CC BY
91
микробиология
© коллектив авторов, 2012
УдК 616.98:579.842.14].015.8.076:575.083
А. Р. Мавзютов1, 2, Р. Т. Мурзабаева1, Р. Г. Назмутдинова1, И. А. Мирсаяпова1, 2
генетические маркеры патогенности S. ENTERITIDIS, антибиотикорезистентность культур и клинические особенности заболевания
1ГОУ БПО Башкирский государственный медицинский университет Росздрава, 2ООО Исследовательский центр "Лаборатория1, Уфа
Цель работы - оценка лабораторно-диагностического значения взаимосвязей между частотой обнаружения фрагментов генов островов патогенности, ассоциируемых с патогенностью E. coli, у клинических штаммов S. enteritidis, антибиотико-резистентностью культур и клиническими особенностями сальмонеллеза у взрослых. Обследовано 105 больных сальмонел-лезом и проведено генетическое тестирование выделенных от них штаммов S. enteritidis. Фрагменты генов островов патогенности (ФГОП) E. coli обнаружены у 102 (97,1%) из 105 исследованных штаммов S. enteritidis. Фрагменты, специфичные hlyA E. coli, в различных качественных и количественных сочетаниях выявлены у 50 (49%) клинических штаммов S. enteritidis, hlyB - у 54 (52,9%), sfaG - у 57 (55,9%) и sfaA - у 29 (28,4%). Установлена корреляция между наличием у S. enteritidis ФГОП, ассоциируемых с патогенностью E. coli, и резистентностью к ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину, кар-бенициллину. Установлена зависимость тяжести болезни от полирезистентности S. enteritidis к антибиотикам.
Ключевые слова: лабораторная диагностика, сальмонеллез, генетические маркеры, антибиотикорезистент-ность, клинические проявления
A.R. Mavzyutov, R.T. Murzabayeva, R.G. Nazmutdinova, I.A. Mirsayapova THE GENETIC MARKERS OF PATHOGENICITY OF S. ENTERITIDIS, ANTIBIOTIC RESISTANCE OF CULTURES AND CLINICAL CHARACTERISTICS OF DISEASE The article presents the results of evaluation of laboratory diagnostic value of relationships between the rate of detection of fragments of genes of pathogenicity islands associated with E. coli pathogenicity in clinical strains of S.enteritidis, antibiotic resistance of cultures and clinical characteristics of salmonellosis in adults. The sample included 105 patients with salmonellosis to apply the genetic test to isolated strains of S. enteritidis. The E.coli fragments of genes ofpathogenicity islands are detected in 102 out of 105 analyzed strains of S.enteritidis (97.1%). The fragments specific to hlyA E.coli are detected in various qualitative and quantitative combinations in 50 (49.0%) clinical strains of S. enteritidis, hlyB - in 54 (52.9%), sfaG - in 57 (55.9%) and sfaA - in 29 (28.4%). The correlation is established between presence of fragments of genes of pathogenicity islands in S.enteritidis associated with E. coli pathogenicity and resistance to ampicillin, doxycycline, cephasoline, chloramphenicol, carbenicillin. The dependence of disease severity from S.enteridis poly-resistance to antibiotics is established.
Key words: laboratory diagnostics, salmonellosis, genetic markers, antibiotic resistance, clinical manifestation
В настоящее время сальмонеллезы являются одной из важных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, что обусловливается способностью сальмонелл длительно сохраняться во внешней среде, полирезистентностью к антибактериальным препаратам (АБП) и значительной генетической пластичностью микроорганизмов [2, 3, 8]. Среди генетических детерминант пато-генности большое значение придается структурным и регулятор-ным генам, сгруппированным в мобильные кластеры (островки и острова патогенности), способные к горизонтальному и вертикальному перемещению и встраиванию в определенные сайты бактериальной ДНК бактериофагов, транспозонов или плазмид [9], что и определяет темпы формирования лекарственной устойчивости, неуправляемый характер заболеваемости и тяжелое течение болезни. Резистентность сальмонелл к большинству АБП контролируется преимущественно генами, расположенными на плазмидах [4, 8].
Целью настоящего исследования явилась оценка лабора-торно-диагностического значения взаимосвязей между частотой обнаружения фрагментов генов островов патогенности, ассоциируемых с патогенностью Е. coli, у клинических штаммов
Для корреспонденции:
Мавзютов Айрат Радикович, д-р мед. наук, проф., декан мед.-проф.
фак., зав. каф. фунд. и прикладной микробиологии
Адрес: 450077, Уфа, ул. Чернышевского, 104/286
Телефон: (917) 343-19-30
Е-таП:^а1аЬ@таП.га
S. enteritidis, антибиотикорезистентностью культур и клиническими особенностями сальмонеллеза у взрослых.
Материалы и методы. Обследовано 105 больных сальмо-неллезом. Исследуемым материалом служили испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка. Выделение чистых культур осуществляли общепринятыми методами с использованием отечественных питательных сред. Посевы инкубировали при 37oC в течение суток, при необходимости - дополнительно при комнатной температуре. Подозрительные колонии дифференцировали макроскопически по морфологии, при необходимости - после окраски препаратов по Граму. Биохимическую идентификацию осуществляли при использовании сред Гисса, СИБ, ПБДЭ (Н. Новгород, Россия) и Enterotest (Chemapol, Чехия) и пакета программ API (BioMerioux, Франция).
Атипичные по биохимической активности культуры идентифицировали в реакциях фаголизиса и агглютинации с соответствующими бактериофагами и диагностическими моно- и поливалентными сыворотками.
Антибиотикочувствительность клинических изолятов к ампициллину, карбенициллину, гентамицину, амикацину, цефазо-лину, цефотаксиму, цефалексину, цефтриаксону, доксициклину, левомицетину, ципрофлоксацину и фагам - сальмонеллезному и интестифагу оценивали дискодиффузионным методом.
Бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры, при этом 1 мл суспензии клеток осаждали при 12 000 об/мин на центрифуге (Cyclotemp-202, Россия). Осадок
МИКРОБИОЛОГИЯ
ресуспендировали и разводили в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl (рН 8,4), 2,5 мМ MgCl2 и 0,01% желатин до конечной концентрации 108 КОЕ/мл. Лизировали лизоцимом (Serva, США) в концентрации 1 мг/мл в течение 15 мин при 22-25oC с последующим добавлением протеиназы К (Serva, США) до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при 60oC. Фермент инактивировали кипячением 15 мин. Кроме того, использовали стандартные наборы для выделения ДНК ("Интерлабсервис", Россия). Перед использованием образцы хранили при 4oC.
Использовали праймеры к ряду фрагментов генов островов патогенности у Escherichia coli (ФгОП) и определяющих способность этих бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfaG и sfaA), гемолизины (hlyA и hlyB) [6]:
hlyA (474 п. н.) (1. 5'-cacgcgtgccgacaagtt-3'; 2. 5'-gccacatcccg-gaaatcaat-3');
hlyB (542 п. н.) (1. 5'-cgacgtcgccttgatgata-3'; 2. 5'-tccccctgct-taatactgagat-3');
sfaG (450 п. н.) (5'-tgccgggaacacagaccatag-3', 5'-caatcttgatac-cgccagcattc-3');
sfaA (641 п. н.) (1. 5'-eggtgtgegtagttcaat-3'; 5'-caccegcatgga-taaaaa-3').
Амплификацию проводили при использовании 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 50 мМ Kcl, 10 мМ трис-HCl ( рН 8,4), 2,5 мМ MgCl2, 0,01% тритонХ-100, 0,2 мМ каждого из ¿АТФ, аГТФ, dТТФ, dЦТФ, 2,0 мкМ/л праймера, 1,2 Е Taq ДНК-полимеразы и 5 мкл тотальной бактериальной ДНК на термоциклере Терцик МС-2.
Детекцию продуктов амплификации (20 мкл) осуществляли электрофоретически в 1,5% горизонтальном агарозном геле в постоянном электрическом поле 10 В/см. ДНК окрашивали бромидом. Документирование результатов проводили с использованием цифровой видеокамеры Mintron и программы Biotest-D ("Биоком", Россия). В качестве маркеров-метчиков использована 123 пн-лестница (Promega, США).
Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием приложений Microsoft Excell пакета Office XP и Statistica (Stat Soft) версии 6.0.
Результаты и обсуждение. Обследовано 63 (60%) женщины и 42 (40%) мужчины, средний возраст которых составил соответственно 35,11 ± 2,28 и 34,9 ± 2,85 года (х2 = 2,44; p = 0,295).
Клинически сальмонеллез протекал в гастроинтестинальной форме с преобладанием гастроэнтеритического варианта у 87 (82,8%) больных, в форме гастроэнтероколита - у 18 (17,2%). У 62 (59%) пациентов диагностирована среднетяжелая форма заболевания у 25 (23,8%) - легкая и у 18 (17,2%) - тяжелая.
Выделено 105 клинических штаммов S. enteritidis. Фрагменты ДНК, свойственные известным генам кластеров патогенно-сти E. coli, обнаружены у 102 (97,1%) исследованных штаммов сальмонелл. В общем пуле протестированных микроорганизмов образование искомых ампликонов при использовании прайме-ров к hlyA имело место в 50 (49%), hlyB - в 54 (52,9%), sfaG - в 57 (55,9%) и sfaA - в 29 (28,4%) случаях соответственно.
Исследована чувствительность выделенных штаммов S. en-teritidis к 13 наиболее широко используемым АБП (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефазолин, амикацин, ципрофлокса-цин, цефотаксим, цефтриаксон, цефалексин, левомицетин, карбе-нициллин и интести- и сальмонеллезный бактериофаги). Установлено, что 68 (66,7%) клинических штаммов бактерий резистентны к АБП, из них 35 (51,5%) к 1-3 препаратам, 27 (39,7%) - к 4-5 препаратам, 6 (8,8%) к 6 и более. Наиболее часто устойчивость возбудителя отмечалась к следующим пяти АБП: ампициллину
(52%), доксициклину (40,2%), левомицетину (34,3%), цефазолину (30,4%) и карбенициллину (28,4%), наименее часто - к ципроф-локсацину (2,9%), цефотаксиму (2,9%), цефтриаксону (3,9%), ген-тамицину (6,8%), амикацину (8,8%) и бактериофагам (1,0%).
У S. ейегШ^ с одновременной устойчивостью к пяти АБП (ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину и карбенициллину) чаще выявлялись следующие сочетания ФГОП ЫуА: ЫуА + ЫуВ, ЫуА + sfaG, ЫуА +ЫуВ + sfaG, ЫуА + sfaA + sfaG.
Для выявления взаимосвязи между резистентностью микробов к пяти наиболее часто используемым АБП и ФГОП проведен статистический анализ (табл. 1). Установлено, что наличие генетических детерминант ЫуА + ЫуВ оказывает сильное и статистически значимое влияние на резистентность к вышеперечисленным АБП: п2 = 27% (Р = 3,18; p = 0,0249) и между изучаемыми признаками выявлена прямая корреляционная связь средней силы - г* = 0,52. Несколько меньше средней силы, но статистически незначимым оказалось влияние факторов: ЫуА - п2 = 13% (Р = 1,12; p = 0,366) и ЫуА + ЫуВ + sfaG - п2 = 14% (Б = 1,44; р = 0,241); г* = 0,36 г* = 0,37 соответственно. Для двух последних сочетаний выявлена слабая корреляционная связь между анализируемыми признаками: г* = 0,26.
Изучен характер влияния количества генетических детерминант на резистентность к каждому отдельно взятому антибиотику с последующим статистическим анализом. Показана статистически значимая доля влияния количества генетических детерминант (ФГОП) на резистентность к цефазолину и прямая корреляционная связь средней силы между ними: п2 = 11% (Р = 5,4; р < 0,0061; г* = 0,33), к ампициллину п2 = 4% (Р = 3,51; р < 0,0323; г* = 0,2), в то время как на устойчивость к другим антибиотикам определен слабый характер их влияния и слабая корреляционная связь (табл. 2).
При анализе связи резистентности к АБП S. еПегШ^ и степени тяжести заболевания установлено, что антибиотикорезистент-ные бактерии чаще выделялись от больных со среднетяжелым и тяжелым течением болезни. Так, при легкой форме заболевания количество микробов, чувствительных ко всем АБП, составило 9 (37,5%), при среднетяжелом и тяжелом течении сальмонелле-за - 20 (33,3%) и 5 (27,8%) соответственно, тогда как число резистентных штаммов возрастало по мере утяжеления болезни от легкой до тяжелой степени и равнялось 15 (62,5%), 40 (66,7%), 13 (72,2%) соответственно (рис. 1).
Проведенный статистический анализ влияния фактора полирезистентности S. ейегШ^ на тяжесть течения сальмонеллеза выявил достоверные различия между группами сальмонелл с различной резистентностью к АБП и степенью тяжести заболевания (X2 = 7,145; df = 2; р = 0,028). Так, в группе микроорганизмов, резистентных к одному-трем АБП, сила влияния данного признака на степень тяжести сальмонеллеза была слабой, но статистически значимой - п2 = 6% (Р = 3,37; р = 0,0382), что подтверждает и коэффициент корреляции - г* = 0,24. В группе полирезистентных микроорганизмов выявлена сильная, статистически значимая связь между анализируемыми признаками: п2 = 32% (Р = 22,8; р = 0,00001) и фиксирована прямая корреляционная связь средней силы г* = 0,57 (рис. 2).
На основании полученных данных можно предположить, что полирезистентные к АБП S. еПегШ^ более вирулентные, чем чувствительные к АБП штаммы, и вызывают более тяжелое течение заболевания, что согласуется с мнением других авторов, рассматривающих резистентность сальмонелл в качестве маркера их патогенности [7, 8].
Выявление ФГОП может использоваться для тестирования клинических штаммов бактерий и проливает свет на новые гене-
Таблица 1
Частота обнаружения фгоП (в %) у клинических штаммов S. enteritidis и их резистентность к антибактериальным препаратам
ФГОП n Ампициллин Доксициклин Цефазолин Левомице-тин Карбеницил-лин п2, % F Р г*
hlyA 7 42,8 42,8 14,2 14,2 57,1 13 1,12 0,336 0,36
hlyA + hlyB 8 100 62,5 87,5 87,5 37,5 27 3,18 0,024 0,52
hlyA + sfaG 11 72,7 63,6 63,6 45,5 50 7 0,98 0,427 0,26
hlyA + hlyB + sfaG 8 75 50 25 50 25 14 1,44 0,241 0,37
hlyA + sfaA + sfaG 6 83 50 66,6 83 66,6 7 0,5 0,736 0,26
Таблица 2
характер связей между количеством фгоП у S. enteritidis и резистентностью штаммов к антибиотикам
Количество генетических детерминант Отсутствие устойчивости к АБП Ампициллин Доксициклин Цефазолин Левомицетин Карбенициллин
1 ФГОП (n = 40) 18 14 14 6 8 11
2 ФГОП (n = 40) 9 25 18 17 16 12
3-4 ФГОП (n = 22) 7 14 9 8 11 6
Итого ... 102 34 53 41 31 35 29
n2, % 9 4 4 11 4 5
F 4,84 3,51 2,26 5,4 2,13 2,39
p 0,0099 0,03 0,109 0,006 0,124 0,099
r* 0,3 0,2 0,2 0,33 0,2 0,22
%
Легкая Среднетяжелая Тяжелая
^ Чувствительные ко всем АБП И Устойчивые к АБП
Рис. 1. Антибиотикорезистентность S. enteritidis и степень тяжести заболевания (ось абсцисс).
тические механизмы изменения их патогенности [2], темпы которого достаточно высоки. Так, начиная с середины 90-х годов до 2008 г. соотношение полирезистентных штаммов Б. enteritidis превысило треть всех бактериологических находок при саль-монеллезе. Заболевание при этом характеризуется достаточно тяжелым течением, частым поражением толстой кишки, вплоть до геморрагического колита [7]. Прямые указания на факт взаимосвязи резистентности к АБП и выявленными ФГОП у представителей семейства ЕПетоЬайепасеае в литературе ранее отсутствовали, но сообщалось о положительной корреляционной связи между адгезивной активностью и резистентностью к антибиотикам Мо^апеИа шо^апи [5].
Острова патогенности определяют различные признаки: патогенность, адаптацию, метаболизм, лекарственную устойчивость, секреторную функцию [1, 2]. В связи с этим можно предположить, что выявленные ФГОП могут иметь отношение к формированию устойчивости к антибиотикам, в частности генетические детерминанты гемолизинов (Ыу) - к формированию устойчивости к ампициллину, цефазолину, доксициклину, лево-мицетину, карбенициллину.
Известно о генетической связи факторов резистентности и патогенности [11]. Так, гены антибиотикорезистентности могут локализоваться на плазмидах и транспозонах и соответственно представляют лабораторный интерес для эпидемиологического типирования клинических штаммов [4, 8, 12]. Указанные маркеры наряду с резистентностью позволяют осуществлять эпидемиологически значимую генетическую детекцию детерминант, ответственных за синтез токсинов, адгезинов [8], антилизоцим-ной активности, сериновой протеазы, инактивирующей секреторный иммуноглобулин А [1].
Выводы. 1. Частота обнаружения генетических детерминант гемолизинов (Ыу А и Ыу В) и фимбриальных антигенов типа Б ^аО и sfaА) у клинических штаммов Б. enteritidis коррелирует с тяжестью течения болезни.
2. Клинические штаммы Б. enteritidis отличаются полирезистентностью к антибактериальным препаратам (62,5%). Наибольшая устойчивость показана к ампициллину (51,6%),
Е^Э Легкая (п=24) Ш Среднетяжелая (л=60) И Тяжелая (л=18)
Рис. 2. Полирезистентность Б. enteritidis и степень тяжести заболевания (ось абсцисс).
I - полирезистентность к 4 АБП и более (п = 33); II - резистентность к 1-3 АБП (п = 35).
левомицетину (30%) и цефазолину (23%), наименьшая - к це-фотаксиму (1,1%), ципрофлоксацину (2,1%) и специфическим бактериофагам (1,1%).
3. Увеличение количества различных генетических детерминант, обнаруживаемых у отдельного штамма, сопровождается снижением чувствительности Б. enteritidis к антибактериальным препаратам. Множественная устойчивость к антибактериальным препаратам коррелирует с тяжестью течения заболевания.
Работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.1. Государственный контракт № П385 от 30.07.2009.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко В. М., Агапова О. В., Виноградов Н. А. // Журн. микро-биол. - 2000. - № 4. - С. 12-16.
2. Бондаренко В. М. // Журн. микробиол. - 2001. - № 4. - С. 67-74.
3. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий. - М., 1999.
4. Вартересян И. И., Геворкян З. У., Саркисян Н. Н. // Журн. микробиол. - 2002. - № 1. - С. 78-79.
5. Гашимова Д. Т., Габидуллин З. Г., Мавзютов А. Р., Булгаков А. К. // Сборник научных трудов "Актуальные вопросы инфекционной патологии". - Уфа, 1998. - С. 100-101.
6. Мавзютов А. Р., Фиалкина С. В., Бондаренко В. М. // Журн. микробиол. - 2002. - № 6.- С. 5-9.
7. Милютина Л. Н., Гурьева О. В., Рожнова С. Ш., Головинова М. А. // Эпид. и инфекц. бол. - 2008. - № 2. - С. 44-47.
8. Рожнова С. Ш., Кафтырева Л. А. // Эпид. и инфекц. бол. - 2000. - № 5. - С. 25-27.
9. Hacker J., Kaper J. // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - Vol. 54. - P. 641-679.
10. Kaper J. B., Hacker J. Pathogenicity island and other mobile virulence elements. - Washington, 1999.
11. Martinez J. L., Baquero F. // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15, N 4. - P. 647-679.
12. Silva J., Gatica R., Aguilar C. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39, N 9. - P. 3193-3196.
Поступила 22.03.11
