CC BY
54
обращает на себя внимание ретракция клеток, которая также наблюдалась нами и 2^и et al. [8] в световом микроскопе в культуре СаСо2 под действием НА/Р. Вместе с выявленной в рамках настоящего исследования способностью НА/Р вызывать, подобно NMDCY, обратимое, не поддающееся ингибированию моносахарами округление клеток СНО и других культур эти данные свидетельствуют в пользу высказанного нами предположения [1] о возможной идентичности двух вышеназванных факторов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Монахова Е.В., Писанов Р.В. // Пробл. особо опасных инф. - 2006. - Вып. 1 (91). - С. 15-20. - 2. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А. и др. // Биотехнология. - 2006. - № 6. - С. 8-15. - 3. Basu I., Mitra R., Saha P.K. et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 1999. - Vol. 179, N 2. -P. 255-263. - 4. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. // Infect. Immun. - 1983. - Vol. 45. - P. 558560. - 5. Ghosh A., Saha D.R., Hoque K.M. et al. // Infect. Immun. - 2006. - Vol. 74, N 5. - P. 2937-2946. - 6. Mel S.F., Fullner K.J., Wimer-Mackin S. et al. // Infect. Immun. -2000. - Vol. 68, N 11. - P. 6487-6492. - 7. Saha P.K., Koley
H., Nair G.B. // Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64, N 8. -P. 3101-3108. - 8. Wu Z., Milton D., Nybon A. et al. // Mi-crob. Pathog. - 1996. - Vol. 21. - P. 111-123. - 9. Wu Z., Nybon A., Magnusson K.E. // Cell Microbiol. - 2000. - Vol. 2. -P. 11-17.
O.V.Markina, E.V.Monakhova, L.P.Alekseeva, R.V.Pisanov
Investigation of the biological activity of Vibrio cholerae hemagglutinin/protease on the model of cell cultures
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
The biological activity of a recombinant Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/P) towards cell cultures was studied. HA/P was shown to cause cell rounding in CHO-K1, L-929, HeLa, HEp2 and McCoy and disruption of MDCK and СаСо2 dense monolayers followed by dislodgement of the cultures from the well bottom. The reversibility of the reaction was dose/time dependent. The results obtained are in accordance with the literary data on similar effects caused in cell cultures by NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) and provide evidence for our previous proposal about the possible identity of the two factors.
Key words: Vibrio cholerae, hemagglutinin/protease, NMDCY, cell cultures.
Поступила 04.06.07.
ДИАГНОСТИКА
УДК 616.981.452+616.9-092.9
М.Н.Киреев, А.Л.Кравцов, Т.М.Тараненко, Т.А.Храмченкова, С.Н.Клюева,
Н.П.Гусева, Т.П.Шмелькова
CРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ СТЕПЕНИ АКТИВАЦИИ КЛЕТОК ИММУНОФАГОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЫ У МЫШЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА
Российский научно- исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Методом проточной цитофлуориметрии проведена оценка степени активации клеток иммунофагоцитарной системы на модели крови белых мышей, иммунизированных различными препаратами капсульного антигена Ф1 чумного микроба. При сравнении двух высокоочищенных серологически идентичных, но различающихся по химическому составу антигенных препаратов Ф1, выделенных из вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, углеводсодержащего белка Ф1А и чистого белка Ф1Б, установлено по данным цитометрического анализа, что препарат Ф1А из агаровой культуры по сравнению с Ф1Б, полученным из микробных клеток, выращенных в бульоне, оказывал более интенсивное воздействие на метаболизм клеток иммунофагоцитарной системы и вызывал интенсивную активацию ядерного хроматина не только лейкоцитов крови, но и макрофагов перитонеального экссудата как показателя иммунологической перестройки организма, коррелирующего с уровнем протективности антигена. Полученная цитометрическая характеристика иммунобиологических свойств капсульного антигена Ф1 чумного микроба может быть полезна при выборе наиболее эффективного препарата в качестве компонента для химической чумной вакцины.
Ключевые слова: клетки иммунофагоцитарной системы, капсульный антиген Ф1 Yersinia pestis, проточная цитофлуориметрия, иммунохимические и иммунобиологические свойства.
Будучи видоспецифическим антигеном и основным иммуногеном возбудителя чумы, капсульный антиген (фракция 1) является важнейшей составной частью большинства чумных диагностических и профилактических препаратов [1, 6, 7, 9, 14]. Проведенное ранее сравнительное исследование иммунобиологической активности препаратов фракции 1 (Ф1), выделенных разными методами и раз-
личающихся по своему компонентному составу, выявило определенное различие между ними. Показано, что из двух испытанных препаратов - углеводсодержащего белкового капсульного антигена Ф1А из клеток, выращенных на агаровой среде, и чистого белка Ф1Б из фильтрата бульонной культуры чумного микроба первый оказывал более глубокое воздействие на метаболизм макрофагов белых мы-
шей [4]. Препарат обладал более высокой протек-тивной активностью при однократной иммунизации мышей [2], а также достоверно более высоким эффектом стимуляции колониеобразующей функции стволовых клеток [10] и вызывал образование антител в высоких титрах [3].
Представляло интерес для сравнительной оценки биологической активности двух различающихся по составу препаратов капсульного антигена Ф1А и Ф1Б на модели крови и перитонеального экссудата белых мышей использовать проточную цитофлуо-риметрию - современный информативный и достаточно быстрый метод, позволяющий в ответ на введение антигена обнаруживать конформационные изменения в ДНК лейкоцитов крови, связанные с активацией их ядерного хроматина, а также наблюдать сдвиги в лизосомальном аппарате клетки, коррелирующие с иммуномодулирующей активностью антигенов.
Материалы и методы
Исследованы высокоочищенные, серологически идентичные препараты капсульного антигена Ф1, выделенные стандартными методами из вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (Государственная коллекция патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб»).
Углеводсодержащую фракцию Ф1А извлекали из ацетонвысушенных клеток агаровой культуры в процессе солевой экстракции и последующего фракционного осаждения сульфатом аммония [12]. Чистый белок Ф1Б выделяли из центрифугата бульонной культуры путем одноэтапной колоночной гель-хроматографии на биогеле А-50m (Bio-Rad, США) [8]. Для характеристики химического состава и специфической активности препаратов капсульного антигена в них определяли содержание белка по Лоури, углеводов с антроновым реактивом [15] и серологическую активность в РИД, РНГА и ИФА. Для определения биологической активности препаратов применяли проточный цитометр JCP-22 фирмы Phywe (Германия) [13].
В качестве клеток иммунофагоцитарной системы рассматривали лейкоциты крови и клетки перитонеального экссудата беспородных белых мышей, однократно подкожно иммунизированных двумя исследуемыми препаратами Ф1 в дозе 100 мкг/мышь. Опытные группы состояли из 10 мышей, контролем служила группа из 6 неиммунизированных животных. Для получения перитонеального экссудата животных усыпляли хлороформом. Кровь и суммарную популяцию клеток перитонеального экссудата получали через сутки после иммунизации белых мышей опытной группы, когда, по данным метода проточной цитофлуориметрии, у них наблюдается выраженная реакция ядерного хроматина и лизосо-мального аппарата лейкоцитов в ответ на все pFra+ изогенные производные вакцинного штамма EV НИИЭГ чумного микроба, способные синтезировать капсулу [5].
Лейкоциты крови и клетки перитонеального экссудата суправитально окрашивали раствором красителя акридинового оранжевого (АО), аккуму-
лирующегося в ядре (зеленая флуоресценция от 530 до 580 нм) и цитоплазматических лизосомальных гранулах (красная флуоресценция в области более 600 нм) для одновременного анализа отдельных клеток на состояние ядерного хроматина и лизосо-мального аппарата после оптического разделения красной и зеленой флуоресценции на два различных фотодетектора [11, 13]. Активацию клеток иммунофагоцитарной системы у опытных животных оценивали по способности исследуемого препарата: вызывать изменение клеток иммунофагоцитарной системы в крови и брюшной полости по интенсивности красной флуоресценции лизосом (ИКФЛ), эти клетки (макрофаги и активированные лимфоциты) идентифицировали на гистограммах (в области более 100 условных единиц интенсивности флуоресценции) и подсчитывали в процентах по отношению к общему числу исследованных клеток; индуцировать активацию ядерного хроматина иммунокомпе-тентных клеток, вызывающую повышение уровня зеленой флуоресценции комплексов ДНК-АО, подсчитывали долю клеток, обладающих интенсивной зеленой флуоресценцией ядерного хроматина (ИЗФХ), а также значение коэффициента вариации (КВ) отдельных клеток по состоянию их ядерного хроматина в гетерогенной лейкоцитарной популяции [5]. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами.
Результаты и обсуждение
Иммунохимический анализ трех агаровых и трех бульонных серий капсульного антигена чумного микроба (табл. 1) показал, что все исследованные образцы капсульного антигена имеют белковую природу и практически одинаковы по серологической активности. Однако препараты Ф1А отличаются от чистого белка Ф1Б присутствием в них углеводного компонента, представленного галактозой и составляющего не более 10 % от сухого веса, что согласуется с ранее выполненными исследованиями [2].
Способность капсульного антигена чумного
Иммунохимическая характеристика препаратов капсульного антигена Ф1 чумного микроба
Таблица 1
Содержание, % Титры в
Препараты Ф1 белок полиса- харид РИД* РН^ nOA
У глеводсодержащие (агаровые) Ф1А
Опыт 1 + + 1:32000 1:64-10® 1:16-10®
Опыт 2 + + 1:32000 1:64-10® 1:32-10®
Опыт 3 95,Q 6,47 1:8000 1:64-10® 1:32-10®
Чистый белок
(бульонные) Ф1Б
Серия 40 1QQ,Q Q 1:32000 1:2-109 1:32-10®
Серия 42 1QQ,Q Q 1:32000 1:2-109 1:16-10®
Серия 44 1QQ,Q < 1,Q 1:32000 1:256-10® 1:16-10®
*Все образцы были гомогенны иммунохимически и образовывали четкую идентичную зону преципитации в РИД с чумными лошадиными агглютинирующими сыворотками.
б2
|
Реакция клеток иммунофагоцитарной системы мышей в ответ на введение капсульного антигена (Ф1):
А и В - лейкоциты крови и клетки перитонеального экссудата интактных животных соответственно; Б и Г - лейкоциты крови и клетки перитонеального экссудата на 1-е сутки после иммунизации животных препаратом капсульного антигена (Ф1А) чумного микроба.
По оси абсцисс - содержание лизосом на клетку в условных единицах красной флуоресценции АО; по оси ординат - состояние ядерного хроматина лейкоцитов в условных единицах интенсивности зеленой флуоресценции комплексов ДНК-АО
микроба индуцировать изменения в лейкоцитах крови и перитонеального экссудата по показателям ИКФЛ, ИЗФХ и КВ наглядно иллюстрируют цитограммы, представленные нами на рисунке. Результаты расчета показателей ИЗФХ и КВ представлены в табл. 2. Активацию ядерного хроматина лейкоцитов крови вызывали у мышей через сутки после введения оба исследуемого препарата капсульного антигена. Об этом свидетельствовало достоверное повышение значений показателей КВ и ИЗФХ (в 2 раза относительно контроля Р <0,001). Однако только в ответ на препарат, полученный из агаровой культуры (Ф1А), регистрировали выраженные изменения по данному показателю не только в крови, но и перитонеальном экссудате. Препарат, полученный из бульонной культуры чумного микроба (Ф1Б), не активировал хроматина клеток перитонеального экссудата. Он оказывал более интенсивное воздействие на состояние лизосомального аппарата лейкоцитов, вызывая увеличение относительного количества клеток с высоким содержанием лизосо-мальных гранул в крови, сопутствующее достоверному снижению доли лизосомосодержащих клеток в брюшной полости (показатель ИКФЛ) именно у мышей, иммунизированных Ф1Б.
Проявление активности иммунной системы в ответ на введение в организм мышей антигена Ф1
неизменно сопровождается усилением пролиферативной активности лейкоцитов, а также изменением соотношения различных типов этих клеток в крови и органах иммунной системы. Процессы, связанные со считыванием генетической информации, изменяют активность хроматина иммунокомпетентных клеток, а повышение активности хроматина приводит к увеличению уровня адсорбции красителя акридинового оранжевого (АО) на молекуле ДНК. Как следствие, для активированных клеток характерна повышенная интенсивность зеленой флуоресценции комплексов АО-ДНК, по которой они могут быть идентифицированы и посчитаны в гетерогенной лейкоцитарной популяции методом проточной ци-тофлуориметрии [5].
Углеводсодержащий препарат капсульного антигена, полученный из микробных клеток, выращенных на агаровой среде Ф1А, оказывал более интенсивное воздействие на метаболизм клеток иммунофагоцитарной системы по сравнению с Ф1Б. Он вызывал интенсивную реакцию ядерного хроматина не только лейкоцитов крови, но и клеток перитонеального экссудата (макрофагов), что согласуется с литературными данными о более высокой протек-тивной активности Ф1А для белых мышей и о его способности активировать метаболизм мышиных макрофагов [2, 4]. Миграция макрофагов с высоким содержанием лизосомальных гранул из брюшной полости в кровь мышей, иммунизированных препаратом Ф1Б, свидетельствует, вероятно, о более эффективном расщеплении данного препарата лизо-сомальными ферментами фагоцитов. Видимо, по этой причине антиген Ф1Б не обладал способностью активировать хроматин клеток брюшного экссудата и, как следствие, имел более низкую имму-ногенность. Полученные экспериментальные данные подтверждают выводы ранее выполненных ци-тофлуориметрических исследований [5], что степень активации хроматина иммунокомпетентных клеток может служить показателем интенсивности процесса иммунологической перестройки в организме, коррелирующей с уровнем протективности исследуемого антигена или вакцинного препарата.
Таким образом, проведенный впервые с помощью метода проточной цитофлуориметрии сравнительный анализ двух разных по химическому составу препаратов капсульного антигена чумного микроба свидетельствует о том, что степень активации хроматина иммунокомпетентных клеток может служить показателем интенсивности процесса имму-
Реактивность ядерного хроматина лейкоцитов крови и клеток перитонеального экссудата у мышей на 1-е сутки после иммунизации препаратами ФІА и ФІБ
Таблица 2
Исследуемый материал Клетки с активированным хроматином (показатель ИЗФХ, %) Неоднородность популяции по состоянию хроматина (КВ, %)
до иммунизации (контроль) после иммунизации до иммунизации (контроль) после иммунизации
ФІА | ФІБ ФІА ФІБ
Лейкоциты крови 9,6 ± 1,4
Клетки перитон. экссудата 24,8 ± 0,8
21,2 ± 1,7 (р< 0,001) 52,0 ± 2,7 (р< 0,001)
18,9 ± 2,2 (р< 0,01) 18,2 ± 0,8 (р< 0,001)
15,8 ± 0,1 24,1 ± 0,9
18,3 ± 0,2 (р<0,001) 35,1 ± 2,9 (р<0,001)
24,4 ± 0,4 (р< 0,001) 22,7 ± 1,7 (р>0,05)
Примечание. Представлены данные о достоверных различиях (р) в сравнении с контролем до иммунизации. Препарат ФІА оказывает более интенсивное воздействие на состояние ядерного хроматина клеток перитонеального экссудата.
нологической перестройки в организме привитых мышей, коррелирующей с уровнем протективности антигена.
Методика импульсной проточной цитометрии отличается информативностью, достоверностью и высокой производительностью. Для отдельного анализа требуется не более 0,1 мл цельной крови, выделенной от каждого лабораторного животного, и не более 10 мин времени. Исследование достаточного числа клеток перитонеального экссудата (макрофагов) не требует создания асептического воспаления, изменяющего исходный клеточный состав (соотношение лимфоцитов и макрофагов) в брюшной полости лабораторных животных и увеличивающего сроки сравнительного анализа. При этом используется только раствор относительно недорогого красителя акридинового оранжевого.
В целом сравнительная оценка биологической активности препаратов капсульного антигена с использованием метода проточной цитофлуориметрии открывает, на наш взгляд, новые возможности для определения их качества и стандартизации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дальвадянц С.М., Дятлов И.А., Еремин С.А., Кутырев В.В. // Пробл. особо опасных инф. - 2003. - Вып. 85. - С. 127-136. - 2. Ермакова Г.В., Тараненко Т.М., Наумов А.В. и др. //. Микробиол., биохим. и специфич. про-филакт. карантин. инф. - Саратов, 1990. - С. 84-89. -3. Киреев М.Н., Тараненко Т.М., Веренков М.С. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 2001. - Вып. 1 (81). - С. 114119. - 4. Кирилличева Г.Б., Наумов А.В., Стукова Н.Ю. и др. // Бюл. эксп. биол. и мед. - 1993. - № 5. - С. 494497. - 5. Кравцов А.Л. Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогенных популяций бактерий Y. pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных. Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Саратов. -1997. - 57 с. - 6. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. - Саратов. - 1992. - 172 с. -7. Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В.Нау-мова, Л.В.Самойловой. - Саратов, 1992. - 218 с. - 8. Сердо-бинцев Л. Н. , Тараненко Т. М. , Веренков М. С. , Наумов А.В. // Вопр. профилакт. природно-очаговых инф. -
Саратов, 1983. - С. 37-41. - 9. Сероглазов В.В., Дальвадянц ^M., Вейнблат В.И. и др. // Пробл. биотехнол., микробиол. и иммунол. особо опасных инф. - Саратов, 1984. -С. 31-34. - І0. Щуковская ^Н., Назарова Л.С., Tара-ненко T.M. // Пробл. особо опасных инф. - 1999. - Вып. 79. -С. 131-13?. - ІІ. Abrams W.R., Dramond L.W., Kane A.B. // J. Histochem. and Cytochem. - 1983. - Vol. 31, N б. - P. 737-744. - І2. Baker E.E., Sommer H.L., Foster L.B. et al. // J. Immunol. - 1952. - Vol. б8, N 2. - P. 131-145. -ІЗ. Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F., Kamensky L.A. // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22, N 1. - P. 526-53G. - І4. Perry R.D., Fetherston J.D. // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 1G, N 1. - P. 35-бб. - І5. Shields R., Burnett W. // Anal. Chem. - 196G. - Vol. 32, N 7. - P. 885-88б.
M.N.Kireev, A.L.Kravtsov, T.M.Taranenko, T.A.Chramchenkova, S.I.Klyueva, N.P.Gooseva, T.P.Shmelkova
Comparative Evaluation of the Degree of Activation of Immunophagocytic System Cells in Mice Immunized with Different Preparations of the Plague Agent Capsular Antigen, by Means of the Flow Cytometry
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
The degree of activation of immunophagocytic system cells in white mice immunized with different preparations of the plague agent capsular antigen F1 was evaluated by means of the flow cytometry. Comparison of the effect of two finely purified serologically identical antigenic F1 preparations differing in their chemical content isolated from Y. pestis vaccine strain EV NIIEG, carbohydrate-containing protein F1A and pure protein F1B was carried out. Cytometric analysis showed that F1A preparation isolated from the agar culture had more pronounced effect on the metabolism of immuno-phagocytic system cells than that of F1B isolated from the broth culture, and caused intensive activation of the nucleus chromatin not only of the blood leucocytes, but the peritoneal exudate macrophages as well, this activation being the index of the immunological reorganization of the organism correlating with the antigen protectivity level. The obtained cytometric characteristics of the immunobiological properties of the plague agent capsular antigen F1 would be useful when choosing the most effective preparation to become the component of plague chemical vaccine.
Key words: immunophagocytic system cells, Yersinia pestis capsular antigen F1, flow cytometric studies, immunochemical and immunobiological properties.
nocTynn^a 05.03.07.
УДК 616.981.452:576.895.2
Т.А.Малюкова, Е.М.Г оловко, Т.А.Костюкова, С.А.Щербакова, Е.А.Плотникова, М.Н.Ляпин
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА, ОТОБРАННОГО В СОПРЯЖЕННЫХ ОЧАГАХ ЧУМЫ И АРБОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, К ПРОВЕДЕНИЮ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.
Сообщение 1
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Предложен способ обработки взвесей вакцинного штамма чумного микроба p-пропиолактоном (БПЛ). Показано, что БПЛ оказывает обеззараживающее действие при температуре 4 °С в конечных концентрациях 0,1 % при экспозиции 6 и более часов и 0,05 % при экспозиции не менее 24 ч. В ходе изучения влияния способа обеззараживания материала на чувствительность и специфичность ИФА продемонстрировано, что обработка бактериальных образцов БПЛ не снижает названные показатели, т.е. не отражается на качестве иммунологического анализа.
Ключевые слова: Yersinia pestis, арбовирусы, обеззараживание, Р-пропиолактон, ИФА.
С начала 90-х годов прошлого века отмечается ных инфекций как в мире, так и на территории Рос-активизация природных очагов чумы и арбовирус- сии. К этому времени в нашей стране наиболее
б4
