CC BY
78
5. Bergijk EC. Differential expression of collagen IV isoforms in experimental glomerulosclerosis/ I.E. van Alderwegen, H.J. Baelde, E. de Heer, K. Funabiki, H. Miyai et al.// J Pathol.- 1998.-№184.-p.307-315
6. Chan RW-Y. Urinary mononuclear cell and disease activity of systemic lupus erythematosus/ FM.-M. Lai, EK.-M. Li, L.-S. Tam, K.-Y. Chung, K.-M. Chow, PK.-T. Li, C-C. Szeto// Lupus.-2006.-№15.-p. 262-267.
7. Daugas E. Antiphospholipid syndrome nephropathy in systemic lupus erythematosus/ D. Nochy, DL. Huong, P. Duhaut, et al.// JAm-SocNephrol.-2002.-№13.-p.42-52.
8. Levey A.S. A more accurate method to estimate glomerular .ltration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group/ J.P. Bosch, J.B. Lewis, T. Greene, et al.// Ann Intern Med.-1999.-№130.-p. 461-470
9. Petri M. Systemic lupus international collaborating clinics renal activity/response exercise/ N. Kasitanon, S.S. Lee et al.// Arthr. Rheum.-2008.- №58(6).-p. 1784-8.
УДК 616.98:579.842.14:579.252.55:615.281./33.015.8]-07:578.52 © Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, А.Р. Мавзютов, 2011
Р.Г. Назмутдинова1, Р.Т. Мурзабаева1, А.Р. Мавзютов1,2 ВЗАИМОСВЯЗЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПАТОГЕННОСТИ S. ENTERITIDIS С АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ КУЛЬТУР
1ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Уфа 2ООО Исследовательский центр «Лаборатория», г. Уфа
Обследовано 105 больных сальмонеллёзом. Выделенные культуры S. enteritidis исследованы методом ПЦР на наличие фрагментов генов, ассоциированных с «островами» патогенности E.coli: hlyA, hlyB (гемолизины), sfaG и sfaA (фимбриаль-ные антигены типа S).
Фрагменты генов «островов» патогенности E.coli обнаружены у 102 из 105 исследованных штаммов S. enteritidis (97,1%). Всего выявлено 190 генетических детерминант: hlyA-50 (49,0%), hlyB-54 (52,9%), sfaG-57 (55,9%) и sfaA- в 29 (28,4%). При этом у 40 (39,2%) штаммов выявлено по одному гену: hlyA - 7, hlyB - 13, sfaG - 18, sfaA - 2, у следующих 40 (39,2%) - комбинации из двух генетических детерминант, у 18 (17,6%) сальмонелл - сочетания из трёх. 4 штамма (3,9%) возбудителя одновременно несли фрагменты hlyA, hlyB, sfaA и sfaG. Установлена корреляционная связь между наличием у
S. enteritidis фрагментов генов «островов» патогенности, ассоциируемых с патогенностью E.coli и резистентностью к ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину, карбенициллину. Установлена зависимость тяжести болезни от фактора полирезистентности микроба.
Ключевые слова: «острова» патогенности, сальмонеллез, взрослые, антибиотикорезистентность, клинические проявления.
R.G. Nazmutdinova, R.T. Murzabayeva, A.R. Mavzyutov GENETIC MARKERS OF PATHOGENICITY SALMONELLA ENTERITIDIS AND ANTIBIOTIC RESISTANCE
We examined 105 patients. The isolated S. enteritidis cultures were examined by means of PCR for the presence of gene fragments associated with E.coli pathogenicity «islands»: hlyA, hlyB (hemolysins), sfaA (type S fimbrial antigenes).
The gene fragments of pathogenicity «islands» were detected in 102 out of 105 studied samples (97.1%) of S. enteritidis strains.
A total of 190 genetic determiners were identified: hlyA - in 50 samples (49.0%); hlyB - in 54 (52.9%); sfa - in 57 (55.9%); sfaA -in 29 (28.4%). Therewith, 40 salmonella strain samples (39.2%) were found to have only one genetic determiner, in hlyA- 7 ; hlyB-13 ; sfaG - 18 ; sfaA - 2 . The subsequent 40 samples (39.2%) were revealed to possess combinations of two bacterial determiners.
In 18 salmonella samples (17.6%), there were observed combinations of 3 genetic determiners. Four salmonella samples simulte-neously possessed fragments of hlyA, hlyB, sfaA and sfaG. A correlation between E.coli pathogenicity-associated gene fragments of pathogenicity «islands» in S. enteritidis samples and resistance to ampicillin, doxycycline, cefazolin, levomycetin, carbenicillin. A correlation between the severity of the disease and the polyresistance of the microbial agent was determined.
Key words: pathogenicity “islands”, salmonellosis, adults, antibiotic resistance, clinical manifestations.
В настоящее время сальмонеллёзы яв- ДНК бактериофагов, транспозонов или плаз-
ляются одной из важных проблем инфекци- мид [4,7], что и определяет темпы формиро-
онной патологии в большинстве стран мира, вания лекарственной устойчивости, неуправ-
что обусловливается способностью сальмо- ляемый характер заболеваемости и тяжёлое
нелл длительно сохраняться во внешней сре- течение болезни. Резистентность сальмонелл
де, полирезистентностью к антибактериаль- к большинству АБП контролируется преиму-
ным препаратам и значительной генетической щественно генами, расположенными на плаз-
пластичностью микроорганизмов [3]. Среди мидах [2, 6, 8].
генетических детерминант патогенности Целью настоящего исследования яви-
большое значение придаётся структурным и лось изучение характера взаимосвязей между
регуляторным генам, сгруппированным в мо- частотой обнаружения фрагментов генов
бильные кластеры («островки» и «острова» «островов» патогенности, ассоциируемых с
патогенности), способные к горизонтальному патогенностью E.coli у клинических штаммов
и вертикальному перемещениям и встраива- сальмонелл и антибиотикорезистентностью
нию в определённые сайты бактериальной культур, также клиническими особенностями
сальмонеллеза у взрослых.
Материал и методы
Нами обследовано 105 больных с сальмонеллезом. Для выделения возбудителя исследовали испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка. Выделение чистых культур осуществляли общепринятыми методами с использованием отечественных питательных сред. Антибиотикочувствительность клинических изолятов к антибиотикам и фагам оценивали дискодиффузионным методом. Выделенные культуры исследовали методом ПЦР на наличие генов, ассоциированных с «островами» патогенности Е.соП. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием приложений пакета версии 6,0.
Результаты и обсуждение
Среди обследованных больных были 63 (60%) женщины и 42 (40%) - мужчины, средний возраст которых составил 35,11 ± 2,28 и 34,9 ± 2,85 года соответственно (х2=2,44 (Р=0,295).
Клинически сальмонеллез протекал в гастроинтестинальной форме с преобладанием гастроэнтеритического варианта в 87 (82,8%), гастроэнтероколита - в 18 (17,2%) случаях. У 62 (59%) пациентов диагностирована среднетяжёлая, у 25 (23,8%) - лёгкая и у 18 (17,2%) - тяжёлая форма заболевания.
В результате проведенных исследований было выделено 105 клинических штам-
мов 8.еп1егШ^. Фрагменты ДНК, специфичные известным генам кластеров патогенности Е.соН, обнаружены у 102 (97,1%) исследованных культур сальмонелл. В общем пуле протестированных микроорганизмов образование искомых ампликонов при исследовании праймеров к ЫуЛ имело место в 50 (49,0%) случаях, ЫуБ - в 54 (52,9%), sfaG - в 57 (55,9%) и sfaЛ - в 29 (28,4%) случаях соответственно.
В дальнейшем была исследована чувствительность выделенных нами культур сальмонелл к 13 наиболее широко используемым антибактериальным препаратам (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефазолин, амика-цин, ципрофлоксацин, цефотаксим, цефтриак-сон, цефалексин, левомицетин, карбеницил-лин и интести - и сальмонеллёзный бактериофаги). Установлено, что 68 (66,7%) клинических штаммов бактерий были резистентными к антибактериальным препаратам (АБП), из них 35 (51,5%) - к 1-3 препаратам, 27 (39,7%) -к 4-5, 6 (8,8%) - к 6 и более одновременно. Наиболее часто устойчивость возбудителя имела место к 5 АБП: ампициллину (52%), доксициклину (40,2%), левомицетину (34,3%), цефазолину (30,4%) и карбенициллину (28,4%), наименьшая устойчивость - к ци-профлоксацину (2,9%), цефотаксиму (2,9%), цефтриаксону (3,9%), гентамицину (6,8%), амикацину (8,8%) и бактериофагам (1,0%).
Таблица 1
Выявляемость фрагментов генов «островов» патогенности у 8. еп1егШ&8 и полирезистентность к антибиотикам
ФГОП Ампициллин, % Доксицик-лин, % © ^ 3 * фн еи ст * Левомице-тин, % Карбени-циллин, % Кол-во АБП с устойч. микроба 50% и более
ЫуЛ+ЫуБ (п=8) 100 62,5 87,5 87,5 37,5 4
ЫуЛ+йГаО (п=11) 72,7 63,6 63,6 45,5 50 4
ЫуЛ+ЫуБ+ я£аО (п=8) 75 50 25 50 25 3
ЫуА+§£аЛ+ я£аО (п=6) 83 50 66,6 83 66,6 5
Таблица 2
Связь между наличием ФГОП у клинических штаммов сальмонелл
и резистентностью к пяти антибактериальным препаратам___________________________
ФГОП п Ампициллин, % Докси-циклин, % Цефазо-лин, % Левоми-цитин, % Карбени-циллин, % п2 , % Б Р г*
Н1уЛ 7 42,8 42,8 14,2 14,2 57,1 13 1,12 0,336 0,36
ЫуЛ+ЫуБ 8 100 62,5 87,5 87,5 37,5 27 3,18 0,024 0,52
ЫуЛ+яГаО 11 72,7 63,6 63,6 45,5 50 7 0,98 0,427 0,26
ЫуЛ+ЫуБ+яГаО 8 75 50 25 50 25 14 1,44 0,241 0,37
ЫуА+яГаЛ+яГаО 6 83 50 66,6 83 66,6 7 0,5 0,736 0,26
Примечание. п2 - сила влияния фактора; Б - критерий Фишера; * - уровень значимости (р<0,001).
Таблица 3
_______Связь количества фрагментов генов «островов» патогенности с резистентностью к антибиотикам____________
ФГОП (п) Отсутствие устойчивости к АБП Ампицилин Доксициклин Цефазолин Левомицетин Карбенициллин
1 ФГОП (п = 40) 18 14 14 6 8 11
2 ФГОП (п = 40) 9 25 18 17 16 12
3-4 ФГОП (п = 22) 7 14 9 8 11 6
Итого: 102 34 53 41 31 35 29
п2 , % 9 4 4 11 4 5
Б 4,84 3,51 2,26 5,4 2,13 2,39
Р 0,0099 0,03 0,109 0,006 0,124 0,099
г* 0,3 0,2 0,2 0,33 0,2 0,22
Примечание. п2 - сила влияния фактора; Б - критерий Фишера; р - уровень значимости, *- коэффициент корреляции.
У сальмонелл, у которых определилась наибольшая устойчивость к 5 АБП (ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомици-тину и карбенициллину), чаще выявлялись следующие сочетания генетической детерминанты ЫуЛ: ЫуЛ+ЫуБ, ЫyA+sfaG,
ЫyЛ+ЫyБ+sfaG, ЫyА+sfaЛ+sfaG. Выявляе-мость ФГОП и устойчивость сальмонелл к 5-и часто используемым АБП представлена в табл. 1.
Для выявления взаимосвязи между резистентностью микробов к 5-и, наиболее часто используемым АБП, и фрагментами генов «островов» патогенности был проведён статистический анализ (табл. 2).
В результате было установлено, что наличие генетических детерминант ЫуЛ+ЫуБ оказывает сильное и статистически значимое влияние на резистентность к вышеперечисленным АБП: п2 =27% (Б=3,18; р=0,0249), и между изучаемыми признаками выявлена прямая корреляционная связь средней силы -г*=0,52. Несколько меньше средней силы, но статистически незначимым оказалось влияние факторов: ЫуЛ - п2 =13% (Б=1,12; р=0,366) и ЫyЛ+ЫyБ+sfaG - п2 =14% (Б=1,44; р=0,241); г*=0,36 и г*=0,37 соответственно. Для двух последних сочетаний выявлена слабая корреляционная связь между анализируемыми признаками: г*=0,26.
Далее нами был изучен характер влияния количества генетических детерминант на резистентность к каждому отдельно взятому антибиотику с последующим статистическим анализом (табл. 3).
Установлены статистически значимая доля влияния количества генетических детерминант (ФГОП) на резистентность к цефазо-лину и прямая корреляционная связь средней силы между ними: п2 =11% (Б=5,4; р<0,0061; г*=0,33), к ампициллину п2 =4% (Б=3,51; р<0,0323; г*=0,2); в то время как на устойчивость к другим антибиотикам определились их слабое влияние и слабая корреляционная связь.
При анализе связи фактора резистентности к АБП у сальмонелл и степени тяжести заболевания установлено, что антибиотикорезистентные сальмонеллы чаще выделялись от больных со среднетяжелым и тяжелым течением болезни. Так, при легкой форме болезни количество микробов, чувствительных ко всем АБП, составило 9 (37,5%), при среднетяжелом и тяжелом течении сальмонеллёза -20 (33,3%) и 5 (27,8%) соответственно. Тогда как число резистентных бактерий возрастало по мере утяжеления заболевания от легкой до
тяжелой степени и равнялось 15 (62,5%), 40 (66,7%), 13 (72,2%) соответственно. Проведённый статистический анализ влияния фактора полирезистентности микроба на тяжесть течения сальмонеллёза выявил достоверные различия между группами сальмонелл с различной резистентностью к АБП и степенью тяжести заболевания (х2 = 7,145; df = 2; р=0,028). Так, в группе микроорганизмов, резистентных к 1-3 АБП, сила влияния данного признака на степень тяжести сальмонеллёза была слабой, но статистически значимой - п2 =6% (Б=3,37; р=0,0382), что подтверждает и коэффициент корреляции - г*=0,24. В группе полирезистентных микроорганизмов выявлено сильное, статистически значимое влияние между анализируемыми признаками: п2 =32% (Б=22,8; р=0,001) и фиксирована прямая корреляционная связь средней силы г*=0,57.
На основании полученных данных можно предположить, что полирезистентные к АБП сальмонеллы, а именно 8. еnteritidis, более вирулентные, чем чувствительные к АБП штаммы, и вызывают более тяжёлое течение заболевания, что согласуется с мнением других авторов, назвавших лекарственную резистентность сальмонелл маркёром их патогенности [3, 6, 7].
Определение «островов» патогенности может использоваться для тестирования клинических штаммов бактерий и проливать свет на генетические механизмы изменения их патогенности [1]. Начиная с середины 90-х годов до 2008 года среди S.enteritidis появились полирезистентные штаммы, которые составили треть всех изученных культур [6, 7]. Сальмонеллёз, вызванный данными возбудителями, характеризуется достаточно тяжёлым течением, частым поражением толстой кишки, вплоть до геморрагического колита [6]. В литературе мы не нашли данных о взаимосвязи резистентности к анализируемым АБП и выявленными генами «островов» патогенности у представителей семейства Enterobacteriaceae. Но имеются данные о положительной корреляционной связи между адгезивной активностью и резистентностью Morganella morganii к антибиотикам [5].
«Острова» патогенности выполняют различные функции: патогенность, адаптация, метаболизм, лекарственная устойчивость, секреторная функция [1, 2]. В этой связи можно предположить, что выявленные нами ФГОП имеют отношение к формированию устойчивости к ряду антибиотиков, в частности генетические детерминанты гемолизинов (Ыу), к формированию устойчивости к ампи-
ВС
циллину, цефазолину, доксициклину, левоми-цетину, карбенициллину.
Известно о генетической связи факторов резистентности и патогенности [8]. Гены антибиотикорезистентности расположены на плазмидах и транспозонах [4, 5]. Прослежено, что эпидемические штаммы, как правило, обладают множественной антибиотикорези-стентностью плазмидной природы [7, 9]. Такие плазмиды включают в свой репликон дополнительно к Я - детерминантам гены, ответственные за синтез токсинов [7], адгезинов [7], антилизоцимной активности, сериновой протеазы, инактивирующей секреторный иммуноглобулин А [2]. Наследование сложных Я - плазмид реципиентными бактериями сообщает им, наряду с множественной лекарственной устойчивостью, и свойства наследуемых факторов патогенности [1, 2]. Вартересян И. И. и соавт. предлагают изучать плазмидный профиль (Я - плазмиды) клинических штаммов сальмонелл, распространённых в конкретном регионе, для мониторинга антибио-
тикорезистентности с целью успешного маневрирования средствами терапии [5].
Выводы
1. Частота обнаружения генетических детерминант гемолизинов (hly A и hly B) и фимбриальных антигенов типа S (sfa G и sfa A) у клинических штаммов сальмонелл коррелирует с тяжестью течения болезни.
2. Клинические штаммы Salmonella spp. полирезистентны к антибактериальным препаратам (б2,5%). Наибольшая устойчивость показана к ампициллину (5І,б%), левомице-тину (3G%) и цефазолину (23%), наименьшая -к цефотаксиму (i,i%), ципрофлоксацину (2,i%) и специфическим бактериофагам
(U%).
3. Увеличение количества генетических детерминант, обнаруживаемых у отдельного штамма, сопровождается снижением чувствительности сальмонелл к антибактериальным препаратам. Mножественная устойчивость к антибактериальным препаратам согласуется с тяжестью заболевания.
Сведения об авторах статьи:
Назмутдинова Рита Галиевна - заочный аспирант кафедры инфекционных болезней с курсами дерматовенерологии и косметологии ИПО БГМУ, зав. инфекционным отделением, МБУ «Городская больница №1 ГО г. Октябрьский», раб.т. 8(34767) 5-11-33адрес: г. Октябрьский, ул. Ст Кувыкина, д.30. e-mail: nazmutdinovarg@mail.ru
Мурзабаева Расима Тимерьяровна - д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО БГМУ, раб. тел. 8 (347) 250-18-83, доп.2-94; адрес: г.Уфа, ул. Запотоцкого, д.37, к. 4. e-mail: rmurzabaeva@yandex.ru Мавзютов Айрат Радикович - д.м.н., профессор, декан МПФ и МБ, зав. кафедрой прикладной и фундаментальной микробиологии ГБОУ ВПО «БГМУ». ООО «Исследовательский центр «Лаборатория»; раб. тел. 2736187;
Раб. адрес: г. Уфа, ул. Ленина, д.3; e-mail: ufalab@mail.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко, В.М. «Острова» патогенности бактерий // Журн. микробиол. - 2001. - №4. - С.67 - 74.
2. Бондаренко, В.М. Роль бактериальной протеазы, деградирующей секреторный иммуноглобулин А в персистенции клебсиелл /
В.М. Бондаренко, О.В. Агапова, Н.А. Виноградов // Журн. микробиол.- 2000.- №4. - С.12-16.
3. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М., 1999. - 370с.
4. Вартересян, И. И. Конъюгативные плазмиды антибиотикорезистентных штаммов сальмонелл/И. И. Вартересян, З.У. Геворкян, Н.Н Саркисян. [и др.] . // Журн. микробиол. - 2002. - №1. - С. 78-79.
5. Гашимова, Д.Т. Характеристика адгезивных свойств бактерий рода Morganella morganii /Д.Т. Гашимова, З.Г. Габидуллин, А.Р. Мавзютов, А.К. Булгаков. //Актуальные вопросы инфекционной патологии: сборник научных трудов - Уфа, 1998. - С. 100-101.
6. Милютина, Л.Н. Эволюция лекарственной резистентности Salmonella enteritidis, выделенных от детей/Л.Н. Милютина, О.В.Гурьева, С.Ш. Рожнова, М.А. Головинова // Журн. эпидем. и инфекц. болезни. - 2008. - №2. - С.44-47.
7. Рожнова, С.Ш. Л.А. Кафтырева. Значение плазмид в эволюции возбудителей и эпидемического процесса внутрибольничных сальмонеллёзов // Журн. эпидем. и инфекц. болезни. - 2000- № 5. - С. 25-27.
8. Martinez J.L., Baquero F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity, epidemicity and antibiotic
resistance // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol.15. - №4. - Р.647-679.
9. Silva J., Gatica R., Aguilar C. et al. Outbreak of infection with extended-spectrum lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in a Mexican hospital // J. Clinic. Microbiol. - 2001. - Vol. 39. - №9. - P.3193-3196.
УДК 616.9-053.1:612.017.4 © Л.А. Русакова, У.Р. Хамадьянов, 2011
Л.А. Русакова, У.Р. Хамадьянов ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЦИТОКИНОВ ПРИ ВНУТРИУТРОБНОМ ИНФИЦИРОВАНИИ ПЛОДА
ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Уфа
На основе количественного измерения 11-1 р, 10 и ФНО в трех биологических жидкостях, таких как сыворотки венозной и пуповинной крови, а также околоплодные воды, у женщин высокого инфекционного риска с реализацией инфекции у новорожденных без ее реализации, а также условно здоровых женщин установлена высокая диагностическая ценность про- и противовоспалительных цитокинов. Наиболее статистически значимым признаком внутриутробного инфицирования (ВУИ) у плода является концентрация 11-1 р.
Ключевые слова: внутриутробное инфицирование плода, диагностика, цитокины.
