели более высокий уровень генной экспрессии TGF-/3RI по сравнению с тамоксифен-резистентной группой соответственно люминального А и В РМЖ (p=0,637 и p=0,542 соответственно). Следует отметить, что в отличие от экспрессии гена, уровень белковой экспрессии TGF-PRI был связан с эффективностью гормональной терапии тамоксифеном в общей группе больных. TGF-pRI-позитивно окрашенные клетки выявлены в 59,6 % наблюдений у пациенток без прогрессирования по сравнению с 33,3 % больных тамоксифен-резистентной группы (p=0,043, табл. 3). При разделении группы больных по молекулярному подтипу выявлена тенденция к взаимосвязи высокого уровня экспрессии белка TGF-PRI с чувствительностью к терапии тамоксифеном только среди больных люминальным В раком молочной железы (p=0,090, табл. 4). При изучении распределения генотипов и аллелей гена TGF-/3RI как в общей группе пациенток, так и в зависимости от подтипа опухоли значимых ассоциаций с эффективностью проводимой терапии не обнаружено.

Обсуждение

Литературные данные об экспрессии гена TGF-fiRI и его белкового продукта при раке молочной железы немногочисленны, в основном они проводятся в общих группах больных без учета молекулярного подтипа опухоли, касаются или количественного распределения содержания мРНК, либо полуколичественной оценки белка в опухоли и не сопоставляются между собой. В единичных исследованиях определена прогностическая роль экспрессии мРНК гена TGF-fiRI, высокие уровни которого связаны с неблагоприятным исходом для больных раком молочной железы, особенно при малых опухолях [14]. Подобные закономерности были выявлены при изучении белковой экспрессии TGF-pRI: низкие показатели безметастатической выживаемости больных РМЖ связаны с высоким уровнем экспрессии белка TGF-pRI [15]. Существует ряд работ, посвященных изучению полиморфизма гена TGF-fiR1 (rs334354), однако представлены результаты исследования только его рисковой значимости, которые получены для общей выборки больных РМЖ без сопоставления с молекулярными подтипами. Так, в работе Song et al. не выявлено ассоциаций между мутантным аллелем Int7G24A и риском развития РМЖ [16]. Более ранние опубликованные данные указывают на взаимосвязь носительства данного полиморф-

ного варианта с инвазивным и метастатическим РМЖ [13].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что прогностически благоприятный люминальный А подтип РМЖ характеризуется более высоким уровнем экспрессии мРНК TGF-вRI и высокой частотой встречаемости мутантных генотипов и аллелей гена TGF-PM (ге334354) по сравнению с люминальным В РМЖ. Можно полагать, что подобные нуклеотидные замены в интроне приводят к возникновению функционально активного варианта гена TGF-PRI. Кроме того, известно, что антипро-лиферативные эффекты TGF-P1 на ранних стадиях РМЖ могут поддерживаться за счет высокой активности не только лиганда, но и его рецепторов, что способствует, в конечном итоге, более благоприятному клиническому течению заболевания.

Наиболее значимым полученным результатом является прогностическая ценность уровня белковой экспрессии TGF-pRI в опухолевой ткани у больных люминальным подтипом РМЖ. Проведенное исследование указывает на то, что низкий уровень экспрессии белка TGF-PRI является одним из факторов, связанных с неэффективностью лечения тамоксифеном, в большей степени, по-видимому, для пациенток с люминальным В подтипом РМЖ. Можно предположить, что низкая функциональная активность TGF-pRI может обусловливать неполноценную функциональную реализацию TGF-P1/Smad сигнальной трансдукции, приводящую к активации пролиферативных процессов в опухоли, в том числе и посредством запуска альтернативных сигнальных каскадов. Вероятно, ключевую роль при этом имеет функциональный статус эстрогеновых рецепторов (активация ERa, наличие мутаций и точечных замен), которые могут быть вовлечены в супрессию TGF-P1/Smad пути. Следует подчеркнуть, что пока не изучен вклад TGF-pRI в реализацию механизмов опухолевой прогрессии у больных, получавших терапию тамоксифеном. Вероятно, экспрессия TGF-pRI в опухоли может рассматриваться в качестве маркера резистентности к терапии тамоксифеном, как и TGF-pRII, низкий уровень экспрессии которого является независимым предиктором ответа на тамоксифен у пременопаузальных больных [11]. Однако полученные данные требуют дополнительного подтверждения.

Заключение

Проведенное исследование указывает на то, что уровень белковой экспрессии TGF-pRI может рассматриваться в качестве потенциального молекулярно-генетического маркера эффективности эндокринной терапии тамоксифеном у больных люминальным раком молочной железы.

Работа выполнена при финансовой поддержке Президента РФ, грант №МД-9084.2016.7 (молекулярно-генетические исследования), и РФФИ, грант № 16-54-76015 ЭРА а (набор биологических образцов и клинические данные пациентов).

ЛИТЕРАТУРА

1. Стенина М.Б., Фролова М.А. Рак молочной железы: наиболее важные научные события и выводы последних лет. Практическая онкология. 2011; 12 (1): 6-11.

2. Семиглазов В.Ф., Палтуев Р.М., Семиглазов В.В., Дашян Г.А., Семиглазова Т.Ю., Криворотько П.В., Николаев К.С. Общие рекомендации по лечению раннего рака молочной железы St. Gallen-2015, адаптированные экспертами Российского общества онкомаммологов. Опухоли женской репродуктивной системы. 2015; 3: 43-60. doi: http://dx.doi.org/10.17650/1994-4098-2015-11-3-43-60.

3. Band A.M., Laiho M. Crosstalk of TGF-p and estrogen receptor signaling in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2011; 16 (2): 109-15. doi: 10.1007/s10911-011-9203-7.

4. Derynck R., Zhang Y.E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling. Nature. 2003 Oct 9; 425 (6958): 577-84.

5. Kleuser B, MalekD, GustR., PertzH.H., PotteckH., Kleuser B, Malek D, Gust R., Pertz H.H., Potteck H. 17-Beta-estradiol inhibits transforming growth factor-beta signaling and function in breast cancer cells via activation of extracellular signal-regulated kinase through the G protein-coupled receptor 30. Mol Pharmacol. 2008 Dec; 74: 1533-43. doi: 10.1124/mol.108.046854.

6. Ito I., Hanyu A., Wayama M., Goto N., Katsuno Y., Kawasaki S., Nakajima Y., KajiroM., Komatsu Y., FujimuraA., HirotaR., MurayamaA., Kimura K., Imamura T., Yanagisawa J. Estrogen inhibits transforming growth factor beta signaling by promoting Smad2/3 degradation. J Biol Chem. 2010 May 7; 285 (19): 14747-55. doi: 10.1074/jbc. M109.093039.

7. Matsuda T., Yamamoto T., Muraguchi A., Saatcioglu F. Cross-talk between transforming growth factor-beta and estrogen receptor signaling through Smad3. J Biol Chem. 2001 Nov16; 276: 42908-1.

8. Wu L., Wu Y., Gathings B., WanM., Li X., Grizzle W., Liu Z., Lu C., Mao Z., CaoX. Smad4 as a transcription corepressor for estrogen receptor alpha. J Biol Chem. 2003 Apr 25; 278 (17): 15192-200.

9. Gao N., Zhai Q., Li Y., HuangK., BianD., WangX., Liu C., Xu H., Zhang T. Clinical Implications of TpRII Expression in Breast Cancer.

PLoS One. 2015 Nov 9; 10 (11): e0141412. doi: 10.1371/journal. pone.0141412.

10. Paiva C.E., DrigoS.A., RosaF.E., MoraesNetoF.A., Caldeira J.R.F., Soares FA., Rogatto S.R. Absence of transforming growth factor-b type

11 receptor is associated with poorer prognosis in HER2-negative breast tumours. Annals of Oncology. 2010; 21: 734-40. doi:10.1093/annonc/ mdp518.

11. Busch S., SimsA.H., Stal O., FernoM., Landberg G. Loss ofTGFp receptor type 2 expression impairs estrogen response and confers tamoxifen resistance. Cancer Res. 2015 Apr 1; 75 (7): 1457-69. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-1583.

12. Gilboa L., Wells R.G., Lodish H.F., Henis Y.I. Oligomeric structure of type I and type II transforming growth factor p receptors: homodimers form in the ER and persist at the plasma membrane. J Cell Biol. 1998 Feb 23; 140 (4): 767-77.

13. Chen T., Jackson C.R., Link A., Markey M.P., Colligan B.M., Douglass L.E., Pemberton J.O., Deddens J.A., Graff J.R., Carter J.H. Int7G24A variant of transforming growth factor-beta receptor type I is associated with invasive breast cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jan 15;

12 (2): 392-7.

14. Chen C., ZhaoK.N., Masci P.P., Lakhani S.R., Antonsson A., Simpson P.T., VitettaL. TGFp isoforms and receptors mRNA expression in breast tumours: prognostic value and clinical implications. BMC Cancer. 2015 Dec 24; 15: 1010. doi: 10.1186/s12885-015-1993-3.

15. de Kruijf E.M., Dekker T.J., Hawinkels L.J., PutterH., Smit V.T., Kroep J.R., Kuppen P.J., van de Velde C.J., ten Dijke P., Tollenaar R.A., Mesker W.E. The prognostic role of TGF-p signaling pathway in breast cancer patients. Ann Oncol. 2013 Feb; 24 (2): 384-90. doi: 10.1093/ annonc/mds333.

16. SongB., Margolin S., Skoglund J., ZhouX., Rantala J., Picelli S., Werelius B., Lindblom A. TGFBR1(*)6A and Int7G24A variants of transforming growth factor beta receptor 1 in Swedish familial and sporadic breast cancer. Br J Cancer. 2007 Oct 22; 97 (8): 1175-9. doi: 10.1038/ sj.bjc.6603961www.bjcancer.com.

Поступила 21.10.16 Принята в печать 16.01.17

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Бабышкина Наталия Николаевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии и иммунологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 2738-9275. Вторушин Сергей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии, Сибирский государственный медицинский университет; старший научный сотрудник отделения патологической анатомии и цитологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 2442-4720.

Дронова Татьяна Анатольевна, аспирант Института биологии, Национальный исследовательский Томский государственный университет (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 3516-2517.

Крахмаль Надежда Валерьевна, ассистент кафедры патологической анатомии, Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 1543-6546.

Завьялова Марина Викторовна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой патологической анатомии, Сибирский государственный медицинский университет; старший научный сотрудник отделения патологической анатомии и цитологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 1229-0323.

Цыганов Матвей Михайлович, младший научный сотрудник лаборатории онковирусологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 1253-0240.

Паталяк Станислав Викторович, кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник отделения общей онкологии, Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 8497-1750.

Слонимская Елена Михайловна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделением общей онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук; профессор кафедры онкологии, Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 7763-6417. Чердынцева Надежда Викторовна, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярной онкологии и иммунологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук (г. Томск, Россия). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 5344-0990.

ROLE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR RECEPTOR B I TYPE (TGF-BRI) IN THE PROGRESSION OF THE LUMINAL

BREAST CANCER SUBTYPE

N.N. Babyshkina12, S.V. Vtorushin13, T.A. Dronova2, N.V. Krakhmal13, M.V. Zavyalova123, M.M. Tsyganov12, S.V. Patalyak1, E.M. Slonimskaya13, N.V. Cherdyntseva12

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center, Russian Academy of Sciences, Tomsk, Russia1

5, Kooperativny Street, 634009, Tomsk, Russia, e-mail: [email protected] National Research Tomsk State University, Tomsk, Russian Federation2 36, Lenina, Street, 634050, Tomsk2

Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation3 2, Moskovsky Tract Street, 634050, Tomsk3

Abstract

Introduction. The crosstalk between the estrogen and growth factor receptors signaling may play an important role in the resistance to endocrine therapy. The aim of the study was to examine the relationship between the protein and receptor gene expression of transforming growth factor p type I (TGF-pRI) and its polymorphism with progression of luminal breast cancer patients treated by adjuvant tamoxifen. Material and methods. The study included 105 patients with luminal breast cancer (T13N03M0), who had received adjuvant tamoxifen at a dose of 20 mg/day for at least 5 years. Patients who developed distant metastasis or recurrence after tamoxifen therapy were defined as tamoxifen resistance (TR) group, while distant metastasis-free patients were analyzed as tamoxifen sensitive (TS) group. TGF-pRI expression level was evaluated using immunohis-tochemistry. TGF-BRI gene expression and genotypes for rs334354 SNP were detected by a Real-time PCR. Results. We found high TGF-pRI gene expression in patients with luminal A subtype compared with luminal B breast cancer (p=0.050). The Int7G24AA and Int7G24A mutant carriers were more prevalent in luminal A breast cancer patients (p=0.019 and p=0.007, respectively). TGF-pRI protein expression level was significantly higher in the tamoxifen sensitive group compared to tamoxifen resistance breast cancer patients regardless of molecular subtypes (p=0.043). There was a trend for a tamoxifen sensitivity among luminal B breast cancer patients with a high TGF-pRI protein expression (p=0.090). Conclusion. TGF-pRI protein expression level can be a potential molecular marker of tamoxifen resistance in luminal breast cancer patients.

Key words: luminal breast cancer, endocrine therapy, tamoxifen, transforming growth factor B type I receptor (TGF-BRI), gene polymorphism.

REFERENCES

1. Stenina M.B., Frolova M.A. Breast cancer: the most important scientific events and the conclusions of the last years. Practical oncology. 2011; 12 (1): 6-11. [in Russian]

2. Semiglazov V.F., Paltuev R.M., Semiglazov V.V., Dashyan G.A., Semiglazova T.Y., KrivorotkoP.V., NikolaevK.S. General St. Gallen-2015 guidelines for the treatment of early breast cancer (adapted by the experts of the Russian Society of Breast Oncologists). Women Reproductive System Tumors. 2015; 11 (3): 43-60. doi:10.17650/1994-4098-2015-11-3-43-60. [in Russian]

3. Band A.M., Laiho M. Crosstalk of TGF-p and estrogen receptor signaling in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2011; 16 (2): 109-15. doi: 10.1007/s10911-011-9203-7.

4. Derynck R., Zhang Y.E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling. Nature. 2003 Oct 9; 425 (6958): 577-84.

5. Kleuser B, MalekD, GustR., PertzH.H., PotteckH., Kleuser B, Malek D, Gust R., Pertz H.H., Potteck H. 17-Beta-estradiol inhibits transforming growth factor-beta signaling and function in breast cancer cells via activation of extracellular signal-regulated kinase through the G protein-coupled receptor 30. Mol Pharmacol. 2008 Dec; 74: 1533-43. doi: 10.1124/mol.108.046854.

6. Ito I., Hanyu A., Wayama M., Goto N., Katsuno Y., Kawasaki S., Nakajima Y., KajiroM., Komatsu Y., FujimuraA., HirotaR., MurayamaA., Kimura K., Imamura T., Yanagisawa J. Estrogen inhibits transforming growth factor beta signaling by promoting Smad2/3 degradation. J Biol Chem. 2010 May 7; 285 (19): 14747-55. doi: 10.1074/jbc. M109.093039.

7. Matsuda T., Yamamoto T., Muraguchi A., Saatcioglu F. Cross-talk between transforming growth factor-beta and estrogen receptor signaling through Smad3. J Biol Chem. 2001 Nov16; 276: 42908-1.

8. WuL., Wu Y., GathingsB., WanM., LiX., Grizzle W., Liu Z., Lu C., Mao Z., CaoX. Smad4 as a transcription corepressor for estrogen receptor alpha. J Biol Chem. 2003 Apr 25; 278 (17): 15192-200.

9. GaoN., Zhai Q., Li Y., Huang K., BianD., WangX., Liu C., Xu H., Zhang T. Clinical Implications of TpRII Expression in Breast Cancer. PLoS One. 2015 Nov 9; 10 (11): e0141412. doi: 10.1371/journal. pone.0141412.

10. Paiva C.E., Drigo S.A., RosaF.E., Moraes Neto F.A., Caldeira J.R.F., Soares FA., Rogatto S.R. Absence of transforming growth factor-b type

11 receptor is associated with poorer prognosis in HER2-negative breast tumours. Annals of Oncology. 2010; 21: 734-40. doi:10.1093/annonc/ mdp518.

11. Busch S., Sims A.H., Stal O., Ferno M., Landberg G. Loss of TGFp receptor type 2 expression impairs estrogen response and confers tamoxifen resistance. Cancer Res. 2015 Apr 1; 75 (7): 1457-69. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-1583.

12. Gilboa L., Wells R.G., Lodish H.F., Henis Y.I. Oligomeric structure of type I and type II transforming growth factor p receptors: homodimers form in the ER and persist at the plasma membrane. J Cell Biol. 1998 Feb 23; 140 (4): 767-77.

13. Chen T., Jackson C.R., Link A., Markey M.P., Colligan B.M., Douglass L.E., Pemberton J.O., Deddens J.A., Graff J.R., Carter J.H. Int7G24A variant of transforming growth factor-beta receptor type I is associated with invasive breast cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jan 15;

12 (2): 392-7.

14. Chen C., ZhaoK.N., MasciP.P., Lakhani S.R., AntonssonA., Simpson P.T., VitettaL. TGFß isoforms and receptors mRNA expression in breast tumours: prognostic value and clinical implications. BMC Cancer. 2015 Dec 24; 15: 1010. doi: 10.1186/s12885-015-1993-3.

15. deKruijf EM, Dekker T.J., Hawinkels L.J., PutterH, Smit V.T., Kroep J.R., Kuppen P.J., van de Velde C.J., ten Dijke P., Tollenaar R.A., Mesker W.E. The prognostic role of TGF-ß signaling pathway in breast cancer patients. Ann Oncol. 2013 Feb; 24 (2): 384-90. doi: 10.1093/ annonc/mds333.

16. SongB., Margolin S., Skoglund J., ZhouX., Rantala J., Picelli S., Werelius B, Lindblom A. TGFBR1(*)6A and Int7G24A variants of transforming growth factor beta receptor 1 in Swedish familial and sporadic breast cancer. Br J Cancer. 2007 Oct 22; 97 (8): 1175-9. doi: 10.1038/ sj.bjc.6603961www.bjcancer.com.

Received 21.10.16 Accepted 16.01.17

ABOUT THE AUTHORS

Babyshkina Natalia N., MD, PhD, Senior Research Scientist, Laboratory of Molecular Oncology and Immunology, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). E-mail: nbabyshkina@mail. ru. SPIN-code: 2738-9275.

Vtorushin Sergey V., MD, Professor, Department of Anatomical Pathology, Siberian State Medical University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 2442-4720.

Dronova Tatiana A., postgraduate, National Research Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPINcode: 3516-2517.

Krakhmal Nadezhda V., MD, PhD, Assistant, Department of Anatomical Pathology, Siberian State Medical University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 1543-6546.

Zavyalova Marina V., MD, Professor, Senior Researcher, Department of Pathological Anatomy and Cytology, Tomsk Cancer Research Institute, Head of Pathological Anatomy Department, Siberian State Medical University (Tomsk, Russia). E-mail: zavyalovamv@mail. ru. SPIN code: 1229-0323.

Tsyganov Matvey M., Junior Research, Laboratory of Viral Oncology, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 1253-0240. Patalyak Stanislav V., MD, PhD, Researcher, General Oncology Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 8497-1750. Cherdyntseva Nadezhda V., Associate Member of Russian Academy of Sciences, PhD, Professor, Deputy Director for Basic Science, Head of Laboratory of Molecular Oncology and Immunology, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Medical Sciences (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 5344-0990. Slonimskaya Elena M., MD, Professor, Head of General Oncology Department, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Medical Sciences. E-mail: [email protected]. SPIN-code: 7763-6417.