CC BY
22
УДК 616.981.452
Г.А.Ерошенко, Н.А.Видяева, Л.М.Куклева, Е.И.Кошель, Г.Н.Одиноков, Н.Ю.Шавина, Т.В.Князева, Т.В.Мокроусова, Я.М.Краснов, Л.В.Анисимова, Л.А.Новичкова, П.С.Ерохин, А.В.Бойко, В.В.Кутырев
ИЗУЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ У БЕСПИГМЕНТНЫХ И БЕСПЛАЗМИДНЫХ МУТАНТОВ ШТАММА YERSINIA PESTIS НА БИОТИЧЕСКИХ ПОВЕРХНОСТЯХ В УСЛОВИЯХ IN VITRO И IN VIVO
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
У беспигментных и бесплазмидных мутантов - изогенных вариантов высоковирулентного штамма Yersinia pestis 231 - проведено изучение образования биопленки на биотических поверхностях в условиях in vitro (на лабораторной модели нематоды Oaenorhabdütis elegans) и in vivo (в пищеварительном тракте блохи Nosopsyllus laeviceps). Установлено, что причиной спонтанной потери способности к формированию биопленки и образованию пигментированных колоний может быть не только делеция всей хромосомной области пигментации, но и точечная мутация в структурном hms опероне. Показано, что отсутствие плазмид pCad, pFra или pPst не влияет на способность бесплазмидных мутантов формировать биопленку на кутикуле нематоды C. elegans.
Ключевые слова: возбудитель чумы, мутанты, биопленка, биотическая поверхность
G.A.Eroshenko, N.A.Vidyaeva, L.M.Kukleva, E.LKoshel’, G.N.Odinokov, N.Yu.Shavina, T.V.Knyazeva, T.V.Mokrousova, Ya.M.Krasnov, L.V.Anisimova, L.A.Novichkova, P.S.Erokhin, A.V.Boiko, V.V.Kutyrev
Studies of Biofilm Formation in Non-Pigmented and Plasmid-Deprived Mutants of Yersinia pestis on Biotic Surfaces, in vivo and in vitro Conditions
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
In non-pigmented and plasmid-deprived mutants - isogenic variants of highly virulent Yersinia pestis 231 strain - studied is the mechanism of biofilm formation on biotic surfaces, both in vitro (on the laboratory model of nematode Caenorhabdiitis elegans) and in vivo (inside the alimentary tract of Nosopsyllus laeviceps flea). It is determined that spontaneous loss of ability to form biofilms and generate pigmented colonies in the mutants is probably caused not only by the deletion of the whole chromosome pigmentation fragment, but also by a point(single base) mutation in structural hms operon. It is demonstrated that the absence of pCad, pFra or pPst plasmids does not have an impact on the ability of plasmid-deprived mutants to form biofilm on the cuticle of nematode C. elegans.
Key words: plague agent, mutants, biofilm, biotic surface.
Возбудитель чумы Yersinia pestis имеет сложный жизненный цикл, включающий пребывание в теплокровном хозяине (37 °С, богатая питательная среда, воздействие иммунной системы) и пищеварительном тракте переносчика - блохи (28 °С, ограниченные питательные ресурсы, действие пищеварительных ферментов насекомого). Смена фазы жизненного цикла, связанная с переходом из теплокровного организма в переносчика - блоху, приводит к перестройке метаболических процессов возбудителя и прекращению образования факторов патогенности, необходимых для выживания и размножения в условиях организма млекопитающих. Под действием сигналов (в том числе и снижения температуры до 28 °С), поступающих из внешней среды, возбудитель чумы переходит в состояние биопленки - многослойного скопления клеток, погруженных в экзополисахаридный матрикс. В пищеварительном тракте блохи, куда возбудитель попадает с кровью, на акантах преджелудка он образует массивную биопленку - «чумной блок», наличие которого повышает эффективность трансмиссии Y pestis [6, 8].
За биосинтез биопленки у Y. pestis отвечает целый
ряд генов, в том числе и гены, расположенные в хромосомной области пигментации [7, 13]. Хромосомная pgm область имеет размер 102 т.п.н. и фланкирована двумя копиями ^100 элементов, гомологичная рекомбинация по которым может явиться причиной спонтанной потери (с частотой 10-5) всей этой области [11]. Такая мутация вызывает утрату способности клеток Т pestis образовывать пигментированные колонии на среде с гемином или Конго красным и приводит к авирулентности штаммов [11, 12, 14]. За образование пигментированных колоний (вследствие адсорбции красителя на поверхности клеток) и формирование биопленки отвечает один и тот же ло-кус хромосомной области пигментации - оперон Нт-sHFRS [7, 8]. Другой участок pgm области - остров высокой патогенности НР1 - включает уЫ регион с генами иерсиниабактин-сидерофорзависимой системы транспорта железа и геном psn, кодирующим рецептор комплекса Ybt-Fe, а также чувствительность к видоспецифическому бактериоцину - пестицину. Наличие острова патогенности НР1, наряду с плазмидой кальцийзависимости pCad, кодирующей систему секреции III типа, является обязательным для
проявления вирулентности возбудителем чумы [14].
К настоящему времени установлено, что для формирования биопленки Y. pestis необходимы также гены биосинтеза гептозы gmhA, полиаминов speA, speC, сенсорной регуляторной двухкомпонентной системы PhoP/PhoQ и др. [9, 15, 16]. Однако несмотря на интенсивное исследование феномена образования биопленки у возбудителя чумы, генетические основы механизмов ее формирования остаются исследованными далеко недостаточно.
Целью нашей работы было изучение влияния различных мутаций в геноме штаммов возбудителя чумы на образование ими биопленки на биотических поверхностях в условиях in vitw - на модели круглого червя нематоды C. elegans и in vivo - в блохах Nosopsyllus laeviceps.
Материалы и методы
В работе использован набор беспигментных и бесплазмидных спонтанных мутантов, полученных из высоковирулентного штамма Y pestis 231 [14], а также вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ (табл. 1). Штаммы культивировали на 1,5 % агаре и в бульоне LB (pH 7,2) при 28 °С в течение 18-24 ч. Выделение ДНК штаммов проводили общепринятым способом [5]. Определение способности штаммов образовывать пигментированные колонии осуществляли выращиванием культур в течение 4 дней при 28 °С на твердой синтетической среде с Конго красным для изучения признака пигментации (производство РосНИПЧИ «Микроб»).
Изучение образования биопленки на биотической поверхности in vitro проводили на лабораторной модели - нематоде Caenorhabditis elegans (штамм N2 Bristol). Штамм получен из Caenorhabditis Genetics Center (Университет Миннесоты, США). На газон бактериальной культуры, выращенной на NGM агаре при комнатной температуре, наносили 20 взрослых особей для откладывания яиц, которых потом удаляли [8, 10]. Чашки инкубировали при 20 °С в течение 48 ч. О наличии у штамма способности к формированию биопленки судили по образованию этим штаммом массивного скопления клеток на головной и других частях тела нематод.
Исследование способности к формированию
биопленки на биотической поверхности in vivo осуществляли с использованием блох Nosopsyllus laeviceps. Инфицирование блох проводили на биомембране с заражающей взвесью бактерий 109 КОЕ/мл
[2]. С интервалом в 2 сут блох, зараженных Y pestis, подкармливали на белых мышах, а часть зараженных блох (по 10 шт. на каждый штамм) растирали с физраствором, взвесь наносили на покровные стекла, обрабатывали 2,5 % глутаральдегидом и затем просматривали на атомно-силовом микроскопе Solver P47-Pro (NT-MDT, Россия).
Для детекции генов использованы рассчитанные нами специфические праймеры на гены hmsHFRS, irp-2, psn :
CATCCCTGGCGTAAATGG;
hmsR-As ACTCATCCTATGTCTGGTG и hmsR-As GACCAGATATTCACTGCG;
hmsF-SAAGACAGCACAGGGCGGAC и hmsF-R TCCGTGGCCCACAGGTAA;
hmsH-S CTTCTGCCTATATTGACCG и hmsH-As GATGCCATTCTTGTAGCG;
Irp2-S ATGATTTCTGGCGCACCA и Irp2-As AGGCGATATGCAGCATTG;
Psn-S ACACAATATCACGGCAGC и Psn-AS ACCAGATTAACCGCCAGTC.
Амплифицированные фрагменты генов у штаммов Y. pestis секвенировали на генетическом анализаторе модели «CEQ 8000» (Beckman Coulter). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов осуществляли с использованием алгоритма BLAST (NCBI) и программного обеспечения MEGA 5.0.
Результаты и обсуждение
Изучение влияния различных мутаций на образование биопленки на биотической поверхности проводили с использованием коллекции изогенных мутантов, полученных из вирулентного штамма Y. pestis 231. Из этого штамма ранее были изолированы два спонтанных беспигментных мутанта [14]. Один из них Y. pestis 231/3 был получен селекцией на синтетической среде с красителем Конго красным путем отбора беспигментных колоний. Отобранный мутант Y. pestis 231/3, кроме потери способности об-
Таблица 1
Использованные в работе штаммы Y. pestis
Штамм Y.pestis Происхождение Характеристика Образование биопленки/ пигментсорбция
231 Природный штамм, выделен в 1947 г. в Аксайском высокогорном очаге чумы Вирулентный +/+
231/3 Производный штамма 231 Авирулентный, Pst1 -/-
KM130 « Вирулентный, Psts -/-
231 pCad- « Авирулентный, Psts +/+
231 pFra- « Вирулентный, Psts +/+
231 pPst- « Вирулентный, Psts +/+
ЕУНИИЭГ Выделен от трупа человека в 1926 г. на о. Мадагаскар Авирулентный, Psts -/-
разовывать пигментированные колонии, также полностью утратил вирулентность и чувствительность к видоспецифическому бактериоцину - пестицину (Pstr фенотип). Другой беспигментный мутант Y. pestis 130 был отобран путем высева органов морской свинки, павшей при заражении штаммом 231. Этот штамм в отличие от предыдущего беспигментного мутанта не потерял вирулентности и пестицинчув-ствительности. Кроме этих двух беспигментных мутантов, в работе были использованы бесплазмидные мутанты - производные штамма Y pestis 231, спонтанно утратившие одну из плазмид чумного микроба: кальцийзависимости - pCad, пестициногенно-сти - pPst или фракционную плазмиду pFra. Все три бесплазмидных варианта сохранили способность формировать пигментированные колонии на среде с красителем и пестицинчувствительность (Pgm+ Psts фенотип).
Для выяснения характера мутаций, вызвавших Pgm- фенотип у производных штамма Y pestis 231 - 231/3 и 130, нами были рассчитаны праймеры на разные участки хромосомной области пигментации: гены hmsHFRS оперона, острова патогенности HPI - irp2 и psn, а также на регуляторные гены hmsT и hmsP [10], контролирующие hms оперон и расположенные вне pgm области. В ПЦР с помощью этого набора праймеров была исследована структура pgm области у беспигментных мутантов Y. pestis 231/3 и 130 (табл. 2).
Как следует из табл. 2, у беспигментного мутанта Y. pestis 231/3 отсутствовали все гены hmsHFRS оперона, гены острова HPI - irp2 и psn. Аналогичную характеристику имел и изученный нами штамм Y. pestis ЕУНИИЭГ, у которого также не выявлялись гены hms локуса и острова высокой патогенности HPI. Ранее было показано, что у вакцинного штамма EV НИИЭГ отсутствует вся область пигментации вследствие обширной делеции в этом участке хромосомы [4]. Этот факт, а также высокая частота спонтанной утраты хромосомной области пигментации (10-5) позволяют с высокой степенью вероятности предположить потерю у беспигментного мутанта Y. pestis 231/3 всей области пигментации, в том числе и генов структурного hms оперона, необходимого для образования биопленки.
Таблица 2
Детекция в ПЦР генов хромосомной области пигментации у использованных в работе штаммов Y. pestis
Ген Штамм'''^^ hmsH hmsF hmsR hmsS irp2 psn hmsT hmsP
231 + + + + + + + +
231/3 + +
130 + + + + + + + +
ЕУНИИЭГ + +
231 pCad- + + + + + + + +
231 pFra- + + + + + + + +
231 pPst- + + + + + + + +
Pgm- фенотип другого беспигментного мутанта -Y. pestis 130 был вызван, очевидно, другой мутацией, поскольку в отличие от штамма Y. pestis 231/3 он сохранил высокую вирулентность и пестицинчувствительность. ПЦР -анализ штамма Y. pestis 130 показал, что он содержит все гены hms оперона и гены острова патогенности HPI - irp2 и psn. Это означает, что его Pgm- фенотип не связан с потерей всей pgm области, а скорее с мутацией, затрагивающей структуру самого hms оперона. Для ее выявления нами были секве-нированы амплифицированные в ПЦР фрагменты генов hmsHFRS. Последовательности фрагментов всех 4 генов были полностью идентичными у исходного штамма Y. pestis 231 и его беспигментного мутанта Y. pestis 130, за исключением единственной выявленной нами точечной мутации в гене hmsH - делеции единичного нуклеотида (-А) в позиции 254 от начала секвенированного в ПЦР фрагмента гена. Делеция единичного нуклеотида приводит к сдвигу рамки считывания гена hmsH и нарушению последовательности кодируемого геном структурного белка HmsH, необходимого для образования пигментированных колоний и формирования биопленки. Таким образом, причина отсутствия формирования биопленки и образования пигментированных колоний на среде с красителем у беспигментного мутанта Y. pestis 130 вызвана нарушением последовательности одного из структурных hms генов.
Для изучения влияния выявленных мутаций на образование биопленки на биотической поверхности в условиях in vitro нами была использована лабораторная модель круглого червя - нематоды C. elegans штамм N2 Bristol. На газон 18-часовых культур изучаемых штаммов наносили нематод, посевы инкубировали в течение 48 часов, после чего их просматривали для выявления образования биопленки на кутикуле червей. Штамм Y. pestis 231 образовывал хорошо видимую биопленку на головной и других частях туловища нематод (рис. 1, A), в то время как беспигментные мутанты 231/3 и 130 не образовывали ее (рис. 1, Б, В). Это означает, что оба типа мутаций -потеря всей области пигментации и точечная мутация в структурном гене hms оперона - вызывают потерю способности формировать биопленку на биотической поверхности - на кутикуле нематоды C. elegans.
На этой модели нами также было исследовано образование биопленки бесплазмидными мутантами штамма Y. pestis 231, поскольку ранее изучение влияния отсутствия плазмид чумного микроба на формирование биопленки на кутикуле нематод не проводилось. В результате проведенных экспериментов установлено, что потеря плазмид Y. pestis не приводит к нарушению проявления этого свойства. Все три бесплазмидных мутанта, спонтанно утративших плазмиды кальцийзависимости (Y. pestis 231 pCad ), пестициногенности (Y. pestis 231 pPst ) или фракционную (Y. pestis 231 pFra ), в отличие от беспигмент-ных изогенных мутантов, обладали способностью формировать биопленку in vitro на кутикуле немато-
Рис. 1. Изучение образования биопленки на модели нематоды C. elegans штаммами Y. pests: A - 231 исходный; Б - 231/3;
В - 130; Г -231 pCad-; Д -231 pPst-;
Е - 231 pFra-
ды C. elegans (рис. 1, Г, Д, Е), и, следовательно, гены, расположенные на плазмидах, не оказывали влияния на проявление этого свойства.
Нами была также исследована способность изогенных беспигментных мутантов Y. pestis 231, 231/3 и 130 образовывать биопленку в условиях in vivo - в пищеварительном тракте блохи N. laeviceps. Инфицирование блох проводили на биомембране с заражающей взвесью бактерий 109 КОЕ/мл [2]. Через 48 ч после заражения по 10 блох каждого штамма растирали с физраствором, и взвесь наносили на покровные стекла, фиксировали 2,5 % глутаральдеги-дом для дальнейшего просмотра на атомно-силовом микроскопе (рис. 2).
Через 2 сут после заражения штамм Y. pestis 231 содержался в преджелудке блох N. laeviceps в достаточно высокой концентрации (103-104 КОЕ). С помощью атомно-силовой микроскопии у культуры штамма 231, выделенной от блох, выявлена структура биопленки (рис. 2, А). После второй подкормки на 4-е сутки после заражения штаммом Y. pestis 231 обнаруживались блокированные блохи, содержащие массивную биопленку - «чумной блок» в преджелудке. В отличие от исходного штамма беспигментные мутанты - Y. pestis 231/3 и 130 выделялись от блох через 48 ч в низкой концентрации (101 и 102 КОЕ) и в виде отдельных несвязанных между собой клеток (рис. 2, Б, В). После второй подкормки на 4-е сутки культуры Y. pestis 231/3 и 130 от блох уже не выделялись, что свидетельствовало об их полном вымывании из блох из-за отсутствия способности колонизировать пищеварительный тракт насекомого.
В целом, беспигментные изогенные мутанты штамма Y. pestis 231 - 231/3 и 130 независимо от того,
какой тип мутаций они содержали - утрату всей области пигментации или точечную мутацию в одном из генов hms локуса - не образовывали биопленку на биотической поверхности in vitro - на кутикуле нематоды C. elegans, а также in vivo - в пищеварительном тракте блохи N. laeviceps. Это подтверждает ранее сделанный вывод о том, что сохранение структурнофункциональной целостности генов именно hms оперона необходимо для образования биопленки не только in vitro - на кутикуле нематоды C. elegans, но и in vivo - в блохе [8].
Изучение образования биопленки бесплазмид-ными вариантами штамма Y. pestis 231 в блохах нами не проводилось, поскольку такие исследования были выполнены в полном объеме ранее другими авторами, показавшими, что отсутствие плазмид pPst и pCad не приводит к снижению эффективности формирования «чумного блока» в преджелудке блохи
[3]. В то же время было установлено, что штаммы Y. pestis, лишенные плазмиды pFra, с низкой частотой вызывали образование блока в преджелудке блохи [1], что, по-видимому, было связано с их сниженной выживаемостью в пищеварительном тракте переносчика из-за отсутствия фосфолипазы Д, кодируемой геном ymt, локализованном на этой плазмиде. Эти данные указывают на то, что существуют различия в формировании биопленки на кутикуле нематод и в пищеварительном тракте блох у штаммов Y. pestis, лишенных плазмиды pFra, в отличие от pCad- и pPst-вариантов, эффективно образующих биопленку на обоих типах биотических поверхностей.
Таким образом, нами впервые получены данные о том, что спонтанная потеря способности к образованию биопленки может быть вызвана не только
Рис. 2. Изучение образования биопленки в блохах у штаммов У. pestis 231 (А), 231/3 (Б) и 130 (В) с помощью атомносиловой микроскопии. Размер АСМ изображения составляет 20x20 мкм
делецией всей области пигментации, как это было описано ранее [11], но и точечной мутацией в структурном hms опероне. Поскольку этот тип мутаций обнаружен у штамма Y pestis, выделенного из теплокровного животного и с учетом того, что другой тип Pgm- мутации (потеря pgm области) в природе также встречается у штаммов, выделенных от носителей -грызунов и переносчиков (блох), то это означает, что пребывание в макроорганизме может сопровождаться преобразованиями генома возбудителя, приводящими к изменению его вирулентности и адаптационных возможностей при смене фаз существования в его сложном жизненном цикле.
Работа выполнена по государственному контракту № 70-Д от 25 июля 2011 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Величко Л.Н., Князева Т.В., Анисимов А.П., Назарова Л.С., Мокроусова Т.В., Кокушкин А.М. и др. Влияние экспрессии генов Fra оперона Yersinia pestis на трансмиссивный и алиментарный пути передачи чумы грызунами. Пробл. особо опасных инф. 2000; 80:127-32.
2.Величко Л.Н., Кокушкин.А.М., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Марысаев В.Б. Применение аппарата для работы с инфицированными чумой блохами. Пробл. особо опасных инф. 1994;
3. Кокушкин А.М., Величко Л.Н., Князева Т.В., Анисимов П.И., Мокроусова Т.В. Изучение роли собственных плазмид и признака пигментсорбции в способности бактерий чумы ин-Лидировать блох и вызывать у них блокообразование. В кн.: Природно-очаговые инфекции и их профилактика. Саратов; 1991. С. 110-8
4. Кутырев В.В., Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Виноградова Н.А. Сравнительная генетическая характеристика вакцинного штамма Yersinia pestis EV и его предполагаемых «вирулентных производных». Журн. микробиол., эпидеми-ол. и иммунобиол. 2009; 4:50-6.
5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.
6. BacotAW, Martin CJ. Observation on the mechanism on the transmission of by fleas. J. Hyg. Plague Suppl. 1914; 3:423-39.
7. Bobrov A.G., Kirillina O., Ryjenkov D.A., Waters C.M., Price P.A., Fetherston J.D. et al. Systemic analysis of cyclic di-GNP signaling enzymes and their role in biofilm formation and virulence in Yersinia pestis. Mol. microbiol. 2011; 79:533-51.
8. Darby C, Hsu J.W., Ghori N., Falkow S. Caenorhabditis elegans: plague bacteria biofilm blocks food intake. Nature. 2002; 417:243-4.
9. Darby C, Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identification of gmhA, a Yersinia pestis gene required for flea blockage, by using a Caenorhabditis elegans biofilm system. Infect. Immun, 2005;
73:7236-42.
10. Eroshenko G.A., Vidyaeva N.A., Kutyrev V.V. Comparative analysis of biofilm formation by main and nonmain subspecies of Yersinia pestis strains. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2010; 59:513-20.
11. Fetherston J.D., Schuetze, P., Perry, R.D. Loss of the pigmentation phenotype in Yersiniapestis is due to the spontaneous deletion of 102 kb of chromosomal DNA which is flanked by a repetitive element. Mol. Microbiol. 1992; 6:512693-704.
12. Jackson S., Burrows T. The pigmentation of Pasteurella pestis on a defined medium containing haemin. Brit. J. Exp. Pathol. 1956; 37:570-6.
13. Kirillina O., Fetherston J., Bobrov A., Abney J., Perry R. HmsP, a putative phosphodiesterase, and HmsT, a putative diguany-late cyclase, control Hms-dependent biofilm formation in Yersinia pestis. Mol. Microbiol. 2004; 54:75-88.
14. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S., Protsenko O.A. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Psts associated with virulence. Microb. Pathog. 1992; 12(3):177-86.
15. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L., Fetherston J.D., Perry R.D., Oliveira M.A. Polyamines are essential for the formation of plague biofilm. J. Bacteriol. 2006; 188:2355-63.
16. Vadivaloo V.V. PhoP regulation of Yersinia pestis during flea infection. In: «Yersinia 2010». 10 th. Intern. Symp.; Oct. 23-27. 2010; Brazil. P. 67.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Velichko L.N., Knyazeva T.V., Anisimov A.P., Nazarova L.S., Mokrousova T.V, Kokushkin AM. et al. [Effect of Fra gene expression of Yersinia pestis operon on the vector-borne and alimentary routes of plague transmission by rodents]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2000; 80:127-32.
2. Velichko L.N., Kokushkin AM., Knyazeva T.V, Mokrousova T.V, Marysaev VB. [Usage of the equipment for work with plague infected fleas]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 1994; 4:49-55.
3. Kokushkin A.M., Velichko L.N., Knyazeva T.V, Anisimov P.I., Mokrousova T. V [Studies of the impact of intrinsic (inherent) plasmids and pigment-sorption characteristic on the plague agent ability to infect fleas and initiate block-formation in them]. In: [Natural Foci Infections and Their Prophylaxis]. Saratov; 1991. P. 110-8.
4. Kutyrev V.V, Eroshenko G.A., Kukleva LM., Shavina N.Yu., Vinogradova NA. [Comparative genetic characterization of the vaccine Yersinia pestis EV strain and its potential “virulent derivatives”]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2009; 4:50-6.
5. Maniatis T., Frich E., Sambruk G. [Molecular cloning]. M., 1984.
480 p.
Authors:
Eroshenko G.A., Vidyaeva NA., Kukleva L.M., Koshel’ E.I., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Knyazeva T.V., Mokrousova T.V., Krasnov YaM., Anisimova L.V., Novichkova LA., Erokhin P.S., Boiko A.V., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
Ерошенко Г.А., Видяева НА., Куклева ЛМ., Кошель Е.И., Одинокое Г.Н., Шавина НЮ., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Краснов ЯМ., Анисимова Л.В., Новичкова ЛА., Ерохин П.С., Бойко А.В., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 20.12.11.
