CC BY
22
N.V.Popov, V.-B.-Kh.Sandzhiev, G.V.Sangadzhieva, A.I.Udovikov, S.A.Yakovlev, T.B.Karavaeva, A.V.Podsvirov, V.V.Kutyrev
The Impact of the Present-Day Climate Warming upon the Evolution of the New Inter-Epidemic Period in the Pre-Caspian North-Western Steppe Natural Plague Focus
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe”, Saratov;
Elista Plague Control Station, Elista
The development of two deep depressions in the numbers of small sousliks, observed in the 50ths - 60ths and 80ths - 90ths of the twentieth
century, was shown to be significantly contributed to by the climatic factors in the North-Western Pre-Caspian region. The important role of the present-day climate warming upon the evolution of the inter-epidemic period in the North-Western Pre-Caspian steppe natural plague focus was ascertained, too. Search for Yersinia pestis strains in the rodent burrows soil in the areas of stable plague manifestations was recognized as a perspective surveillance measure to be practiced.
Key words: Small sousliks, number dynamics, climatic factors, interepizootic period, climate warming, rodent burrow soil.
Поступила 06.03.07.
микробиология и диагностика
удк 616.981.452+576.8.097.21:599.323.4
И.В.Бахтеева, С.В.Дентовская, Е.А.Панферцев, Т.Э.Светоч, Т.Б.Кравченко, М.Е.Платонов, Г.М.Титарева, Т.И.Комбарова, С.А.Иванов, А.П.Анисимов
вирулентность для мышей ph 6+ и ph 6- штаммов yersinia pestis
ФГУНГосударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
С помощью сайт-направленного мутагенеза оперона psa, кодирующего синтез pH 6 антигена (пилей адгезии), и последующей транс-комплементации получено два изогенных набора штаммов Yersinia pestis, включающих штаммы дикого типа 231 и И-1996, их pH 6- неполярные мутанты с делециями структурного гена psaA или всего оперона, и штаммы, восстановившие способность к температурно- и pH-зависимому синтезу пилей адгезии или конститутивной продукции pH 6 антигена. Показано, что утрата способности к синтезу или конститутивная продукция pH 6 антигена не оказывают влияния на вирулентность и средние сроки жизни зараженных мышей при подкожном способе заражения.
Ключевые слова: вирулентность, Yersinia pestis, pH 6 антиген.
поверхностный белок pH6 антиген синтезируется в клетках Y. pestis в диапазоне температур 35-41 °С и кислых условиях среды [7]. pH 6 антиген образует на клеточной поверхности Y pestis и Y pseudotuberculosis гомополимерные пили адгезии [3, 13]. С одной стороны, pH 6 антиген обладает адгезивной активностью в отношении эритроцитов [6, 7] и культивируемых эпителиальных клеток млекопитающих за счет связывания с фосфатидилхолином [11]. С другой - он препятствует фагоцитозу [6], вероятно, путем экранирования бактериальной поверхности за счет способности связывать аполипопротеин B-содержащие липопротеины плазмы крови [14], фибронектин, муцин и ганглиозид [2], фосфатидилхолин легочного сурфактанта [11]. Была показана цитотоксичность pH 6 антигена для перитонеальных [7] и альвеолярных макрофагов [6], но pH 6 антиген не токсичен при подкожном введении кроликам (1000 мкг), морским свинкам (625 мкг) и мышам (100 мкг) [6].
Установлено, что psa оперон Y pestis и Y pseudotuberculosis устроен подобно другим оперонам, кодирующим пилевые адгезины, субъединицы которых секретируются на поверхность бактерий с помощью системы секреции IV типа [15], и состоит из двух регуляторных генов psaE и psaF, отвечающих за температурную (37 °С) и pH (5,8-6,0) регуляцию транскрипции, а также структурного гена psaA и генов psaB и psaC, кодирующих соответственно периплазмати-
ческий шаперон и молекулярный ашер [12]. Методом сайт-направленного мутагенеза показано, что вирулентность psaE или psaA мутантов аттенуированного Pgm- штамма Y pestis К1М5 при внутривенном заражении мышей снижалась на два порядка [12], а psaF мутанты штамма 231 «дикого» типа полностью утрачивали вирулентность для мышей и морских свинок при подкожном способе заражения [5].
В настоящей публикации описано получение ApsaA и ApsaEFABC мутантов вирулентных штаммов, последующая транскомплементация этих мутаций с помощью рекомбинантных плазмид, несущих полный (psaEFABC) или неполный опероны (локус psaABC), а затем сравнительная оценка вирулентности изогенных штаммов Т pestis, отличающихся по способности синтезировать pH 6 антиген.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. Использованные в работе штаммы Т pestis и плазмиды представлены в таблице. Бактерии выращивали на питательной среде на основе сердечно-мозговой вытяжки (ВН1), pH 7,2 или 5,8.
в случае необходимости в питательные среды добавляли антибиотики: ампициллин - 100 мкг/мл, канамицин - 40 мкг/мл, хлорамфеникол - 10 мкг/мл, полимиксин В - 100 мкг/мл.
Мутагенез. Нокаутные мутанты получали с по-
Вирулентность экспериментальных штаммов возбудителя чумы при подкожном заражении мышей
Штаммы Y. pestis Характеристика LD50, КОЕ * Средние сроки жизни, сут
231 Fra+Ymt+Lcr+pH 6+Pla+Pgm+ ** 1 (1-2) 5,4 ± 0,54
231ApsaEFABC Fra+Ymt+Lcr+pH 6-Pla+Pgm+ 2(1-5) 4,7 ± 0,95
231ApsaEFABCpJG428 Fra+Ymt+Lcr+pH 6+Pla+Pgm+ 3 (1-10) 4,9 ± 0,66
231ApsaEFABCpIG924Cm Fra+Ymt+Lcr+pH 6+Pla+Pgm+ 3 (1-10) 5,5 ± 1,50
И-1996 Fra+Ymt+Lcr+pH 6+Pla+Pgm+ 1 (1-2) 6,2 ± 0,90
M-1996ApsaA Fra+Ymt+Lcr+pH 6-Pla+Pgm+ 4 (1-16) 5,7 ± 1,10
M-1996ApsaEFABC Fra+Ymt+Lcr+pH 6-Pla+Pgm+ 3(1-13) 4,9 ± 1,20
M-1996ApsaEFABCpIG924Cm Fra+Ymt+Lcr+pH 6+Pla+Pgm+ 1 (1-5) 7,1 ± 0,90
* В круглых скобках представлен 95 % доверительный интервал.
** Способность к продукции: Fra - капсульного антигена, Ymt - мышиного токсина, Lcr - Yop белков и V антигена, p H6 - p H6 антигена, Pla -активатора плазминогена; Pgm - сочетанная способность к сорбции гемина и чувствительности к пестицину.
мощью технологии одноэтапной инактивации хромосомных генов [8] или плазмид на основе суицидного вектора pCVD442 [9]. Верификацию замены генов проводили c помощью полимеразой цепной реакции. Отсутствие продукции pH 6 антигена подтверждали методом иммуноблоттинга.
Комплементацию нокаутных мутаций проводили с помощью плазмиды pJG428 (ApRTcR), включающей полный оперон psaEFABC, клонированный в составе вектора pHC79 [14] или плазмиды pIG-B924Cm (CmR), несущей гены psaABC и ген cat из плазмиды pBR325 в составе вектора pBluescriptIIKS (MBI Fermentas).
Оценку вирулентности проводили на 6-8-недельных самках линейных мышей Balb/c. По пять мышей на одну дозу заражали подкожно введением 10-кратных разведений 28-градусных культур Y. pestis в изотоническом растворе NaCl в объеме 0,1 мл на животное. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Выделенные культуры Y. pestis проверяли на наличие маркеров лекарственной устойчивости и способность к продукции pH 6 антигена. Вычисление величин LD50 проводили по методу Karber в модификации И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева [1].
результаты и обсуждение
Учитывая значительное несовпадение данных по влиянию на вирулентность мутаций по различным генам psa оперона, полученных с использованием отличающихся по вирулентности и выделенных в географически удаленных природных очагах чумы штаммов Y. pestis при различных способах заражения [5, 12], мы выбрали для наших экспериментов два высоковирулентных штамма bv. antiqua, 231 и И-1996. Первый из них был ранее использован в аналогичных экспериментах [5], а нуклеотидная последовательность его psa оперона (номер доступа в GenBank - EF079883) полностью соответствует таковым в секвенированных геномах других штаммов Y. pestis (http://www.ericbrc.org/portal/eric/ yersiniapestis?id =enteropathogens&subid=yersiniape
stis). Сайт-направленный мутагенез позволил получить на основе обоих штаммов производные с деле-циями полного оперона и вариант штамма И-1996, лишенный структурного генаpsaA. Мутанты Y. pestis 231ApsaA получить не удалось.
Передача плазмид pJG428 или pIG924Cm в штамм Y. pestis №1996ApsaA не приводила к восстановлению продукции pH 6 антигена. Передача плазмид pJG428 или pIG924Cm в клетки мутантов обоих штаммов чумного микроба, полностью лишенных psa оперона (ApsaEFABC), обеспечивала восстановление синтеза pH 6 антигена. Аналогичные результаты были получены в серии предварительных экспериментов (данные не приводятся) - при передаче указанных плазмид в клетки ApsaEF и ApsaA мутантов аттенуированных штаммов Y. pestis и ApsaA мутантов Y. pseudotuberculosis продукция pH 6 антигена не восстанавливалась. Однако экспрессия полного или укороченного psa оперона выявлена в клетках Y. enterocolitica с интактным myfF опероном. Как и в клетках E. coli (данные не приводятся), плазмида pIG924Cm, лишенная регуляторных генов psaE и psaF, обеспечивала в клетках ApsaEFABC мутантов Y. pestis конститутивный синтез pH 6 антигена в диапазоне исследованных температур выращивания от 28 до 37 °С при pH питательной среды от 5,8 до 7,2.
Двукратная анимализация штаммов Y. pestis 231ApsaEFABCpJG428, 231ApsaEFABCpIG924Cm и №1996ApsaEF4BCpIG924Cm путем подкожного заражения мышей 108 КОЕ без их лечения антибиотиками позволила получить от некоторых животных культуры исследуемых штаммов, 100 % клонов которых сохранили маркеры лекарственной устойчивости и способность к продукции pH 6 антигена. Известно, что рекомбинантные плазмиды на основе реплико-на ColE1 (pHC79, pBR322) не способны стабильно наследоваться в клетках Y. pestis без селективного давления [10]. Однако аналогичную нашим данным картину стабилизации наследования плазмиды pFS1, кодирующей синтез другого пилевого адгезина Y. pes-tis - капсульного антигена F1 и сконструированной на основе того же космидного вектора - pHC79, наблюдала Т.А.Гремякова при пассировании через организм
мышей штамма Salmonella enterica bv. Typhimurium SL3261pFS1 [4]. Поскольку отбор pH 6+ и/или F1+ клонов в организме теплокровного хозяина свидетельствует о селективных преимуществах бактериальных клеток, продуцирующих пилевые адгезины, это послужило основанием для оценки вирулентности всех рекомбинантных штаммов без введения экспериментально зараженным животным антибиотиков.
Сравнительная оценка вирулентности исследуемых штаммов Y pestis для лабораторных животных при подкожном способе заражения не выявила различий в величинах LD50 штаммов «дикого» типа, а также всех сконструированных нами pH 6- и pH 6+ вариантов (таблица). Средние сроки жизни мышей, погибших в результате заражения штаммами 231 и И-1996 или их изогенными производными, практически не отличались. Эти данные согласуются с результатами изучения влияния на вирулентность другого антигена Y. pestis - F1, который так же, как и pH6 антиген, относится к семейству пилевых адгезинов и обладает антифагоцитарной активностью. Сайт-направленные мутации, нарушающие продукцию капсульного F1 антигена не снижали вирулентность
Y pestis в отношении мышей и морских свинок [10]. Вероятно, в случае утраты любого из этих антигенов мутации функционально комплементировались усилением продукции одного или нескольких из восьми других пилевых адгезинов, опероны которых выявлены в геноме Y pestis.
Представленные в настоящей работе данные о необязательности наличия pH 6 антигена в клетках чумного микроба для «полной» вирулентности Y. pestis противоречат данным более ранних исследований по оценке вирулентности pH 6- вариантов возбудителя чумы [5, 12]. Использование Lindler et al. [12] Pgm- штамма KIM5 позволяет нам предположить, что 200-кратное снижение вирулентности его pH 6- производного при внутривенном заражении мышей может быть связано именно со сниженной вирулентностью исходного штамма, способного вызывать генерализованную инфекцию с летальным исходом только при внутривенном заражении. На наш взгляд, накопление в штамме дикого типа мутаций, потенциально снижающих его способность эффективно размножаться в организме хозяина, до какого-то времени компенсируется наличием широкого набора факторов патогенности Y. pestis. Поэтапная элиминация этих факторов из микробной клетки на определенной стадии приводит к невозможности компенсации их утраты за счет сверхпродукции оставшихся, что проявляется в значительном снижении вирулентности.
Что же касается разительных отличий в вирулентности pH 6- мутантов, полученных на основе вирулентного штамма 231, то здесь возможно два объяснения. Не исключено, что в экспериментах Панферцева и соавт. [5] был использован субклон исходного штамма 231, в популяции которого вследствие неоднократных пересевов на искусственных
питательных средах без периодической анимализации произошло накопление неидентифицированных мутаций, потенциально снижающих его способность эффективно размножаться в организме хозяина. Утрата еще одного фактора патогенности привела к полной потере вирулентности при подкожном способе заражения. Также возможно, что мутация по гену psaF приводила не только к прекращению продукции pH 6 антигена [5], но и оказывала полярный эффект на опероны других пилевых адгезинов Y. pestis, что могло стать причиной угнетения их продукции и соответствующей утраты вирулентности. В пользу этого предположения свидетельствует невозможность транскомплементации ApsaEF и ApsaA мутаций
Y pestis с помощью генов psaABC или полного psa оперона (настоящая работа).
таким образом, утрата способности продуцировать pH 6 антиген не влияет на вирулентность ApsaA и ApsaEFABC мутантов Y. pestis при подкожном способе заражения мышей, что свидетельствует о непер-спективности использования pH 6 антигена в качестве молекулярной мишени для терапии чумы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях - Л.: Гос. изд-во мед. лит-ры, 1962. - С. 85-104. - 2. Водопьянов С.О., Атарова Г. Т., Олейников И.П. и др. // ЖМЭИ. - 1993. -№ 3 - С. 6-12. - 3. Водопьянов С.О., Попова Г.О., Васильева Г.И. и др. // ЖМЭИ. - 1990. - № 3. - С. 3-6. - 4. Гре-мякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов: Дис. ... докт. мед. наук. - М., 2004. - 320 с. - 5. Панферцев Е.А., Черепанов П.А., Каримова Г.А. // Матер. XIV науч.-практ. конф.: Тез. докл. (21-23 мая 1991 г., Оболенск). - Оболенск, 1991 - С. 2224. - 6. Степаншина В.Н., Гремякова Т.А., Анисимов А.П. и др. // ЖМЭИ. - 1993. - № 3. - С. 12-17.- 7. Bichowsky-Slomnicki L., Ben-Efraim S. // J. Bacteriol. - 1963. - Vol. 86. -P. 101-111. - 8. Datsenko K.A., Wanner B.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - P. 6640-6645. - 9. Donnen-berg M.S., Kaper J.B. // Infect. Immun. - 1991. - Vol. 29. -P. 4310-4317. - 10. Drozdov I.G., Anisimov A.P., Samoilova S. V. et al. // J. Med. Microbiol. - 1995. - Vol. 42. - P. 264268. - 11. Galvan E.M., Chen H., Schifferli D.M. // Infect. Immun. - 2007. - Vol. 75 - P. 1272-1279. - 12. Lindler L.E., Klempner M.S., Straley S.C. // Infect. Immun. - 1990. -Vol. 58; - P. 2569-2577. - 13. Lindler L.E., Tall B.D. // Mol. Microbiol. - 1993. - Vol. 8. - P. 311-324. - 14. Makoveichuk E., Cherepanov P., Lundberg S. et al. // J. Lipid. Res. - 2003. -Vol. 44. - P. 320-330. - 15. Pizarro-Cerda J., Cossart P. // Cell. - 2006. - Vol. 124. - P. 715-727.
I.V.Bakhteyeva, S.V.Dentovskaya, E.A.Panfertsev, T.E.Svetoch,
T.B.Kravchenko, M.E.Platonov, G.M.Titareva, T.I.Kombarova, S.A.Ivanov, A.P.Anissimov
Virulence for Mice of pH6+ and pH6- Yersinia pestis Strains
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
The technique of site-directed mutagenesis of psa operon encoding the synthesis of pH6 antigen (adhesion pili), followed by the trans-complementation procedure were used to construct two sets of isogenic Yersinia pestis strains including wild type strains 231 and I-1996, their non-polar pH6- mutants containing deletions in the structural psA gene or in the entire operon, as well as the strains which could recover their capability for temperature- and pH-dependent synthesis of the adhesion pili or the constitutive pH6 antigen production. The loss of the ability to synthesize the pH6 antigen and its constitutive production was shown to affect neither their virulence characteristics nor mean lifetime assessments for the subcutaneously infected mice.
Key words: virulence, Yersinia pestis, pH6 antigen.
Поступила 29.10.07.
