CC BY
38
бешенством людей регистрировалось в Южном, Центральном, Приволжском федеральных округах (44, 27, 12 случаев соответственно), на них приходится и наибольшая доля заболеваемости соответственно 48,0, 29,3, 13,0 % от общей заболеваемости в России. В то же время в Центральном и Южном округах прослеживалась тенденция к снижению заболеваемости бешенством людей за анализируемый период. В этих же трех округах наблюдалась наиболее неблагополучная эпизоотологическая обстановка по бешенству с тенденцией к увеличению больных животных за анализируемый период. В СевероЗападном, Сибирском федеральных округах и России в целом также наблюдалась аналогичная тенденция по бешенству животных. Низкая заболеваемость характерна для Уральского, Дальневосточного, Сибирского округов (1-4 случая за анализируемый период), на их долю приходится 9,0 % от заболеваемости в РФ. Заболевания бешенством отсутствовали у населения Северо-Западного округа. Эпи-зоотологическая обстановка по бешенству за пятилетний период в Центральном, Приволжском, Южном, Уральском и Сибирском федеральных округах напряженная, значительное ухудшение ее произошло в 2005 г. и только выполнение всего комплекса мероприятий, перечисленных в «Постановлении», возможно не приведет к осложнению эпидемиологической обстановки по гидрофобии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Непоклонов А.Е., Яременко Н.А. // Ветеринари. и мед. асп. зооантропонозов: Тр. Междунар. науч.-практ. конф., поев. 45-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2003. - Ч. 1. - С. 2122,- 2. Онищенко Г.Г. Постановление Главного государственного санитарного врача № 15 от 18.04.2005 «Об усилении мероприятий по предупреждению распространения бешенства в Российской Федерации». - 3. Плохинский Н.А. Биометрия. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1970. - С. 245-247. - 4. Шаха-нина И.Л., Осипова JI.A. // Эпид. и инф. бол. - 2005. -№ 4. - С. 19.
V.P.Toporkov, L.N.Velichko, V.V.Kutyrev
Epidemiologic and Epizootiologic Situation with Rabies in the Federal Districts of the Russian Federation
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
A retrospective epidemiologic analysis of rabies morbidity for the period from 2001 to 2006 revealed the greatest numbers of rabies patients in the Southern, Central and Volga Districts (44, 27, and 12 cases, respectively) sharing the highest portions of the total sickness rate for Russia with their respective contributions of 4S.0, 29.3, and 13.0 percent. At the same time, a tendency to deceleration of rabies morbidity was observed in the Central and Southern Districts. On the other hand, the three Districts mentioned above showed the most unfavorable rabies epizootiologic situation with a tendency to increasing the numbers of affected animals during the observation period. Similar tendencies with rabies among animals were developing in the Siberian and the North-Western Federal Districts.
Key words: rabies, structure and dynamics of morbidity, epizoo-tiologic situation.
Поступила 17.10.07.
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК б1б.981.452:57б.809.7
И.В.Бахтеева, Т.Б.Кравченко, Г.М.Титарева, С.А.Иванов
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ pH 6 АНТИГЕНА YERSINIA PESTIS С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
Ранее было показано, что pH б антиген Yersinia pestis оказывает цитотоксическое действие на перитонеальные и альвеолярные макрофаги кроликов и морских свинок. В настоящей работе изучено действие pH б антигена на различные типы клеток млекопитающих. Эксперименты с препаратами pH б антигена Y. pestis показали, что антиген в концентрациях от 1 до 100 мкг/мл не проявлял цитотоксической активности по отношению к прикрепленным к пластику эукариотическим клеткам. В то же время pH б антиген усиливал адгезию мышиных перитонеальных макрофагов к пластику и дифференцировку человеческих промиелоидных клеток.
Ключевые слова: цитотоксическая и адгезивная активность, Y. pestis, pH6 антиген.
Впервые рН 6 антиген описан в 1961 г. Веп-Е&аип е! а1. [4] как антиген, синтезирующийся
У. pest/5 при температуре 37 °С в диапазоне pH, близких к значению содержимого фаголизосом или тканевых абсцессов - мест размножения Y. pestis [5]. Позднее получены данные о том, что его синтез индуцируется непосредственно в фаголизосоме макрофагов [9, 11]. Этот антиген представляет собой агрегат из мономеров размером 15 кДа [8] и формирует полиморфные фимбрии [9]. Штаммы Y. pestis, мутантные по синтезу рН 6 антигена, обла-
дают сниженной вирулентностью для мышей, что подтверждает участие этого антигена в патогенезе чумы [2, 8, 9]. Он имеет структурное сходство с пи-левыми адгезинами Escherichia coli и Yersinia pseudotuberculosis [9], способен агглютинировать эритроциты различных видов животных [5], цито-токсичен для перитонеальных макрофагов кроликов и морских свинок [5], а также альвеолярных макрофагов морских свинок и мышей [3]. Выявлено участие pH6 антигена в подавлении поглотительной [7] и переваривающей [1] активностей макрофагов, а
также в адгезии патогена к эпителиальным клеткам [12]. Однако в настоящий момент нет доказательств того, какие именно свойства рН 6 антигена обеспечивают его роль фактора вирулентности в патогенезе чумы.
Цель данной работы - оценить цитотоксиче-скую и адгезивную активности pH6 антигена, используя различные типы эукариотических клеток.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, клеточные линии и животные.
В качестве продуцента для выделения рН 6 антигена использован штамм Y. pestis КМ260(11), являющийся бесплазмидным производным штамма Y. pestis 231. Штамм Y. pestis КМ260(11) получен от Л.В.Самойловой из коллекции Российского научноисследовательского противочумного института «Микроб» (Саратов, Россия).
В качестве клеток-мишеней использованы мышиные макрофагоподобные клеточные линии J744.A1 и RAW 264.7, линия мышиных фибробла-стов L929 и человеческие моноцитарные линии THP-1 и U937, перитонеальные макрофаги мышей C57/BL, перитонеальные и альвеолярные макрофаги инбредных морских свинок, а также человеческие моноциты, изолированные из крови здоровых доноров. Перитонеальные и альвеолярные макрофаги получали путем промывания брюшной полости и легких соответственно фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 0,1 % глюкозы. Мононуклеары человека выделены из крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Pack 1077 г/л с дальнейшим выделением моноцитов путем адгезии на пластике. Перитонеальные и альвеолярные макрофаги и клеточные линии животных культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки теленка; для человеческих клеточных линий и моноцитов человеческой крови использовали среду RPMI-1640.
Выделение и очистку рН 6 антигена из культуральной жидкости проводили по методике E.Mako-veichuk et al. [11].
Цитотоксическое действие pH 6 антигена оценивали колориметрическим методом с использованием 3 -(4,5 -диметилтиазол-2-ил)-2,5 -дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) [10] и визуальным наблюдением с помощью инвертированного микроскопа. Исследуемые препараты pH 6 антигена вносили в среду культивирования либо в момент ино-
куляции эукариотических клеток на пластик, либо после формирования зрелого клеточного монослоя через 24 ч после инокуляции. В ряде экспериментов для учета гибели клеток использовали прижизненную окраску клеточного монослоя красителем три-пановым синим.
Оценка клеточной дифференцировки. Диффе-ренцировку человеческих промиелоидных клеток ТНР-1 и и937 в макрофаги индуцировали добавлением различных доз форболмиристилацетата (ФМА) [6]. Степень клеточной дифференцировки оценивали по количеству распластанных на пластике клеток колориметрическим методом с использованием МТТ. Для оценки действия pH 6 антигена на процесс ФМА-индуцированной дифференцировки, различные дозы pH 6 антигена (от 1 до 100 мкг/мл) добавляли в лунки к клеткам ТНР-1 и и937 совместно с различными дозами ФМА (от 10 до 100 нг/мл). Контролем служили лунки, куда добавляли только ФМА в соответствующей концентрации.
Статистические методы. Уровни значимости (Р) определены с помощью расчета критерия Стью-дента t. Р < 0,05 считали статистически значимыми.
Результаты и обсуждение
Для тестирования использовали препараты pH 6 антигена с чистотой не менее 95 % в высокомолекулярной форме в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкг/мл. Показано, что при добавлении pH 6 антигена к зрелому клеточному монослою через 24 ч после высаживания клеток на пластик клеточная жизнеспособность не изменялась. Отсутствие цитотоксического эффекта зарегистрировано как для первичных клеточных культур (таблица), так и для перевиваемых клеточных линий (данные не показаны). Таким образом, pH 6 антиген Y. pestis не проявлял цитотоксической активности и не оказывал никакого влияния на клеточную жизнеспособность сформированного клеточного монослоя.
Последующие эксперименты показали, что добавление pH 6 антигена к эукариотическим клеткам непосредственно в момент их пересева влияло на формирование клеточного монослоя. Это влияние зависело от концентрации pH 6 антигена. Добавление антигена в концентрациях выше 20 мкг/мл приводило к снижению клеточной жизнеспособности на 20-30 %, образованию клеточных агрегатов и нарушению формирования монослоя. На рисунках 1, Б и 2, В показан эффект агрегации мышиных мак-
Жизнеспособность* первичных клеточных культур животных и человека после 24 ч инкубирования их в присутствии pH 6 антигена Y. pestis
Концентрация pH 6 антигена, мкг/мл Типы клеток
Мышиные перитонеальные макрофаги Перитонеальные макрофаги морских свинок Альвеолярные макрофаги морских свинок Моноциты человека
100 102,2 ±7,8 101,1 ±7,7 98,2 ± 7,4 120,7 ± 13,6
50 112,8 ±8,7 102,7 ± 11,5 93,4 ± 10,4 122,5 ±9,5
25 115,4 ± 13,0 99,2 ± 11,0 92,4 ± 6,9 114,6 ±8,8
12,5 110,2 ± 12,3 104,5 ± 8,0 106,9 ±8,2 107,2 ±8,2
6,25 103,0 ± 11,6 99,3 ±11,3 116,5 ±12,8 94,6 ± 10,9
3,125 112,8 ±8,7 103,2 ± 11,5 110,9 ± 12,4 100,0 ±7,6
’Результаты представлены как процент клеток, сохранивших жизнеспособность после воздействия pH 6 антигена, по отношению к контролю.
Рис. 1. Формирование монослоя макрофагоподобных мышиных клеток 1774Л.1 под действием секретируемого pH 6 антигена Г. реяПя. х 100, без окраски:
А - интактные клетки (отрицательный контроль);
Б - клетки с добавлением 25 мкг/мл PH 6 антигена
рофагоподобных клеток J744.A1 и перитонеальных макрофагов мыши. Подобный эффект мы наблюдали на всех исследуемых клеточных культурах. Окраска клеточного монослоя прижизненным красителем трипановым синим визуализировала гибель клеток внутри клеточных конгломератов, в то время как распластанные клетки оставались жизнеспособными в течение всего периода наблюдения (данные не показаны). По-видимому, слипание клеток приводило к неоптимальным условиям жизнедеятельности и в связи с этим к снижению жизнеспособности. При концентрации pH 6 антигена ниже 20 мкг/мл образования агрегатов клеток не происходило. Напротив, в этом случае отмечено усиление адгезии мышиных перитонеальных макрофагов к пластику (рис. 2, Б).
Изучено влияние pH 6 антигена на ФМА-инду-цированную дифференцировку человеческих про-миелоидных линий. Добавление антигена в среду усиливало действие ФМА, в несколько раз увеличивая число прикрепленных к пластику человеческих промиелоидных клеток 'ГОР-! и и937. При этом присутствие в среде только pH 6 антигена не приводило к усилению адгезии клеток. Синергический эффект зависел от концентрации антигена и наблюдался в диапазоне от 3 до 25 мкг/мл. При использовании доз pH 6 антигена вне данного диапазона концентраций эффект стимуляции адгезии макрофагов к пластику исчезал. Стимулирующее действие pH 6 антигена на клеточную дифференцировку зависело также от концентрации ФМА и проявлялось в диапазоне концентраций от 4 до 125 нг/мл. При низких концентрациях ФМА процесс клеточной дифференцировки не происходил совсем, а при увеличении более 125 нг/мл - практически не зависел от присутствия pH 6 антигена.
Рис. 2. Формирование монослоя перитонеальных макрофагов мыши под действием секретируемого pH 6 антигена Г. реяПя. х 100, без окраски:
А - интактные клетки (отрицательный контроль);
Б - клетки с добавлением 5 мкг/мл PH 6 антигена;
В - те же с добавлением 25 мкг/мл PH 6 антигена
Проведенные исследования показали отсутствие цитотоксических свойств у препаратов pH 6 антигена. Обнаружено влияние pH 6 антигена на адгезию эукариотических клеток к абиотическим поверхностям. Высокие дозы pH 6 антигена при его добавлении одновременно с инокуляцией клеток на пластик инициировали клеточную агрегацию и в результате нарушали адгезию клеток к пластику. Низкие дозы pH 6 антигена способствовали адгезии клеток и, как следствие, стимулировали процесс дифференцировки промиелоидных клеток THP-1 и U937 в макрофаги. Представленные данные свидетельствуют о том, что участие pH 6 антигена в реализации вирулентных свойств Y. pestis определяется не цитотоксическими механизмами, а, скорее всего, его свойствами белка-адгезина. Кроме того, наши результаты о pH 6 антиген-медиированной агрегации моноцитов и макрофагов предполагают потенциальную роль pH 6 антигена в нарушении функциональной активности макрофагов в некротических очагах.
Работа выполнена при поддержке Международного Научно Технического Центра в рамках проекта № 2927.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Водопьянов С.О., Попова Г.О., Васильева Г.И. и др. // Журн. микробиол. - 1990. - № 3. - С. 3-6. -
2. Панферцев Е.А., Черепанов П.А., Каримова Г.А. // Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы: Матер. XIV науч.-практ. конф. - Оболенск, 1991. - С. 22-24. -
3. Степаншина В.Н., Гремякова Т.А., Анисимов А.П. и др. // Журн. микробиол. - 1993. - № 3. - С. 12-17. -
4. Ben-Efraim S., Aronson M., Bichowsky-Slonimsky L. // J. Bacteriol. - 1961. - Vol. 81. - P. 704-714. - 5. Bichow-ski-Slonimski L., Ben-Efraim S. // J. Bacteriol. - 1963. -Vol. 86. - P. 101-111. - 6. Hass R., Bartels H., Topley N. et al. // Eur. J. Cell Biol. - 1989. - Vol. 48. - P. 282-293. - 7. Huang X.-Z., Lindler L.E. // Infect. Immun. - 2004. - Vol. 72. -P. 7212-7219 - 8. Lindler L.E., Klempner M.S., Straley
5.C. // Infect. Immun. - 1990. - Vol. 58. - P. 2569-2577. - 9. Lindler L.E., Tall B.D. // Mol. Microbiol. - 1993. - Vol. 8. -P. 311-324. - 10. Liu F., Chen H., Galvan E.M. et al. // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74. - P. 5636-5644. - 11. Makovei-chuk E., Cherepanov P., Lundberg S. et al. // J. Lipid Res. - 2003. - Vol. 44. - P. 320-330. - 12. Yang Y., Merriam J.J., Mueller J.P., Isberg R.R. // Infect. Immun. - 1996. -Vol. 64. - P. 2483-2489.
I.V.Bakhteyeva, T.B.Kravchenko, G.M.Titareva, S.A.Ivanov
Interaction of Yersinia pestis pH 6 Antigen with Various Types of Eucaryotic Cells
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Yersinia pestis pH 6 antigen was previously shown to be capable of producing cytotoxic effects on the peritoneal and alveolar macrophages of rabbits and guinea pigs. In the present work the authors endeavored to analyse the effects of the pH 6 antigen upon different types of mammal cells. The experiments with the pH 6 antigen of Y. pestis demonstrated its concentrations, ranging from1 to 100 ^g/ml, to cause no cytotoxic activity for the eucaryotic cells attached to plastic. At the same time, the antigen pH6 enhanced the adhesion of murine peritoneal macrophages to the plastic and facilitated more rapid differentiation of human promyeloid cells.
Key words: cytotoxic and adhesive activity, Y. pestis, pH6 antigen.
Поступила 06.09.06.
